Методическая статья

Производство E.coli-выраженные самосборки белковых наночастиц для вакцин, требующих тримерной эпитопной презентации

DOI:

10.3791/60103

⸱

21 августа 2019 г.

 ,  ,  , 
1U.S. Military HIV Research Program, Walter Reed Army Institute of Research, 2Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, 3Alpha-O Peptides AG

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь приводится подробный метод, описывающий очистку, сворачивание и характеристику самосборки белковых наночастиц (SAPN) для использования в разработке вакцины.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Самосборка белковых наночастиц (SAPN) функционирует как повторяющиеся антигенные дисплеи и может быть использована для разработки широкого спектра вакцин против различных инфекционных заболеваний. В этой статье мы демонстрируем метод получения ядра SAPN, содержащего сборку шестисугликсового пучка (SHB), способного представлять антигены в тримерной конформации. Мы описываем выражение SHB-SAPN в системе кишечной палочки, а также необходимые шаги очистки белка. Мы включили шаг мытья изопропанола для уменьшения остаточного бактериального липополисахарида. Как индикация тождественности протеина и чистоты, протеин промединировал с известными моноклональными антителами в западных анализах побелки. После повторного сворачивания размер частиц снизился в ожидаемом диапазоне (от 20 до 100 нм), что было подтверждено динамическим рассеянием света, анализом отслеживания наночастиц и электронной микроскопией передачи. Описанная здесь методология оптимизирована для SHB-SAPN, однако, с небольшими изменениями она может быть применена к другим конструкциям SAPN. Этот метод также легко переносимый для крупномасштабного производства для производства GMP для вакцин для человека.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В то время как традиционная разработка вакцин была сосредоточена на инактивированных или ослабленных патогенных микроорганизмов, фокус современных вакцин сместился в сторону субединых вакцин1. Такой подход может привести к более целенаправленным ответным мерам и потенциально более эффективным кандидатам на вакцину. Однако одним из основных недостатков является то, что субединые вакцины не являются твердыми частицами, как целые организмы, что может привести к снижению иммуногенности2. Наночастицы в качестве повторяющейся системы дисплея антигена могут иметь преимущества как целевого подхода к вакцине субунита, так и твердых частиц всего организма1,3.

Среди существующих типов нановакцин, рационально разработанные сборки белка позволяют для разработки и разработки вакцины кандидатов, которые могут представить несколько копий антигена потенциально в родной, как конформация1,4 ,5,6. Одним из примеров этих белковых сборок являются самосборка белковыхнаночастиц (SAPN) 7. SAPNs основаны на доменах сутышкой катушки и традиционно выражены в Escherichia coli8. SAPN вакцины кандидатов были разработаны для различных заболеваний, таких как малярия, ОРВИ, грипп, токсоплазмоз, и ВИЧ-19,10,11,12,13 , 14 Год , 15 лет , 16 Год , 17 Лет , 18 лет , 19. Конструкция каждого кандидата SAPN специфична для патогена, представляющих интерес, однако, производство, очистка и сворачивание методы, как правило, широко применимы.

Одной из наших текущих интересов является эффективная вакцина против ВИЧ-1. В RV144-единственном этапе III клинических испытаний вакцины против ВИЧ-1, которые продемонстрировали скромную эффективность-снижение риска инфекции коррелировалось с igG антитела к V1V2 петли белка конверт20,21. Родной, как тримерпрезентация этого региона считается важным для защитной иммуногенности22. Чтобы представить v1V2 цикл как можно ближе к родной, как конформация, как это возможно, мы разработали доказательство принципа SAPN вакцины кандидата, который содержал ВИЧ-1 конверт после слияния шести-сугнительная расслоение (SHB), чтобы представить V1V2 петли в правильной конформации9 . Этот кандидат был признан известными моноклональными антителами к белку конверта ВИЧ-1. Мыши, иммунизированные V1V2-SHB-SAPN, подняли V1V2 специфические антитела, которые, самое главное, привязанык gp70 V1V2, правильным конформационным эпитопам 9. Ядро SHB-SAPN может иметь другие функции, выходящие за рамки роли носителя цикла ВИЧ-1 V1V2. Здесь мы описываем подробную методологию выражения, очищения, складывания и проверки ядра SHB-SAPN. Выбор последовательности, дизайн наночастиц, молекулярное клонирование и трансформация кишечной палочки были ранее описаны9.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выражение белка SHB-SAPN в E. coli BL21 (DE3)

  1. Смешайте 95 мл компонента А и 5 мл компонента B носителей в 2 л стерильной стеклянной колбе Erlenmeyer в рамках инструкций производителя (см. Таблицуматериалов). Добавьте ампициллин к конечной концентрации 100 мкг/мл.
  2. Прививать средства массовой информации с кишечной палочкой из ранее созданной культуры глицероль. Инкубировать культуру при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 200 вращениях в минуту (об/мин) на 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использованный e. coli BL21 (DE3) содержал вектор экспрессии 23 с геном SHB-SAPN. Хотя общий протокол средств массовой информации рекомендует 24 ч инкубации при 37 градусах Цельсия, 48 ч инкубации при 30 градусах Цельсия дают более высокую урожайность для SHB-SAPN.
  3. Перенесите культуру на две конические трубки 50 мл. Центрифуга труб при 4000 х г в течение 10 мин с фиксированным углом ротора при 4 градусах Цельсия. Удалите супернатант и сохранить гранулы для сбора клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные гранулы могут быть обработаны немедленно или заморожены при -80 градусов до использования.

2. Лисис E. coli BL21 (DE3) по звуку

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте непирогенную пластичную посуду и стеклянную посуду, запеченную при 250 градусах По цельсии в течение по крайней мере 30 мин. Tris (2-carboxyethyl) фосфин (TCEP) в качестве уменьшающий агента нарушает дисульфидные связи внутри и между белками. TCEP необходим в буферах во время этого протокола, если отображаемый антиген содержит s-S-облигации. Только для ядра SHB-SAPN присутствие TCEP в буферах не является существенным.

  1. Приготовьте буфер без имидазола (8 М Urea, 50 мМ фосфат натрия монобасный, 20 мм Tris base, 5 mM TCEP) pH 8.0 (с поправкой на 5 N NaOH) и отфильтруйте его с помощью блока фильтрации вакуумной бутылки 0,22 мкм.
  2. Отрежь пеллетные клетки (от шага 1.3) с 40 мл буфера, свободного от имидазола, в одной конической трубке 50 мл. Сноиндикт переплета ячеек с зондом на льду в течение 5 мин (4 с s sonication, 6 с отдыха) с выходом sonication 150 W.
  3. Центрифуга клеточный лисат (40 мл) при 29000 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 25 минут в фиксированном угловом роторе для генерации очищенного супернатанта. Перенесите супернатант в стерильную колбу 150 мл и отбросьте гранулы. Разбавить супернатант до 100 мл с помощью буфера, свободного от имидазола (позже в протоколе называют "образец").
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг разбавления необходим для предотвращения слишком высокого давления системы FPLC во время загрузки lysate на столбец.

3. Очистка белка с помощью Его колонки

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был выполнен с помощью инструмента FPLC, но он может быть адаптирован к гравитационному потоку.

  1. Подготовьте следующие буферы и отфильтруйте их с помощью блока фильтрации вакуумной бутылки 0,22 мкм: i) буфера без имидазола "Буфер А" (8 М Уреа, 50 мм фосфат натрия монобастный, 20 мм базы Tris, 5 мМ TCEP) pH 8.0; ii) 500 мМ имидазол буфера "Буфер B" (8 M urea, 50 мм фосфат натрия монобасный, 20 мм Tris базы, 5 мМ TCEP, 500 мм Имидазол) рН 8.0; и (iii) изопропанол мыть (20 мМ Трис, 60% изопропанола) рН 8,0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: рН для каждого буфера был скорректирован с 5 N NaOH.
  2. Равновесие Его колонны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для производства лабораторных масштабов в этом протоколе используется 5 мЛ расфасованная его колонка, но можно использовать любой столбец большего размера.
    1. Откройте программное обеспечение FPLC и нажмите на новый метод опции. Он сразу же откроется для меню настроек Метода. Под выпадающим меню для столбца выберите порт C13.
    2. На показанной техникой выпадают меню выбрать сродство. На типе колонки выпадающее меню выбирайте другие, Histrap HP, 5 мл. Объем столбца и коробки давления будут автоматически установлены на соответствующие значения.
    3. Нажмите на кнопку «Метод контура». Перетащите следующие кнопки из всплывающее меню библиотеки Фазы: уравновешиваете, примерприложения, мытье столбцови elution рядом со стрелкой в этом точном порядке. Закройте меню библиотеки Фазы.
    4. Нажмите на кнопку равновесия. Значения, перечисленные в таблице, должны быть "первоначальный буфер B" (4%), "окончательный буфер B" (4%) и "объем (CV)" 5.
    5. Нажмите на поле приложения Sample. В пробной погрузочной коробке нажмите радиокнопку для инъекций образца на колонке с образцом насоса. Убедитесь, что коробка рядом с частотой потока использования из настроек метода проверяется в виде инъекций с системным насосом. Рядом с объемной коробкой на правой стороне экрана изменить значение до 20 мл.
    6. Нажмите на кнопку мытья колонки. Значения, перечисленные в таблице, должны быть "первоначальный буфер B" (4%), "окончательный буфер B" (4%) и "объем (CV)" 5. Рядом с схемой сбора фракций отщелка кнопки Enable Box.
    7. Нажмите на кнопку elution. Значения, перечисленные в таблице, должны быть "первоначальный буфер B" 0%, "окончательный буфер B" 100%, и "объем (CV)" 5. Рядом с схемой сбора фракций нажмите на поле Enable. Отменить размер фракции использования от настроек метода и настроить размер фракции до 4 мл в заполнении коробки ниже.
    8. Нажмите кнопку сохранить в верхней части программного обеспечения. Назовите файл "равновесие".
    9. Подключите 5 мл расфасованных его колонки в соответствующую колонку порт 3 на FPLC. И насос А и насос B трубки, а также образец трубки насоса должны быть помещены в 0,22 мкм фильтрованной деионизированной воды. Запустите программу равновесия.
    10. Поместите как насос И насос B, а также образец трубки насоса в имидазола свободного буфера (Буфер А) и запустить протокол равновесия снова.
  3. Привязать образец к столбце и очистить белок.
    1. Откройте программное обеспечение FPLC и нажмите на новый метод опции. Он сразу же откроется для меню настроек Метода. В соответствии с выпадающим меню для позиции колонки выберите порт C13. На показанной техникой выпадают меню выбрать сродство. На столбце типа выпадающего меню выбирайте другие, Histrap HP, 5 мл. Объем столбца и коробки давления будут автоматически установлены на соответствующие значения.
    2. Нажмите на кнопку «Метод контура». Перетащите кнопки из всплывающее меню библиотеки Фазы: уравновешивается, образецприложения, вымывание колонки (Wash 1), мытье столбцов (Wash 2), вымывание столбцов (Wash 3) и Elution рядом со стрелкой в этом точный порядок. Закройте меню библиотеки Фазы.
    3. Нажмите на кнопку «Равновесие». Значения, перечисленные в таблице, должны быть "первоначальный буфер B" 4%, "окончательный буфер B" 4% и "объем (CV)" 5.
    4. Нажмите на поле приложения Sample. В пробной погрузочной коробке нажмите кнопку радио для Inject образец на колонке с образцом насоса. Убедитесь, что коробка рядом с частотой потока использования из настроек метода проверяется в виде инъекций с системным насосом.
    5. Рядом с объемной коробкой на правой стороне экрана изменить значение до 100 мл. Рядом со схемой сбора фракций нажмите кнопку Enable. Отменить размер фракции использования из коробки настроек метода, а затем изменить размер фракции до 4 мл.
    6. Нажмите на кнопку промывки первой колонки (Wash 1). Значения, перечисленные в таблице, должны быть "первоначальный буфер B" 4%, "окончательный буфер B" 4% и "объем (CV)" 10. Рядом с схемой сбора фракций нажмите на поле Enable. Отменить размер фракции использования из настроек метода, а затем изменить размер фракции до 4 мл.
    7. Нажмите на кнопку мытья второй колонки (Wash 2). Значения, перечисленные в таблице, должны быть "первоначальный буфер B" 0%, "окончательный буфер B" 0% и "объем (CV)" 5. Рядом с схемой сбора фракций нажмите на поле Enable. Отменить размер фракции использования из настроек метода, а затем изменить размер фракции до 4 мл.
    8. Нажмите на третью кнопку мытья колонки (Wash 3). Значения, перечисленные в таблице, должны быть "первоначальный буфер B" 0%, "окончательный буфер B" 0% и "объем (CV)" 5. Рядом с схемой сбора фракций нажмите Enable. Отменить размер фракции использования из коробки настроек метода, а затем изменить размер фракции до 4 мл.
    9. Нажмите на кнопку Elution. В таблице правонажмите кнопку информации, перечисленной и, в меню, которое приходит, нажмите Удалить шаг. Перетащите кнопку изократического градиента на стол дважды, так что есть две записи.
    10. Значение для первой записи должно прочитать "первоначальный буфер B" 30%, "окончательный буфер B" 30%, и "Объем (CV)" 10. Значение для второй записи должно прочитать "первоначальный буфер B" 100%, "окончательный буфер B" 100%, и "объем (CV)" 10. Рядом со схемой сбора фракций нажмите кнопку Enable. Нажмите на поле рядом с использованием размера фракции из настроек метода.
    11. Нажмите кнопку Сохранить в верхней части программного обеспечения. Назовите файл "очищение". Насос трубки FPLC должны быть помещены в буфер без имидазола мыть в то время как насос B трубки должны быть помещены в 500 мМ имидазол буфера. Образец трубки насоса должны быть помещены в образец 100 мл.
    12. Запустите программу «очищения» и подождите, когда потребуется 60% изопропанола (Wash 2). Приостановить программу, переместить насос трубки из имидазола без мытья в 60% изопропанола мыть. Перезапустите программу.
    13. Как только шаг изопропанола будет завершен, снова приостановите программу и переместите насос A tubing обратно в буфер для мытья без имидазола. Перезапустите программу очистки (остальная часть запуска автоматизирована).

4. Оценка чистоты и идентификация белка sDS-PAGE

  1. Объедините все фракции, соответствующие (i) протекающий (клеточный лисат, который не связывался с Его колонкой), (ii) Wash 1, (iii) Wash 3 (60% изопропанола) и (iv) Wash 3 в отдельных конических трубках 50 мл. Не комбинируйте фракции 2 мл из ступеней elution.
  2. Смешайте 15 зл от каждой из объединенных фракций и всех фракций из шагов elution с 2x Laemmli образец буфера в 0,5 мл микроцентрифуги трубки и денатурировать их при 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
  3. В то время как белок денатурации, создать гель работает аппарат с 3 пятном без 4-20% precast полиакриламид гели в 1x Tris-глицин SDS-PAGE работает буфер.
  4. Загрузите 8 зл молекулярного маркера веса на первую скважину и 30 зл денатурированного образца на другие скважины геля. Выполнить гели на 200 В, пока краситель фронт попадает в нижней части геля (около 30 мин). Удалить гели из аппарата и кратко промыть деионированной водой. Изображение гель сразу же с помощью системы изображения без пятен.
  5. Определите фракции, содержащие белковые полосы с правильным размером (18,07 кДа). Объедините все эти фракции.

5. Идентификация протеина западным пятном

  1. Запустите западную помарку с помощью его специфических антител (анти-6x HisTag) и SHB-специфических антител (167-D-IV) для идентификации очищенного полнометражного белка. Анти-6x HisTag антитела признает N конечной белка и 167-D-IV антитела признает C конечного демонстрируя наличие полнометражного белка.
  2. Определите концентрацию белка (i) протекать через, (ii) Промыть 1, (iii) Промыть 2 (60% изопропанола мыть), (iv) Промыть 3, и все фракции из шагов элютации с инструментом спектрометра при абсорбции 280 нм. Генерировать разбавления, которые содержат 100 нг белка в 15 зл имидазола буфера для каждой из этих групп.
  3. Добавьте 15 qL 2x буфера образца Laemmli к каждому 15 qL образцов и денатурировать их как в шаге 4.1. После того, как денатурирование завершено спина вниз трубки для обеспечения всех белков могут быть переданы.
  4. Загрузите образцы и предварительно окрашенные маркера в пятно-бесплатно 4-20% предварительной полиакриламид гель. Выполнить электрофорезаз при 200 В, пока краситель фронт не достигнет нижней части геля.
  5. В то время как гель работает, сделать 1 л TBS-T (20 мм Tris, 150 мМ NaCl, и 0,1% Tween 20) и 200 мл 5% обезжиренного молока в TBS-T.
  6. Используйте западную систему переноса побелки для переноса белка на мембрану нитроцеллюлозы. Используйте предварительно собранный стек передачи и поместите гель на него. Настройка системы для запуска на 25 V в течение 7 мин. Проверьте наличие предварительно окрашенных маркера на мембране нитроцеллюлозы с указанием полной передачи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги выполняются на орбитальном шейкере, установленном при температуре в 100 об/мин (RT).
  7. После того, как передача завершена, мыть пятна два раза с TBS-T в течение 10 минут каждый.
  8. Блок нитроцеллюлозы мембраны (пятно) с 5% обезжиренного молока в TBS-T, по крайней мере 1 ч. Мыть пятна два раза с TBS-T в течение 10 минут каждый.
  9. Разбавить первичные 167-D-IV и анти-6x HisTag антитела до 1 мг/мл в TBS-T (запас Ab). Разбавить запас Abs 167-D-IV 10000 раз и анти-6x HisTag 5000 раз, добавив 2 qL акций 167-D-IV и 4 зл запасов анти-6x HisTag антител к двум различным труб, содержащих 20 мл TBS-T. Добавьте общий объем первичных антител 20 мл, по одному к каждому поделу, и инкубировать помарки по 1 ч. Промойте пятна два раза с TBS-T в течение 10 минут.
  10. Разбавить 4 л 1 мг/мл мыши античеловеческими вторичными антителами, спрятаемыми с щелочной фосфатазой в 20 мл TBS-T (1:5,000 разбавления). Разбавить 4 л 1 мг/мл козла антимыкового вторичного антитела, спрятававого с щелочной фосфатазой в 20 мл TBS-T (1:5,000 разбавления). Добавьте вторичные антитела к соответствующим помарки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-человеческое вторичное антитело связывается с 167-D и анти-мышь связывается с анти-6x HisTag. Вымойте пятна два раза с TBS-T в течение 10 мин.
  11. Добавьте достаточноb BCIP/NBT щелочный фосфатазный субстрат, чтобы покрыть помарки. Разработка помарки около 10 минут, пока полосы появляются. Промыть пятна с холодной водой из-под крана и дайте им высохнуть перед сканированием с планшетным сканером.

6. Сворачивание SHB-SAPN

  1. Добавьте объединенный белок (всего 10 х 10 к201220 мл) к молекулярной кассете 10 kDa, отрезанной от диализной кассеты, и диализировать его в 8 М мочевины, 20 мм Трис, 5% глицерола, 5 мМ TCEP pH 8.5 на RT (18-u201226 C) в одночасье.
  2. Медленно диализировать мочевину от образца, уменьшая концентрацию мочевины в буфере диализа поэтапно на 2 M каждые 2 ч. При концентрации мочевины 2 М перемещайте диализный аппарат до 4 градусов по Цельсию (не используйте TCEP в буфере диализа с этого шага). Закончите складывание путем диализирования образца в 120 мМ мочевины, 20 мм Трис, 5% глицерола, рН 8,5 при 4 градусах Цельсия за одну ночь.
  3. Удалите пересложенный белок (SHB-SAPN) из диализной кассеты. Фильтр SHB-SAPN с помощью 0,22 мкм поливинидиден фторид (PVDF) шприц файлер. Aliquot SHB-SAPN в стерильные трубки и заморозить их на -80 градусов по Цельсию, оставляя по крайней мере 100 qL на RT для последующего анализа.

7. Проверка частиц по размеру и внешнему виду

  1. Динамическое рассеяние света (DLS)
    1. Измерьте средний размер частиц SHB-SAPN по следующим параметрам: выберите белок в качестве материала, создайте сложный буфер для 120 мм мочевины, 20 мм трис, 5% глицерол 25 градусов по Цельсию для температуры, выберите одноразовые кюветы для анализа, выберите автоматический измерения, установленного для 5 запусков.
    2. Добавьте 45 кЛ SHB-SAPN в одноразовый квет и запустите программное обеспечение, нажав на зеленую стрелку. Выберите процентный объем для считываемого.
  2. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
    1. Разбавить образец на 1:20 в буфере складывания. Сделать 10 мл разбавленного образца.
    2. Используя 3 мл шприцев, промойте инструмент NTA с рескладывающим буфером и загрузите около 1,5 мл образца для уравновешивают инструмент. Используйте остальную часть образца для анализа.
    3. Создайте новый SOP в программном обеспечении NTA, нажав на вкладку SOP. Под вкладкой изменить количество захватов до 3 и изменить время захвата до 30 s. Нажмите кнопку автофокуса на левой стороне экрана, чтобы привести образец в фокус. Используйте ручную ручку фокусировки на стороне машины для тонкой настройки фокуса.
    4. Запустите созданный SOP, когда система подсказывает нагрузку небольшой объем образца со шприцем. После того, как система приняла все захваты, она автоматически поднимут экран анализа. Сдвиньте предельную планку обнаружения, чтобы все реальные частицы были отмечены красными крестами. Нажмите кнопку анализа выполнения и анализ начнется автоматически.
  3. Электронная микроскопия трансмиссии (TEM)
    1. Свечение разгрузки formvar/углерод 400 сетки меди TEM поддержки фильмов.
    2. Добавьте в сетку 3 зЛ образца при концентрации 0,075 мг/мл в течение 30 с. Уик с жидких с помощью фильтровальной бумаги.
    3. Вымойте сетку с 3 л деионизированной воды три раза, каждый раз wicking от воды с фильтровальной бумагой.
    4. Добавьте 3 злиц 0,5% уранила ацетата в пленку поддержки и дайте ему сидеть в течение 30 с. Wick от большей части ацетата уранила, но оставить тонкую пленку на поверхности. Разрешить образцы высохнуть до их визуализации на передаче электронного микроскопа.
    5. Образцы изображений при 80 кВ на TEM.

8. Определение уровней эндотоксина в образцах с использованием кинетического лимуляа амебоцита лизата (LAL)

  1. Удалите комплект и образцы из холодильника и дайте уравновесить RT.
  2. Для выполнения этого асссея требуется считыватель пластин с тепловым блоком и способностью читать образцы в течение 40 считываний на длине волны 405 нм при температуре 37 градусов по Цельсию. Напишите шаблон программы так, чтобы колодцы считывались каждые 150 с, чтобы определить точку времени начала (OD увеличился на 0,2 по сравнению с первым чтением).
  3. Разбавить образец до концентрации дозы иммунизации в ПБС.
    ПРИМЕЧАНИЕ: рН буфера повторного складывания находится за пределами диапазона lAL-ассе. Разбавление образца в PBS установит рН в приемлемый диапазон.
  4. Отстранить контрольный эндотоксин в соответствующем объеме безэндитоксинной воды LAL, определяемой сертификатом анализа для генерации 50 EU/mL. Энергично вихрь флакон в течение 15 минут, чтобы обеспечить полную повторную подвеску эндотоксина.
  5. Создайте стандартную кривую эндотоксина, предформируя 10-кратное серийное разбавление стеклянных флаконов в диапазоне от 50 ЕС до 0,005 EU/mL. Для каждого разбавления добавьте 0,1 мл предыдущего разбавления до 0,9 мл воды LAL. Вихрь энергично после комбинации в течение 1 мин.
  6. Добавьте стандартные разбавления кривой и образцы SHB-SAPN в дубликат евщицы к пластине 96-ну. Используйте LAL воды в качестве отрицательного контроля в дублировать, а также. Preincubate пластины на 37 градусов по Цельсию в течение 15 мин.
  7. Ближе к концу инкубации, resuspend асса реагент флакон с 2,6 мл воды LAL. Аккуратно смешайте содержимое с серологической пипеткой.
  8. Добавьте 100 зл иллеров к каждой скважине 96-хорошо йл. Быстро переместите пластину на считыватель пластин и запустите шаблон программы, написанный в шаге 8.2.
  9. Как только программа завершена, создайте стандартную кривую, используя значение журнала элементов управления по сравнению со значением журнала времени начала. Используйте формулу, полученную из этой кривой, для расчета концентрации эндотоксинов в образцах.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полностью собранный SHB-SAPN, показанный здесь, построен на белковых последовательностях(рисунок 1A),которые, по прогнозам, сложить в частицу, которая содержит 60 копий мономера (рисунок1B). Рисунок 2 содержит наброски метода производства, очистки и идентификации ядра SHB-SAPN. E. coli из глицерола, который содержал вектор экспрессии pPep-T с генной последовательностью ядра SHB-SAPN, был индуцирован в BL21 (DE3) E. coli. Бактериальные клетки успешно выращивались и лисицировались под денатурированием и уменьшением условий.

Общий клеточный лисат был использован для очистки мономеров SHB-SAPN fPLC с помощью колонки Ni2 (рисунок 3A). Хроматограф FPLC показывает, что белок eluted как на 150 мМ и 500 мМ имидазол(рисунок 3A). Хроматограмма также показывает два других пика на 185 мл и 210 мл общий объем, соответствующий изопропанол мыть и имидазол амантиазол атакжем, соответственно. Фракции и чистота рекомбинантного белка были определены градиентными гелями SDS-PAGE(рисунок 3B). Белок, представляющий интерес, был в основном расположен в фракциях 68-u201279 (общий объем 278-2012300 мл). Эти фракции были объединены для дальнейшего анализа. Западная подательная яма с анти-Его антитела (N-терминал) и 167-D-IV антитела (C-терминус) показали, что объединенные фракции были действительно белок интереса(Рисунок 4A,B). Эти помарки также продемонстрировали наличие мультимер SHB-SAPN. Более предыдущие фракции смыва и elution клонили содержать более высокую концентрацию multimerized протеина и поэтому были исключены.

Образцы, содержащие интересующие белок мономеры, были сложены в полностью собранный SHB-SAPN путем диализа. Распределение размеров частиц было определено анализом DLS и наночастиц(рисунок 5A,B). DLS идентифицировала частицы с гидродинамическим диаметром 67 нм, в то время как система NTA измеряла средний размер 81 нм. Небольшие различия в размерах были обусловлены методами размеров частиц, однако размер обоих анализов находился вожидаемом диапазоне 20-х 2012100 нм 8,24,25. SHB-SAPNs были визуализированы TEM и изображения показали хорошо сформированные отдельные частицы с распределением размера, полученных от двух методов размеров частиц(рисунок 5C).

Во время очистки белка, колонка была промыта изопропанол, чтобы уменьшить загрязнение LPS в конечном SHB-SAPN продукта. Чтобы проверить, приемлем ли уровень эндотоксина для иммунизации, концентрация ЛПС в пробах SHB-SAPN, очищенных с помощью или без шага по мытью изопропанола, была определена кинетической проверкой LAL. Результаты показали, что изопропанол мыть снизили уровни эндотоксина от 0,25 EU/мкг до 0,010 EU/мкг белка SHB-SAPN (Таблица 1).

figure-results-1
Рисунок 1: последовательность и структура белка SHB-SAPN. (A) Аминокислотная последовательность мономера SHB-SAPN. (B) Компьютерная модель структуры полностью собранного ядра SHB-SAPN, состоящая из 60 белковых мономеров. Цветовая схема для аминокислотных последовательностей: Серый и HisTag; Зеленый и пентамлер; Темно-синий - де Ново разработанный триммер; Светло-голубой и шестиселиток пучок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Flowchart протокол для производства SHB-SAPN. Цветовая схема: Черный - выражение белкового мономера в кишечной палочке; Темно-серое очищение мономеров; Среднесеровская идентификация мономеров; Светло-серый - переукрапывание и характеристика; Белый и полностью собранный продукт SHB-SAPN. В шагах, помеченных темным и средним серым цветом, белок находится под денатурированием и уменьшением условий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Очистка белка мономеров SHB-SAPN. (A) Хроматограф из очистки FPLC. Зеленая линия над хроматограммой указывает на шаги очищения. Голубая линия в хроматограмме представляет оптическую плотность фракций на длине волны 280 нм. Черная линия показывает, какой процент буфера B (8 M мочевины, 20 мм Трис, 50 мМ фосфат натрия монобасный, 5 мМ TCEP, 500 мМ Имидазол, рН 8.5), который был использован в каждом этапе очистки. (B) SDS-PAGE гели объединенных фракций из lysate (L), протекать через (FT), первая стирка (W1), изопропанол мыть (W2), третья стирка (W3), и отдельные фракции из 150 мМ имидазол (E150) и 500 мм имидазола (E500) elution шаги elution из 150 мМ имидазола (E150) и 500 мм имидазола (E500) elution Очистки. Молекулярные маркеры в первой полосе (M) идентифицируют полосы между 10 и 250 kDa. Целевой белок указывается черной стрелкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Идентификация белка по западному побочке. Все полосы загружаются с 100 нг белка. (A) Результаты западного пятно с анти-6x HisTag. (B) Результаты западного пятно с 167-D-IV ВИЧ-1 моноклональных антител. Полосы помечены как: M и молекулярный маркер веса; 1 - лизат; 2 - Поток через; 3 - первая стирка; 4 - изопропанол мыть (вторая стирка); 5 - третья стирка; 6 - объединенные фракции объема 56'u201261 (первый пик elution), 7 фракций объема 62'u201267 (между двумя пиками), 8 - объединенные фракции объема 68'u201278 (второй пик elution). Целевой белок с ожидаемым размером полосы 18,07 кДа, как мономерная полоса SHB-SAPN указывается черной стрелкой. Дополнительные полосы в полосах 7 и 8 являются димеры, тримеры, и мультимеры SHB-SAPN (красная стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Характеристика повторно сложенного SHB-SAPN. (A). Распределение размера частиц, как это определено DLS. (B) Размер частиц, определяемый отслеживанием наночастиц (система). (C) Визуализация частиц SHB-SAPN tEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

ОбразецЭндотоксин (ЕС/мл)Эндотоксин (ЕС/мкг белка)
SAPN с Изопропанол умывкой2.020.01
SAPN без Исопропанола Уош(gt;50);0,25
Отрицательный контрольНиже уровня обнаруженияN/A

Таблица 1: Уровни эндотоксинов повторно сложенных SHB-SAPNs. Уровни эндотоксинов в пробах SHB-SAPN, очищенных с помощью или без изопропанола, представлены как эндотоксинные единицы/мл, так и эндотоксинные единицы/мг белка SHB-SAPN.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нанотехнология предоставляет множество преимуществ и решений для разработки субунитовой вакцины. Nanovaccines может повторно представить антигены в качестве частиц для иммунной системы хозяина повышения иммуногенности26. Хотя Есть много различных типов нановакцин, мы считаем, что те, состоящий из de novo разработан белка, как представляется, самый сильный подход для разработки вакцины1. Они могут быть разработаны без какой-либо последовательности гомологии для принимающих белков и представить антиген интереса в близко к родной, как конформация, обеспечивая при этом низкую себестоимость производства и высокие урожаи продукции. Ярким примером такого подхода является технология SAPN, которую мыприменили к вакцинам против множественных инфекционных заболеваний 7. Решая трудности в разработке вакцины против ВИЧ-1, мы разработали уникальное ядро SHB-SAPN, чтобы эффективнопредставить антиген V1V2 в местной тримерной конформации 9. Многие цели вакцины, особенно для вирусных заболеваний, присутствуют в качестве тримеров27. Это явление указывает на то, что наша конструкция SAPN имеет широкие последствия для разработки субединых вакцин.

В этом методе мы демонстрируем, как производить SHB-SAPNs в системе экспрессии кишечной палочки. Мы выразили высокие урожаи белка (около 6 мг/100 мл культуры). Белок содержал 10 гистидинов и легко очищался с помощью обездвиженного металлического сродства хроматографии с колонкой Ni2.com. Эта длина Его-Тега была признана оптимальной для самого высокого уровня урожайности белка. Очищенный белок содержал полную длину разработанного белка, о чем свидетельствует наличие как N-терминала HisTag, так и повторения гептада терминала С. Мы использовали общепринятые методы и оптимизировали их для выражения, производства и характеристики ядра SHB-SAPN. Отсутствие производства полноразмерного белка во время разработки SAPN, содержащего новый белковый эпитоп, может указывать на проблему экспрессии гена в клетке-хозяине. Если это произойдет, ген и система экспрессии должны быть переработаны и адаптированы к описанному протоколу. Изменение времени или интенсивности звукового времени может также увеличить концентрацию прогнозируемого полноформатного белка.

Сложенные частицы находились в ожидаемом диапазоне размеров (от 20 до 100 нм)8,24,25, как это определено анализом DLS и наночастиц. Эти результаты были дополнительно подтверждены с помощью TEM. Если есть проблемы в этом шаге, это, как правило, из-за проблемы с рН или иной силы складирования буфера. Когда крупные частицы размера обнаруживаются на методах размеров частиц, это указывает на агрегацию, которой можно избежать, увеличивая рН сворачивающего буфера. Если частицы не обнаружены DLS, проверьте концентрацию белка и проверьте рН буфера. Окончательная концентрация белка для DLS должна быть не менее 100 мкг/мл. Если концентрация не является проблемой, это указывает на обилие мелких, неполно сформированных частиц, концентрация которых может быть уменьшена за счет уменьшения рН. Кроме того, концентрация хлорида натрия может быть скорректирована с оптимальным диапазоном, чтобы свести к минимуму наличие частиц с нежелательным размером.

Наконец, с помощью изопропанола мыть шаг во время очистки мы смогли уменьшить загрязняющих LPS от хозяина кишечной палочки до 0,01 ЕС / мкг SAPN, который ниже пищевых продуктов и медикаментов (FDA) предел 5 ЕС / кг массы тела для инъекционных продуктов 28. Этот уровень можно еще больше снизить с помощью столбца обмена анионами, также известного как колонка q. Если высокие уровни эндотоксина все еще присутствуют, проверьте все материалы, которые были использованы для подготовки буфера. Не забудьте использовать только depyrogenated стеклянной посуды и эндотоксина бесплатно пластмассовые изделия в этом методе.

Эти результаты свидетельствуют о том, что мы успешно разработали метод производства ядра SHB-SAPN, который может быть использован для доклинических исследований иммунизации. Этот метод с небольшими изменениями, если таковые имеются, может быть применен к очищению SHB-SAPNs, когда антиген интереса добавляется. Использование этого метода в качестве отправной точки одним из основных изменений находится в шаге elution. Различные белки elute на различных концентрациях imidazole которые необходимо определить экспериментально. Другим важным отличием может быть состав буфера складывания. Оптимизация потребует тестирования различных условий рН, а также ионных сильных сторон.

При рассмотрении будущей работы, только два небольших изменения необходимы, чтобы позволить человеческому применению SHB-SAPN. Во-первых, вектор выражения должен быть изменен на канамицин сопротивление выбираемый маркер из-за аллергии ампициллин у людей29. Другим важным требованием производства белка для использования человеком является производство SHB-SAPN в носителях, свободных от продуктов животного происхождения. Небольшое исследование уже показало разумную урожайность белка в растительных носителях. Работа, представленная здесь легко масштабируемых для конечной производства GMP, как показано с кандидатом вакцины против малярии, FMP01416. Это крупномасштабное производство FMP014-SAPN включало как обмен анионов, так и шаги по обмену катионами для дальнейшего сокращения содержания LPS и Ni2'из конечного продукта. Это бактериальной выраженных SAPN уже масштабируется для предстоящего фаза 1/2a клинических испытаний.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высказанные мнения являются мнениями авторов и не должны быть истолкованы как представляющие позиции армии США или Министерства обороны. Питер Буркхард имеет интерес к компании под названием Alpha-O Peptides AG и имеет патенты на технологию. Другие авторы не имеют никакого отношения или финансового участия в какой-либо компании с финансовыми интересами по этому вопросу, представленному в настоящем документе.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана соглашением о сотрудничестве (W81XWH-11-2-0174) между Фондом Генри М Джексона по развитию военной медицины, Inc., и Министерством обороны США. Анти-ВИЧ-1 gp41 mAb 167-D IV антитела были получены от д-р Сьюзен Золла-Пазнер через NIH СПИД реагент программы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10x Трис/Глицин/SDSBioRad16107321 л
2-меркаптоэтанолBioRad161071025 мл
2-пропанолFisherBP261814 л
2x Laemmli Буфер для образцовBioRad161073730 мл
40 мкл Кювета Упаковка 100 мкм с пробкамиMalvern PanalyticalZEN0040100 упаковок
4– 20% сборные протеиновые гели Mini-PROTEAN TGX, 10-луночные, 30 и микро; lBioRad456109310 упаковок
ампициллинаFisherBP1760-2525 г
Anti-6X His tag антитела [HIS. H8]AbCamab18184100 мг
Anti-HIV-1 gp41 моноклональный (167-D IV)Реагент СПИДаРеагент 11681100 мг
BCIP/NBT субстрат, растворSouthern Biotech0302-01  100 мл
Corning  Одноразовый вакуумный фильтр/накопительные системыFisher09-761-108Различные размеры
Формвар/Карбон 400 меш, Медь ок. Размер отверстия сетки: 42&мкр; mTed Pella, Inc01754-F25 pack
GE Healthcare  5 мл HisTrap HP Расфасованные колонкиGE HealthCare45-000-3255 упаковок
глицеринаFisherBP229-44 л
козий антимышиный IgG H& L (щелочная фосфатаза)ABCamab970201 мг
имидазолаFisherO3196-500500 г
Быстрорастворимое обезжиренное сухое молокоQuality BiologicalA614-100310 упаковок
Kinetic-QCL Kinetic-Chormogenic LAL AssayLonza Walkersville50650U192 Test Kit
LAL Reagent Grade Multi-well PlatesLonza Walkersville25-3401 тарелка
Magic Media E. coli Expression MediumThermoFisherK68031 л
MilliporeSigma Millex Стерильный шприц 0,22 мм ФильтрыMilliporeSLGV033RB250 упаковка
Мышь Anti-Human IgG Fc-APSouthern Biotech9040-04  1,0 мл
One Shot BL21 Star (DE3) Химически компетентный E. coliThermoFisherC60100320 флаконов
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, рекомбинант с стрептококковой меткой,BioRad 16103631 мл
Slide-A-Lyzer Dialysis Кассеты, 10K MWCO, 12 млThermoFisher668108 упаковок
Хлорид натрияFisherBP358-2122,5 кг
Одноосновной фосфатFisherBP329-500500 г
трис BaseFisherBP152-11 кг
трис-(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлоридBiosynth InternationalC-1818100 г
уранилацетат, реагент, услуги электронноймикоскопии541-09-325 г
мочевиныFisherBP169-5002,5 кг
качественной фильтровальной бумагиВатман Sigma AldrichWHA10010155упаковке 500
Название<strong>Company>Каталожный номерКомментарии
  Оборудование
программное обеспечение
Микропланшетный спектрофотометр Epoch 2Планшетный ридерBioTekEPOCH2
Fiberlite F14-14 x 50cy Ротор с фиксированным углом наклонаThermoFisher096-145075Ротор
Gel Doc EZ Gel Documentation SystemBioRad1708270Gel Imager для Гели без пятен
JEOL TEMJEOL1400Просвечивающий электронный микроскоп
Mini-PROTEAN Tetra Вертикальный электрофорез Ячейка для мини сборных гелейBioRad1658004Для запуска гелей
NanoDrop Один микрообъемный УФ-Вид спектрофотометрThermoFisherND-ONE-WДля концентрации белка
NanoSight NS300Malvern Panalytical Panalytical Определение размеров
NanoSight NTA программное обеспечение NTAMalvern Panalytical PanalyticalОпределение размера частиц
New Brunswick Innova 44/44REppendorfM1282-0000Инкубатор/шейкер
NGC Quest 10 Система хроматографииBioRad7880001FPLC для помощи в очистке белка
PELCO easiGlow Glow Discharge Система очисткиTed Pella, INC91000SДля очистки решеток
PowerPac Universal Power SupplyBioRad1645070Для запуска гелей
Rocker ShakerDaiggerEF5536AДля Western
Sonifer 450Bransonтакже известен как 096-145075 Ультразвуковой аппарат
Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000 Сверхскоростная центрифугаThermoFisher75-006-580Центрифуга
Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose Transfer PackBioRad1704158для Western
Trans-Blot Turbo Transfer SystemBioRad1704150для Western
Vortex-Genie 2DaiggerEF3030AVortex
Zetasizer Nano ZSMalvern Panalytical ParticleSizing
Программное обеспечение ZetasizerMalvern Panalytical ParticleSizing
натрия ACS ChromLab Software ver 4 BioRad 12009390

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Karch, C. P., Burkhard, P. Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies. Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).
  2. Snapper, C. M. Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens. Frontiers in Immunology. 9, 598(2018).
  3. Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines. Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).
  4. Yeates, T. O. Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials. Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).
  5. Marcandalli, J., et al. Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus. Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).
  6. Ross, J. F., et al. Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins. ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).
  7. Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development. Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).
  8. Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles). Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).
  9. Karch, C. P., et al. Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen. Nanomedicine. , (2018).
  10. Karch, C. P., et al. The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62(2017).
  11. Li, J., et al. A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus. PLoS One. 13 (9), e0203771(2018).
  12. Wahome, N., et al. Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine. Chemical Biology & Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).
  13. El Bissati, K., et al. Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice. Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).
  14. Kaba, S. A., et al. A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria. Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).
  15. Kaba, S. A., et al. Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine. PLoS One. 7 (10), e48304(2012).
  16. Seth, L., et al. Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants. Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).
  17. Kaba, S. A., et al. Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine. Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).
  18. El Bissati, K., et al. Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma. NPJ Vaccines. 2, 24(2017).
  19. Karch, C. P., et al. Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge. Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).
  20. Haynes, B. F., et al. Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial. New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).
  21. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).
  22. O' Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development. Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).
  23. Babapoor, S., et al. A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection. Influenza Research and Treatment. 2011, 126794(2011).
  24. Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design. Royal Society Open Science. 4 (4), 161092(2017).
  25. Indelicato, G., et al. Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles. Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).
  26. Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. Nanoscale assemblies and their biomedical applications. Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740(2013).
  27. Rey, F. A., Lok, S. M. Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines. Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).
  28. Bacterial Endotoxins. United States Pharmacopeia (USP). , Ch. 85 (2011).
  29. Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals. , Food and Drug Adminstration. Maryland. Available from: https://www.fda.gov/media/76255/download (1993).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

E coli ExpressionProtein PurificationIsopropanol WashWestern Blot AnalysisDynamic Light ScatteringNanoparticle Tracking AnalysisTransmission Electron MicroscopySix Helix BundleTrimeric Antigen Presentation

Похожие статьи