Высокое разрешение Комплекс Профилирование криосликинг BN-MS Анализ

Summary

Для профилирования сложных комплексов высокого разрешения представлен универсальный криосликный протокол BN-MS с использованием микротома.

Abstract

Белки обычно оказывают биологические функции через взаимодействие с другими белками, либо в динамических протеиновых сборок или как часть стабилизированных комплексов. Последний может быть элегантно решен в соответствии с молекулярным размером с помощью родного полиакриламидного геля электрофорусис (BN-PAGE). Соединение таких разделений с чувствительной масс-спектрометрией (BN-MS) было хорошо налажено и теоретически позволяет провести исчерпывающую оценку извлекаемого комплекса в биологических образцах. Однако этот подход является довольно трудоемким и обеспечивает ограниченное разрешение и чувствительность сложного размера. Кроме того, его применение остается ограниченным обильным митохондриальными и пластидными белками. Таким образом, для большинства белков информация об интеграции в стабильные белковые комплексы по-прежнему отсутствует. Здесь представлен оптимизированный подход к профилированию сложных материалов, включающий разделение BN-PAGE, субмиллиметровую выборку широких гелевых полос с помощью криомикротомного нарезки и масс-спектрометрического анализа с количественной оценкой белка без этикетки. Процедуры и инструменты для критических шагов подробно описаны. Как применение, отчет описывает complexome анализ solubilized эндосомной-обогащенной фракции мембраны от почек мыши, с 2.545 протеином профилированным в итог. Результаты демонстрируют идентификацию однородных, низкообилирающих мембранных белков, таких как внутриклеточные ионные каналы, а также высокое разрешение, сложные модели сборки белка, включая изоформы гликозилации. Результаты согласуются с независимым и биохимическим анализом. Таким образом, эта методология позволяет комплексно и беспристрастно выявлять белковые (супер) комплексы и их состав субъединиц, обеспечивая основу для исследования стоихиометрии, сборки и взаимодействия динамики белковых комплексов в любом биологической системы.

Introduction

Разделение BN-PAGE было впервые непосредственно связано с анализом LC-MS (BN-MS) исследовательскими группами Majeran¹ и Wessels^2, использующими ручную нарезку гелевых дорожек BN-PAGE. Их анализы выявили ряд обильных мембранных белковых комплексов с известным составом субунитов из растительных пластидов и митохондрий HEK, соответственно. Однако эти анализы были далеко не всеобъемлющими и не позволяли объективно идентифицировать новые ассамблеи. С тех пор значительно повысилась производительность масс-спектрометров и методов количественной оценки без маркировки, что позволило провести всесторонний анализ БН-МС. Это придумал термин "комплекс ногония профилирования". Например, Хайде и его коллеги проанализировали митохондрии сердца крыс, идентифицируя и группируя 464 митохондриальных белка, тем самым подтверждая многие известные сборки. Кроме того, они обнаружили, TMEM126B быть новым и важным подразделением конкретного сборочного комплекса³. Сопоставимые результаты (с 437 митохондриальными профилями белка) были получены в параллельном исследовании гек-клеточной митохондрии⁴.

Несмотря на эти улучшения, по-прежнему остается ряд вопросов, которые сдерживают весь потенциал БН-МС для комплексного профилирования. Основным ограничением является эффективное разрешение размера комплексов, которое определяется двумя факторами: (i) качеством разделения BN-PAGE, которое зависит от однородности градиента гелевой матрицы, а также стабильности/растворимости выборочных комплексов, и ii) размер шага изолова геля, который в лучшем случае 1 мм при использовании обычной ручной нарезки^5,6. Плохое разрешение размера не только пропускает тонкие сложные изоформы и неоднородности, но и негативно влияет на динамический диапазон и уверенность в беспристрастном, де Ново субъединении назначения и количественной оценки.

Другие проблемы включают точность количественной оценки белка и охват фактического динамического диапазона изобилия белка в образце с помощью масс-спектрометрического анализа. Таким образом, применение профилирования bn-MS complexome остается в значительной степени ограниченным биологическими образцами с более низкой сложностью, высокой экспрессией целевых комплексов и благоприятными свойствами растворификации (т.е. пластидов, митохондрий и микроорганизмы)^6,7,8,9,10.

Недавно мы представили криомикротом нарезки при содействии BN-MS (csBN-MS), который сочетает в себе точный суб-миллиметровый выборки BN-PAGE гелевые полосы с всеобъемлющим анализом MS и разработки MS обработки данных для определения белковых профилей с высоким уверенность¹¹. Применение препарата митохондриальной мембраны из мозгов крыс продемонстрировало ранее неудовлетворенное эффективное разрешение сложного размера и максимальное покрытие окислительного респираторного цепного комплекса (OXPHOS) (т.е. 90 из 90 MS-доступных). Этот пример также определил ряд новых белковых сборок.

Описаны здесь оптимизированные процедуры для предварительного масштабирования BN-PAGE разделения белковых комплексов (не ограничивается конкретным биологическим источником), литье больших подготовительные гели BN-PAGE, криомикротомна нарезки широких гелевых полос, и MS данных Обработки. Производительность профилирования с высоким разрешением продемонстрирована для подготовки белкового комплекса из обогащенных мембранами почек мыши эндосомного. Наконец, обсуждаются преимущества повышения разрешения и точности масс-спектрометрической количественной оценки.

Protocol

1. Предварительная подготовка BN-PAGE

1. Подготовка геля
   1. Используйте систему вертикального геля среднего и большого формата (зgt;10 см, расстояние разделения геля; 14 см х 11 см, 1,5 мм прокладка) с эффективным охлаждающим набором до 10 градусов по Цельсию.
   2. Литые линейные или гиперболические поры градиент гель (1,5-3,0 мм прокладки) с помощью перемешивания двухкамерный градиент смеситель управляется насосом (см. Таблица материалов и реагентов). В представленном примере (линейный градиентный гель 1%-13%):
      1. Подготовьте раствор 13 мл для передней (смешивающей) камеры, состоящей из: 13% акриламида (от 30% стокового раствора, 37,5:1.0 акриламида:бисакриламида), 0,75 М аминокапроивной кислоты, 50 мм Бис-Трис (pH 7,0) и 10% глицерола.
      2. Приготовьте раствор объемом 10 мл для резервуарной камеры, состоящей из: 1% акриламида (от 30% стокового раствора, 37,5:1.0 акриламида:бисакриламида), 0,75 М аминокапроиновой кислоты, 50 мМ Бис-Трис (рН 7,0) и 0,2% cl-47 моющего средства.
   3. Запустите усилитель и добавьте 30 микролитров APS (аммоний peroxodisulfate, 10% бульонный раствор) и 2,5 л TEMED (N,N,N',N',N'-tetramethyl этиленедиамин) и 2,5 микролитра TEMED к раствору в передней камере. Запустите насос и откройте передний клапан (поток должен быть скорректирован для завершения литья в 10 минут). После 1 мин добавить 90 л APS и 5 Зл TEMED к раствору в камере резервуара и открыть камерное соединение.
   4. Разрешить гель полимеризировать медленно, но тщательно, по крайней мере 24 ч при комнатной температуре (RT) для создания однородных пор размер градиента. При влажности полимеризованный гель можно хранить в вертикальном положении при 4 градусах Цельсия в течение 1 недели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Намеренно, в верхней части геля будет иметь мягкую / сливую консистенцию. Это позже будет удалено, но позволяет плавно поступления белков в гель, с минимальным риском осадков белка, которые в противном случае могут привести к миграции артефактов (т.е. полос или белка осадков).
2. Подготовка и загрузка образцов
   1. Подготовьте слоты для загрузки, вставив соответствующие прокладки (например, кремниевые трубки) между стеклянными пластинами для разделения 0,5-2,0 мг белка. Слоты должны быть сделаны не менее 3 см в ширину (или лучше, 5-6 см в ширину).
   2. Растворить 2,5 мг мембраны (мышечная почка эндосомы обогащенный препарат) в 2 мл буфера растворителя, содержащего 1% (w/v) неденатурного моющего средства (ComplexioLyte CL-47) в течение 30 мин на льду. Ультрацентрифугат (отсечение отложений - 200 S или меньше; 130 000 х г/11 мин используется здесь).
   3. Сконцентрируйте solubilisate на коротких 50%/20% (w/v, 0.3 мл каждый) градиент шага сахарозы ультрацентррифеемированием для 1 h при 400,000 x g. Окончательный выход белка должен быть не менее 1 мг.
   4. Добавьте 0,05% (w/v) Coomassie G-250 к solubilisate и загрузите образец на гель. Ограничьте нагрузку белка до 10-15 мкг/мм² поперечного сечения геля, чтобы получить высокое разрешение и избежать артефактов, возникающих в результате протеинового протеина.
3. Условия работы BN-PAGE
   1. Для запуска буферов подготовьте стандартный катодный буфер, состоящий из 50 мм трицина, 15 мМ Бис-Трис и 0,01% Coomassie G-250. Подготовьте стандартный анодный буфер, состоящий из 50 мм Бис-Трис (рН 7,0).
   2. Запустите preparative BN-PAGE на 10 градусов по Цельсию ночь с помощью трехступенчатого протокола напряжения^13, состоящий из: уравновешение фазы 30 мин при 100 В, то медленный (3 ч) пандус для максимального напряжения (40-50 V /cm длина геля), который, наконец, поддерживается, по крайней мере 6 ч для конечная фокусировка белков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется приостановить электрофорус, когда миграционный фронт достиг середины геля и обменять катодный буфер на свежий буфер без Coomassie G250. Это помогает избежать осадков артефактов в гель в результате локального коллапса структуры матричных пор.

2. Отбор проб геля и пищеварение

1. Иссечение гелевых дорожек
   1. После запуска, сканировать гели для документации целей, сохраняя его между стеклянными пластинами.
   2. Разобрать пластины и акцизов полосы раздел (ы) интерес.
   3. Возьмите образец полосы для анализа 2D BN/SDS-PAGE и белка окрашивания или западного blotting (как показано на рисунке 1B),чтобы определить регионы, представляющие интерес, эффективное разрешение сложного размера, и белка изобилие.
   4. Исправить выбранные гелевые дорожки дважды, по крайней мере 30 мин с 30% (v/v) этанола и 15% (v/v) уксусной кислоты.
   5. Перенесите образец в среду для встраивания и дайте ему замочить и уравновесить, по крайней мере, 2 ч при 4 градусах Цельсия, сохраняя при этом гелевую плиту в замедленном движении на орбитальном шейкере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разделение геля должно быть тщательно проверено на общее качество разделения и артефакты миграции. Гель-полосы, представляющие доминирующие белки, должны быть без искажения и однородными по интенсивности. Местные артефакты на геле должны быть вырезаны или исключены из анализа.
2. Встраивание и нарезка криомикротома
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это улучшенная версия процедуры встраивания описаны и фото-документированных ранее, что позволяет вставлять и нарезки более широких полос геля до 8 см¹¹.
   1. Во-первых, вырезать фиксированные гелевые полосы на секции (здесь, 3 см) точно параллельно с белковой миграции передней / полосы картины. Для облегчения обработки поместите каждый раздел на пластиковую пленку поддержки с равными размерами.
   2. Перенесите полосы в открытую трубку с пробками (закрытые на дне, централизованно перфорированные сверху, как точно выровненные с верхним, так и нижним концами гелевого сечения).
   3. Опустите цилиндр кратко в жидкий азот, чтобы быстро инициировать затвердевание. Прозрачная среда встраивания затвердевает в течение нескольких секунд и становится белого цвета.
   4. Заполните полость встраивающей средой, ненадолго окуните ее в жидкий азот и заморозьте цилиндр при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Охлаждение цилиндра быстро, окунув его в жидкий азот помогает избежать смещения гелевой плиты в трубе. Следует избегать искажений, чтобы обеспечить высокое разрешение в следующем анализе MS.
   5. После разборки снимите пластиковую пленку и перенесите блок со встроенным гелем на охлажденный, больший по диаметру, металлический цилиндр, размещенный на плоской опоре (т.е. чашку Петри) и запечатанный встраивающимся средством на внешней стороне цилиндра. Заполните цилиндр встраивающей средой и тщательно заморозьте.
   6. Повторите эту процедуру с другой стороны цилиндра, чтобы получить твердый блок с копланарными поверхностями.
   7. Снимите блок с цилиндра, приклейте его встраивающей средой на предварительно охлажденный металлический держатель и вставьте держатель в криосликную машину (криотом). Поверхность блока должна быть тщательно выровнена по отношению к плоскости нарезки. Дайте ему уравновесить при оптимальной температуре для процесса нарезки (здесь -15 градусов по Цельсию).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте медленно прогрессирующий цикл ручной нарезки размером 0,1 мм до попадания на поверхность встроенного геля, чтобы обеспечить правильное позиционирование.
   8. Урожай гель ломтиками один за другим, с окончательной желаемой толщиной 0,25 мм размер шага, и передать их индивидуально реакционные трубки с низкими свойствами связывания белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этой настройке, равномерное гелевого ломтика можно легко получить тонким, как 0,1 мм и толщиной до 0,5 мм.
3. Триптическое пищеварение
   1. Выполните в гель триптическое пищеварение после обширной стирки ломтиков геля (по крайней мере три дополнительных раунда стирки рекомендуется удалить полимерные компоненты встраивающей среды) после стандартной процедуры¹¹.
   2. Вакуумно-сухие элетированные пептиды и растворяются в 0,5% (v/v) трифтороацетической кислоты, встряхивая при 37 градусах По Цельсия (10 мин), а затем звукование ванны (5 мин) и краткая центрифугация.

3. Масс-спектрометрия

1. настройка nanoHPLC и MS
   1. Нагрузка переваренных образцов на преколонну C18 (размер частицы 5 мкм; диаметр 300 мкм) с 0,05% (v/v) трифторацетической кислотой с помощью (без сплита) нано-HPLC в сочетании с масс-спектрометром с высоким разрешением.
   2. Elute захватили пептиды с aqueous-органический градиент (eluent A): 5 мин 3% B, 120 мин от 3% B до 30% B, 20 мин от 30% B до 99% B, 5 мин 99% B, 5 мин от 99% B до 3% B, 15 мин 3% B (скорость потока 300 nl/ min).
      ПРИМЕЧАНИЕ: csBN-MS гель ломтики обычно приводят к образцам с низким и промежуточным пептидным изобилием и ограниченной степенью сложности. Поэтому анализ nanoLC-MS/MS должен выполняться с настройкой, обеспечивающей разумную чувствительность и скорость секвенирования, высокое разрешение массы (100 000 евро) и максимальный динамический диапазон (эффективно 3-4 порядка величины). Однако он не требует длинных размеров столбцов или градиентов элунита, вытянутых за пределы 3 ч.
   3. Отдельные электоры пептиды в излучателе (т.д. 75 мкм; наконечник - 8 мкм) вручную упакованы примерно на 20 см с материалом C18 (размер частиц - 3 мкм). Электроспрейте образцы при 2,3 кВ (положительный ионный режим) в нагретый капилляр передачи (250 градусов по Цельсию) масс-спектрометра.
   4. Выполните анализ со следующими настройками инструмента¹¹: максимальное время впрыска MS/MS 400 мс; длительность исключения - 60 с; минимальный порог сигнала - 5000 пунктов, 10 лучших прекурсоров фрагментированы; ширина изоляции 1,0 м/з).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения калибровки массы, времени хранения и назначения пептидных сигналов в большом количестве наборов данных или измерений рекомендуется выполнять соответствующие серии измерений MS без перерывов или изменений параметров и оборудования ( т.е. на той же колонке C18/излучателе).
2. Идентификация белка (MS данные оцениваются как описано ранее¹¹)
   1. Извлекайте пиковые списки из фрагментных ионных спектров с помощью инструмента "msconvert.exe" (часть ProteoWizard).
   2. Сдвиг все значения прекурсора м /з для каждого набора данных на медианный м /z смещение всех пептидов, назначенных белкам, в предварительном поиске базы данных с толерантностью к пептидной массе 50 промилле.
   3. Поиск исправленных пиковых списков с подходящей поисковой системой (здесь, талисман 2.6.2) против всех записей мыши в базе данных UniProtKB/Swiss-Prot (выпуск 2018-11).
   4. Выберите "Ацетил (Протеин N-термин)", "Карбамидоэтил (C)", "Глн пиро-глю (N-термин К), Глю пиро-глю (N-термин E)", "Окисление (M)" и "Пропионамид (C)" в качестве переменных модификаций.
   5. Установите пептид и резкую массу до 5 ppm и 0.8 Da, соответственно, и позвольте одному пропущенного триптичного расщепления. Установите ожидаемое значение отсечения для идентификации пептида до 0,5 или менее. Используйте поиск базы данных приманки для определения ложноположительного уровня обнаружения (FDR). Установите FDR до 1% или применить дополнительные критерии качества для обеспечения надежной идентификации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный эксперимент выявил более 3500 белков, со средним пептид ФДР 4,4 и 0,77% (n no 101 срез образца), или 3000 белков, когда пептид ФДР был установлен на 1%. Важно отметить, что для отбора профилированных белков были использованы более строгие критерии (2 568). Она включала в себя все белки, которые были определены по крайней мере с двумя пептидами, по крайней мере один из них белка конкретных, по крайней мере в одном из 101 среза образцов.
3. Количественная количественная оценка белка
   1. Используйте интенсивность пептидного сигнала (пиковые объемы (PVs) для количественной оценки белка, которые получены из FT полного сканирования и правильного для хранения времени и массовых сдвигов с помощью соответствующего программного обеспечения (здесь, Maxquant v1.6.3).
   2. Выравнивание наборов данных MS один за одним для ссылки (общее среднее) время элюции пептида с помощью регрессии LOESS. Присваивай П.в. пептиды либо непосредственно (MS/MS-идентификация) или косвенно (т.е., на основе их соответствия м /z и времени elution в пределах очень узких допусков).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует программное обеспечение для назначения "вставленных" термин пептидов. Набор параметров приводит к эффективному м/з и времени elution, сопрягая допуски в размере 2 промилле и 1 мин, соответственно (см. рисунок 2A,B).
   3. Правильно для систематических run-to-run изменений в пептидной нагрузке и эффективности ионизации путем rescaling интенсивности пептида вычисляя от медианных разниц относительных интенсивностей пептида между соседними образцами ломтика (рисунок 2C).
   4. Фильтр PV данных для выбросов и оставшихся ложноположительных назначений, определенных внутренним анализом согласованности PV.
   5. Нормализация PVs каждого пептида до их максимальных значений по всем наборам данных среза, что дает относительные профили изобилия пептида.
   6. Наконец, вычислить относительные профили изобилия белка, как средние по крайней мере два (и до шести или 50%, в зависимости от значения больше) из лучших коррелирующих пептидных профилей в течение окна из трех последовательных ломтиков. Это позволяет преодолеть недостающие значения pV и снизить уровень шума.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это, наконец, привело к 2545 (из 2568 предварительно отобранных) белковых профилей(рисунок 2D).
4. Характеристика белковых комплексов
   1. Анализ ировать профили белков путем первого выполнения пикового обнаружения с помощью локального метода максимы, и последовательно приспосабливать нормальные распределения к этим пикам, уступая положение (т.е. индекс срезили или очевидный сложный размер) их максимы и FWHM (полная ширина на полумаксимальная интенсивность) значения (вставки рисунка 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В наборе данных профили анализируются автоматически с помощью пользовательских скриптов. Наименьшие значения FWHM свидетельствуют об эффективном разрешении размера подхода (здесь, 6 х 0,25 и 1,5 мм).
   2. Используйте эталонные белковые предельные пики с определенной молекулярной массой (как сообщается в базе данных UniProtKB/Swiss-Prot) для линейного регрессионного анализа значений log10 (прогнозируемой молекулярной массы) для преобразования индексов числа срезов в очевидные молекулярные размеры (т.е., очевидного сложного размера в kDa).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 23 маркерных комплекса в образце были отобраны в этом исследовании(Рисунок 4) на основе (i) монодисперсных форм пиков профиля, (ii) экспериментальной поддержки молекулярных весов и (iii) распределения вдоль исследуемых секций геля BN-PAGE.

Results

Подавляющее большинство обычных исследований BN-MS, а также недавно созданный подход csBN-MS с высоким разрешением были применены к митохондриальным и пластидальным препаратам, которые (i) легко доступны, (ii) имеют ограниченную сложность и (iii) экспресс целевые (мембранные) белковые комплексы при высокой плотности. Этот протокол расширяет применение комплексного профилирования с высоким разрешением на немитохондриальные мембраны, выражающие низкообильные белки, о которых имеется мало информации об их интеграции в комплексы. Для демонстрационных целей мы выбрали обогащенный эндосомой мембранный препарат из мышиной почки, полученный при центрифуге градиента плотности.

Оптимизация этого препарата была направлена на маркер белка TPC1, который образует внутриклеточные ионные каналы преимущественно локализованы на ранних и рециркуляции эндосомы¹². Он также высоко выражен в почечных проксимальных трубчатых клеток, как показано на иммуногистохимический анализ секций почек(рисунок 1A). Эти мембраны были мягко растворимы (ComplexioLyte 47 при низком соотношении белка:моющее средство 1:8) и сосредоточены на сахарозной подушке путем ультрацентрифугирования. Последний оказался важным шагом для удаления избыточных компонентов молекулярного веса (т.е. моющих средств, липидов, солей, органических полимеров и метаболитов), которые, как правило, негативно влияют на разрешение подготовительных сечения БН-ПАГЕ.

Комплексное разделение на родном 1%-13% (w/v) полиакриламид градиентного геля(рисунок 1B, средняя панель) показали сильно окрашенные белковые полосы с очень небольшим количеством артефактов миграции. SDS-PAGE разделение узкой полосы поля BN-PAGE(рисунок 1B, рамка в коробке в красном цвете) в качестве второго измерения, а затем западный анализ помот показал хорошо разрешенную модель различных TPC1 связанных комплексных популяций (Рисунок 1B , верхняя панель, отмеченная красными стрелками), скорее всего, в результате ассоциации с дополнительными белковыми субъединицами и/или постпереводными модификациями (такими как гликозилация¹²). 3 см раздел процентов был вырезан, фиксированной и обработаны для криомикротомна нарезки, как описано¹¹. Отдельные этапы этой процедуры (в частности, точное выравнивание широкого гелевого сечения), которое имеет решающее значение для сохранения разрешения во время отбора проб, задокументированы в сопроводительном видео. Встроенный гель раздел был, наконец, нарезать 101 гель ломтиками с равномерной толщиной 0,25 мм(рисунок 1B, нижняя панель), которые были отдельно перевариваются и проанализированы высокой производительности LC-связанных масс-спектрометрии.

В дополнение к разрешению размера, качество количественной оценки белка является ключевым для успешного профилирования комплекса. При настройке MS и настройках, используемых, анализ образцов был довольно всеобъемлющим, в результате чего средняя идентификация более 1000 белков и 10000 пептидов (8200 из которых были белковых) на ломтик, и около 3000 белков и 43000 пептиды (38 500 из которых были белковыми) в общей сложности. Тем не менее, из-за стохасического характера последовательности MS/MS, зависящих от данных, и его ограничений в динамическом диапазоне, информация об интенсивности по-прежнему была фрагментарной для менее обильных белков. Таким образом, была проведена сложная процедура обработки данных MS^11,основанная на точном назначении пептидных сигналов (пиковые объемы (PVs) - пептидная интенсивность сигнала, интегрированная через м/з и время) на протяжении всей серии наборов данных.

Как показано на рисунке 2A,B, отклонения пептидных сигналов в массе и времени удержания, которые остались после калибровки были идентичны для MS-последовательности и косвенно назначенных П.(с очень узкими допусками злт;1 промилле и lt;0.5 мин для 95% П.), свидетельствует об очень низкой ставке для ложно-положительного назначения. Оставшиеся выбросы были отфильтрочены на основе их согласованности с другими связанными. Поскольку все измерения MS проводились последовательно на одной и той же настройке LC-MS без изменений параметров или аппаратных компонентов, вариации запуска (определяется как медиана всех интенсивностей. в образце по сравнению с соседними срезами) были небольшими и легко устранить путем масштабирования наборов данных. (Рисунок 2C). Полученная информация об интенсивности пептида была затем использована для реконструкции 2545 профилей относительного изобилия белка. Как показано на рисунке 2D, более 75% этих белковых профилей были основаны по крайней мере на трех независимых белковых пептидов.

Далее в протоколе оценивалась значимость размера гелевого пробы BN-PAGE для разрешения белковых комплексов. Для этого наборы данных срезов были объединены путем подведения итогов информации о pV с двух, трех или четырех последовательных срезов, таким образом имитируя результат для размеров ступеней 0,5 мм, 0,75 мм и 1 мм (по сравнению с первоначальной выборкой 0,25 мм). На рисунке 3 показано полученное содержание профилей для белка TPC1 в качестве примера (A-D). При 0,25 мм относительная интенсивность и разделение размеров связанных с TPC1 комплексных популяций(рисунок 3А)были приятно согласующимися с результатами анализа западной помок(рисунок 1B,верхняя панель); хотя, профиль показал некоторый шум, главным образом в результате пропавше значений («пробелов») в матрице Фотоснимка, используемой для количественной оценки.

Присоединение двух ломтиков, соответствующих 0,5 мм, поддерживало правильную интенсивность и разделение связанных с TPC1 комплексов и устранялось количественный шум(рисунок 3В). В отличие от этого, большие размеры ступеней 0,75 мм и 1 мм(рисунок 3C,D) привели к потере размера резолюции и отменилдискриминацию TPC1 сложных субпопуляций. Следует отметить, что подавляющее большинство опубликованных обычных анализов BN-MS использовать вручную сократить 2 мм ломтиками (около 60, чтобы покрыть весь гель переулок)^7,8,9,10.

Преобразование миграционного расстояния или индекса среза в молекулярный размер, как правило, основано на маркерах, либо коммерчески доступных местных стандартных белках, либо хорошо охарактеризованных эндогенных белковых комплексах с известным составом субъединиц (в основном «супер» комплексы митохондриальной окислительной дыхательной цепи «OXPHOS»)¹³. Однако, поскольку разделение BN-PAGE основано на эффективном молекулярном сечении, которое определяется не только молекулярной массой, но и 3D-структурой и числом связанных липидов, моющих средств и молекул Coomassie, отдельные белки могут показать большие отклонения. Поэтому было выбрано использовать более крупные наборы белковых комплексов в качестве маркеров^11. Сюжет на рисунке 4 показывает 23 выбранных маркера с репрезентативной субединицей, показанной как черный круг, что указывает на значения log10 его прогнозируемой молекулярной массы (согласно базе данных UniProtKB/Swiss-Prot) против. индекс среза соответствующего максимума пика профиля. Последние были получены из автоматизированных гауссианских припадков к данным об относительном изобилии, как показано в вшивке рисунка 4, показывающего пример с сопровождающим BCS1. Линейная регрессия (красная линия) предусматривала преобразование значений индекса среза в видимые молекулярные размеры, которые варьировались от 160-630 кДА вдоль исследуемого геля.

Наконец, анализ предоставил информацию о хорошо охарактеризованных комплексах и продемонстрировал существование новых подразделений и сложных собраний. Примеры, выделяющие различные аспекты комплекса, приведены на рисунке 5 (A-C: белки, выраженные или предпочтительно расположенные в эндосомальных отсеках; D-F: комплексы из других субклеточных локализаций). Известно, что железотранспортируящий протеин ферритин образует комплексы из 24 световых (FRIL1) и/или тяжелых (FRIH) субъединиц, с общим молекулярным весом 440 kDa¹⁴ (Рисунок 5A, заполненная стрелка). Профили подразделения(рисунок 5А)предполагают существование по крайней мере двух меньших форм комплекса (с очевидной массой 360 кДа и 340 кДа; открытые стрелки) с отчетливыми тяжелыми/световыми цепями стойометри (лучше видимые после перепрофилирования изобилия, всетр ячменя Рисунок 5А),которые обильно присутствуют в эндосоме.

В отличие от этого, комплексы nicalin-nomo1¹⁵ (рисунок 5D),гамма-секретазный основной комплекс¹⁶ (рисунок 5B),а также механизм GPI-transamidase¹⁷ (рисунок 5E) показывают фиксированные коэффициенты изобилия их основных субъединиц над всем диапазоном размера и независимо от ассоциации с дополнительными протеином. Это означает, что их подразделения являются исключительными друг для друга. ВакуолярH-ATPases - это многобелковые комплексы, собранные из пула из более чем 20 подразделений модульным образом с общим молекулярным весом около 900 кДА. На рисунке 5C показаны подкомплексы с различными составами по крайней мере 17 субъединиц, представляющих биологические (дис)агрегатные промежуточные или подкомплексы, порожденные экспериментальными условиями, некоторые из которых также были наблюдается в недавнем исследовании BN-MS¹⁸. Другой многобелковый комплексный пример – протеасомы¹⁹ (рисунок 5F). Тщательный осмотр профилей изобилия альфа- и бета-подразделений, образующих ядро протеасомы 20S, предполагает две основные сложные популяции с тонкими различиями в размерах (590 kDa и 575 kDa, указанные серыми стрелками) и интеграцией трех бета-подразделений.

Таким образом, CSBN-MS complexome профилирования эндосомного обогащения почек мембраны обеспечивают всеобъемлющие и подробные результаты в отношении i) интеграции единообразных, с низким содержанием целевых белков в комплексы, ii) общий комплексный состав субъединиц и стоихиометрия и (iii) сложные неоднородности, подструктуры и (дис) промежуточные сборки.

Рисунок 1: Предварительное отделение BN-PAGE растворимых эндосомизированных мембран от почек мыши с помощью внутриклеточного канала TPC1 в качестве маркера. (A) Иммуногистохимическая локализация белка TPC1 в почечных проксимальных трубах с помощью конфокальной микроскопии. Зеленый: анти-TPC1 антитела¹² окрашивание визуализированы со вторичным Cy3-биотинилатированных коза анти-кролик IgG; красный: биоинтинилатированный тетрагонолобос-лектин Lotus (LTL, 10 мкг/мл, FITC-конъюгированный) маркировка светящейся поверхности проксимальных клеток тулупов. Врезка показывает окрашивание соответствующего участка из почки TPC1-KO в качестве отрицательного контроля. Белые бары масштаба 20 мкм. Также следует отметить сильное выражение TPC1 во внутриклеточных пузырьках, известное из независимых экспериментов, представляющих ранние и рециркулистовые эндосомы^12. (B) Предварительное разделение BN-PAGE 2,5 мг растворимых эндосомного обогащенных мембран на 1%-13% (w/v) градиентный гель градиента полиакриламида. Узкая полоса (обрамленная красным цветом) была вырезана для последующего анализа SDS-PAGE/western blot (верхняя панель), решения различных связанных с TPC1 комплексов и гликозиляционных моделей (красные стрелки: anti-TPC1/anti-rabbit HRP/ECL prime; зеленый цвет: позиции и предсказанные массы «MDa» маркерных белковых комплексов, выявленных общим окрашиванием белка «SYPRO Ruby blot пятно») помарка. Справа налево: Na^q/K-транспортирует ATPase, Cytochrome b-c1 комплекс димер, АТФ синтаза, NADH:ubiquinone оксидоредуктаза. 3 см раздел интереса от геля переулок был вырезан, встроенный в ткани встраивания среды, установлен, и нарезанный на 101 раздел (0,25 мм) вдоль фронта миграции белка с помощью криомикротома (нижняя панель; см. видеоссылку). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Ключевые параметры, определяющие точность назначения и количественной оценки сигнала MS, а также глубину анализа. (A)Распределение относительных ошибок массы (в ppm) после м/з калибровки ms/MS секвенированных (красных баров) и косвенно назначенных (т.е., основанных на близком соответствии времени массы и удержания, см. протокол; синие полосы) пептидных сигналов. Это говорит об окончательной массовой погрешности в размере 1/1 ppm (для 95% сигналов/назначенных П.П.) и очень низкой частоте ложноположительных назначений. (B) Распределение нано-HPLC удержания времени отклонения от общего среднего после elution время выравнивания пептидных сигналов, используя loess регрессии (см. протокол) и цветовое кодирование, как используется в (A). Ошибка времени составляет менее 30 с для йgt;95% пептидных сигналов / назначенных. (C) Run-к-запуск участок общей интенсивности MS построен по отношению к среднему из двух соседних образцов. Эти факторы масштаба были применены к необработанным таблицам п.п., чтобы свести к минимуму систематические технические ошибки. (D) Пептид наяинформация, используемая для расчета относительного изобилия профилей белков. После фильтрации белка конкретных пептидов для выбросов, плохо забил, или одной идентификации (см. протокол), 2545 профилей изобилия белка были определены, 75% из которых были основаны по крайней мере на трех пептидов с разумной уверенностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Критическое влияние размера шага в отборе геля на комплексное разрешение TPC1. Наборы данных были объединены путем подведения итогов интенсивности сигнала в группах 1, 2, 3 и 4 последовательных ломтиков (A-D, соответственно) и обрабатывались одинаково для имитации различных размеров шагов при нарезке геля в соответствии с указано. Профиль TPC1 показывает некоторые (перебора) шум на 0,25 мм, но хорошее разрешение размера трех сложных популяций (см. также Рисунок 1B), который в значительной степени сохраняется на 0,5 мм шириной шага. Дискриминация этих групп населения теряется по мере приближения 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Определение очевидного молекулярного веса. В качестве маркеров использовались 23 маркерных комплекса с определенным молекулярным составом (как указано, по данным UniProtKB/Swiss-Prot). Логарифмические значения их ожидаемых молекулярных весов (в kDa) были построены против. пиковый индекс профиля максимального среза указанного репрезентативного субъединицы белка (заполненные круги в черном цвете). Линейная регрессия, приписанная к этим данным (красная линия), обеспечила функцию преобразования значений индекса среза в очевидные молекулярные веса. Пик максима были определены автоматизированных Гауссиан подходит для белкового профиля пиков, как показано в входе (справа) для сопровождающего белка BCS1 (первичные данные в синем, подходят границы, указанные оранжевыми линиями, подходят функции в красном). Кроме того, они соответствуют определенным пиковым полумаксимальным ширинам (зеленая линия, 6,5 ломтика, или 1,6 мм для приведенного примера) с самыми острыми фокусировочными комплексами, охватывающими вокруг геля калибра 1,5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Примеры профилей субунитов белкового комплекса. Относительное изобилие белка против. очевидной молекулярной массы построен для тяжелой и легкой цепи ферритина (A) выявление молекулярной неоднородности ферритина субъединицы stoichiometry, более четко видны после масштабирования изобилия (всет). Заполненные стрелки и открытые стрелки обозначают полный комплекс (440 кДа) и два подкомплекса соответственно. Подразделения гамма-секретазы(B)количественно интегрированы в одноядерную комплексную популяцию. Подкомплексы вакуолярных H^-ATPases(C) выставлены несколько сборок с отчетливым составом субъединиц, все выраженные в эндосомы. Белки nomo1 и nicalin(D)образуют эксклюзивный комплекс (GPI-transamidase), который представляет собой многокомпонентный энзиматический механизм, образующий несколько комплексов. (E) 20S протеасомы основного комплекса, показывающий (F) тонкий подкомплекс шаблон с двумя популяциями, указанными стрелками в сером, все происходящие из других субклеточных локализаций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Представленное исследование, построенное на методе csBN-MS, ранее сравнивалось с митохондриальной подготовкой¹¹ и включало улучшения в подготовке образцов, обработке геля и оценке данных MS. Целенаправленный анализ раздела крупномасштабного разделения геля BN-PAGE предоставил полный набор данных, показывающих показатели качества, сопоставимые с исследованием с митохондриальными мембранами. Ошибки времени массы и удержания также, как run-to-run изменения были сдержаны очень низкими и обеспечили основу для определять надежные профили изобилия протеина. Разрешение размера оказалось хорошим, с полумаксимальной шириной пик как низко как шесть ломтиков (соответствующие 1,5 мм, рисунок 4) и относительные различия размера менее 10% решена(Рисунок 3, Рисунок 5A). Эти значения не в полной мере соответствуют размеру разрешения качества предыдущего csBN-MS анализа митохондрий (несмотря на меньший размер шага выборки геля выбрали), но они значительно лучше, чем производительность обычных BN-MS или размер исключения MS подходы^20, которые в последнее время стали популярными.

Важность высокоэффективного разрешения сложных размеров подчеркивается симуляционным экспериментом на рисунке 3 (с использованием связанных с TPC1 комплексов), который вряд ли может быть решен с помощью 2D BN/SDS-PAGE-WESTERN blot analysis(рисунок 1B). Эти результаты свидетельствуют о том, что 0,25 мм нарезки в этом случае привели к некоторым oversampling, но это все еще оказалось полезным для устранения "квантификации шума" без ущерба для эффективного разрешения размера. Таким образом, в соответствии с предыдущими результатами¹¹, размер шага выборки 0,3 мм, как правило, рекомендуется.

Примечательно, что дискриминация tPC1 связанных комплексов полностью теряется с 1 мм гель выборки, которая является наименьшим размер шага, предоставляемых ручной нарезки в обычных BN-MS^5,6. Это может объяснить тот факт, что, несмотря на мощные технологии MS доступны, очень немногие белковые комплексы и подразделения были определены de novo комплексного профилирования. Помимо хорошей разрешивщей мощности, csBN-MS предлагает высокую универсальность. Комплексы мембранных и растворимых белковых комплексов от 50 кДа до нескольких МДА могут быть эффективно решены в ходе одного эксперимента с минимальным уклоном^11. Это контрастирует с альтернативными методами разделения, используемыми для комплексного профилирования, таких как исключение размера или ионная обменх хроматографии, которые работают с подмножествами растворимых белков с определенными диапазонами размеров или свойствами заряда. С точки зрения, csBN-MS менее масштабируемый (максимальная нагрузка белка в 3 мг на гель), может быть технически сложным, и не может быть автоматизирован.

В целом, результаты показывают, что профилирование комплексов на основе csBN-MS может быть успешно применено к немитохондриальным целям, но также указывает на некоторые связанные с этим проблемы. Таким образом, эффективная экстракция и биохимическая стабильность белковых комплексов требуют дополнительной оптимизации, а меры очистки и могут быть еще ограничены. В исследуемом окне размера количество хорошо сфокусированных монодисперсных белковых комплексов действительно было значительно ниже (данные не показаны) по сравнению с митохондриальной выборкой. Также рекомендуется снизить нагрузки образца BN-PAGE для получения приемлемого разделения геля. Более высокие нагрузки могут потребовать более широких гелевых полос, которые труднее обрабатывать должным образом для нарезки (см. сопроводительное видео). Кроме того, белковая сложность образцов была выше (примерно в два раза), чем митохондрий полученных ломтик дайджесты, что приводит к более недостающие значения. и снижение динамического диапазона. В самом деле, некоторые небольшие белки, как ожидается, будет частью комплексов, показанных на рисунке 5 не хватает в анализах. Эти проблемы могут быть решены в будущем с помощью более быстрых и более чувствительных инструментов MS или режимов сбора данных, независимых от данных.

Подготовка образцов очень важна для поиска белкового комплекса, стабильности и качества разделения геля. Параметры и процедуры должны быть оптимизированы для каждой исходной ткани, лизата клеток, мембраны (фракции) и белкового комплекса, представляющих интерес. Приведены следующие общие рекомендации, которые могут помочь расширить применение csBN-MS:

i) подготовка свежих образцов и предотвращение потепления/замораживания, сильного разбавления, изменения буферных условий и ненужных задержек;

ii) Использование буферов, которые по существу лишены солей (заменить 500-750 мМ бетаин или аминокапроевую кислоту), о нейтральном рН, и содержащие до 1% (w/v) неденатурного моющего средства (белковое соотношение дефлета между 1:4-1:10 для растворения мембраны белковые комплексы, не требующиеся для растворимых белковых комплексов;

iii) тщательное тестирование и корректировка условий моющих средств аналитическим BN-PAGE, поскольку они могут сильно повлиять на эффективность сложной растворимости, представления мембранных белковых комплексов в образце, стабильность и однородность белок-моющие мицеллы. Последние являются предпосылками для белков, чтобы сосредоточиться в качестве различных полос / сложных популяций на BN-PAGE гелей. Предыдущая литература предлагает широкий спектр нейтральных моющих средств. Тем не менее, DDM (n-dodecylq-d-maltoside)^1,2,4,5,6 и digitonin^{3,5,7, 9,10,13,18} были самыми популярными вариантами для анализа BN-MS до сих пор. Следует подчеркнуть, что любое состояние моющего средства обязательно представляет собой компромисс между эффективностью растворимости и сохранением белковых взаимодействий и не может быть одинаково подходящим для всех типов целевого белка и исходного материала;

iv) Удаление заряженных полимеров, таких как фибриллы, нити, полилизин, ДНК и обильные компоненты молекулярного веса (т.е. метаболиты, липиды или пептиды). Это может быть достигнуто путем ультрацентрифугации, фильтрации геля, или диализа. Это особенно важно для общего количества клеток или тканей lysates;

v) Добавление Coomassie G-250 (окончательная концентрация 0,05%-0,1%) и сахарозу (для увеличения плотности для погрузки, конечная концентрация 10%-20% "w/v") к образцу непосредственно перед погрузкой, чтобы очистить коротким ультрацентрифугированием, загрузить образец без возмущения, и начать запустить сразу после этого.

В перспективе, CSBN-MS основе комплексного профилирования предлагает варианты мультиплексирования для изучения динамики белкового комплекса или изменения, связанные с конкретными биологическими условиями. Комбинированное разделение метаболически обозначенных образцов, предлагаемых для профилирования на основе исключения размера^21, представляется простым, но это может быть затруднено спонтанным обменом субъединиц в комплексах, происходящих независимо от используемого разделения Метод. Кроме того, маркированные образцы могут быть решены в соседних гелевых полосах, которые затем могут быть совместно нарезанными или комбинированными после переваривания для дифференциального анализа с высокой чувствительностью и надежностью.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37,5:1	Bio Rad	#1610158	Рекомендуется для акриламидных градиентных гелевых растворов до 13%
30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio Rad	#1610154	Рекомендуется для акриламидных градиентных гелевых растворов >13%
SYPRO Ruby Protein Blot Stain	Bio Rad	#1703127	Общее белковое окрашивание на блот-мембранах; чувствительно и совместимо с иммунодетектированием
Coomassie Brilliant Blue G-250	Serva	no. 35050	Центрифугирование исходных растворов перед использованием
ComplexioLyte 47	Logopharm	CL-47-01	Готовый к использованию буфер для детергента (1%) для мягкой солюбилизации мембранных белков
Закладная среда / Среда для замораживания тканей	Leica Biosystems	14020108926	Закладочная среда для гелевых срезов, срезов с помощью криомикротома
Мембрана Иммобилон-, ПВДФ, 0,45 &; m	Merck	IPVH00010
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE Healthcare	RPN2232
Пластиковый шприц с резиновой пробкой, 20-30 мл	н.а.н.а		. любого поставщика, важный для изготовления гелевого сечения инструмент для встраивания
широкого бритвы	н.а.н.а	.	любого поставщика, для обрезки гелем / иссечения дорожек
металлической трубки/цилиндра BN-PAGE, ок. 4 см длинная	форма n.a.n.a.mold		для встраивания и замораживания образцов геля
Protein LoBind Tubes, 1,5 мл	Eppendorf	Nr. 0030108116	настоятельно рекомендуется для минимизации потерь белка/пептидов из-за абсорбционного
секвенирования модифицированного трипсина	Promega	V5111
C18 PepMap100 precolumn, размер частиц 5 & микро; m	Dionex / Thermo Scientific	P/N 160454
излучатель PicoTip (i.d. 75 &m; m; Совет 8 и микро; m)	Новая цель	FS360-75-8
ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 & микро; m)	Dr. Maisch GmbH	r13.93.	столбцы, упакованные вручную
кролика к TPC1	Gramsch Laboratories	на заказ	описано в Castonguay, et al., 2017 (Ссылка 12)
Cy3-биотинилированное козье антитело к кролику IgG	Vector Laboratories	CY-1300	описано в Castonguay, et al., 2017 (Ссылка 12)
биотинилированный Lotus tetragonolobus lectin, FITC-конъюгированный	Vector Laboratories	#B1325	описано в Castonguay, et al., 2017 ( Ссылка 12)
криомикротом Leica CM1950	Leica Biosystems	14047743905
Mini Protean II Cell с блоком мокрого блоттинга	Bio Rad	n.a.for	SDS-PAGE и Westernblot (больше не продается)
Penguin Midi Gel Electrophoresis System	PeqLab	n.a.for	BN-PAGE (больше не продается)
Микроскоп Zeiss Axiovert 200 M + цифровой фотоаппарат Photometrics Coolsnap 2	Zeiss / Фотометрический	насос н.а.перистальтический
(IP высокоточный многоканальный)	Ismatec	ISM940	для литья градиентных полиакриламидных гелей
градиентный смеситель с перемешиванием (две камеры)	собственного изготовления, альтернативно Bio Rad	1652000 или 1652001	для литья градиентных полиакриламидных гелей, инструкция содержит инструкции по литью линейных или гиперболических градиентных гелей (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)
ультрацентрифуга Sorvall M120 с ротором S80 AT3	Sorvall / Thermo Scientific	n.a.	для пробоподготовки (больше не продается)
UltiMate 3000 RSLCnano HPLC	Dionex / Thermo Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Orbitrap Elite масс-спектрометр	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMAZQ