Иммуноглобулин G (IgG) N-гликанхарактеризуется с помощью гидрофильной взаимодействия хроматографии UPLC. Кроме того, структура IgG N-гликанчетко разделена. Представлено здесь введение в этот экспериментальный метод, так что он может быть широко использован в научно-исследовательских условиях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Иммуноглобулин G N-Гликан Анализ ультра-производительность жидкой хроматографии
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Glycomics является новой подспециализацией в исследованиях системы омики, которая предлагает значительный потенциал в открытии биомаркеров следующего поколения для восприимчивости к болезням, открытия целевых лекарственных средств и точной медицины. Альтернативные IgG N-гликаны были зарегистрированы в нескольких распространенных хронических заболеваний и предложил иметь большой потенциал в клинических приложениях (т.е., биомаркеры для диагностики и прогнозирования заболеваний). IgG N-гликанов широко характеризуется с помощью метода гидрофильной взаимодействия хроматографии (HILIC) ультра-производительности жидкой хроматографии (UPLC). UPLC является стабильной технологией обнаружения с хорошей воспроизводимостью и высокой относительной количественной точностью. Кроме того, структура IgG N-гликанчетко разделена, а гликановский состав и относительное изобилие в плазме характеризуются.
Введение
N-гликозилирование человеческих белков является общей и важной посттрансляционной модификацией1 и может помочь предсказать возникновение и развитие заболеваний относительно точно. В связи со сложностью его структуры, ожидается, что Есть более чем 5000 гликановых структур, обеспечивая большой потенциал в качестве диагностических и прогностических биомаркеров для заболеваний2. N-гликанов, прикрепленных к иммуноглобулину G (IgG), как было показано, имеют важное значение для функции IgG, и IgG N-гликозилирование участвует в балансе между про- и противовоспалительными системами3. Дифференциальная IgG N-гликозилирование участвует в развитии и прогрессировании заболеваний, представляющих как предрасположенность, так и функциональный механизм, участвующий в патологии заболевания. Воспалительная роль IgG N-гликозилирования была связана со старением, воспалительными заболеваниями, аутоиммунными заболеваниями и раком4.
С развитием технологии обнаружения, наиболее широко используются следующие методы в гликомиксах высокой пропускной способности: гидрофильные взаимодействия хроматографии (HILIC) ультрапроизводительной жидкой хроматографии с обнаружением флуоресценции (UPLC-FLR), мультиплексного капиллярного геля электрофорекса с лазерным индуцированным Обнаружение флуоресценции (xCGE-LIF), матричной лазерной дезорпации/ионизации времени полета масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) и жидкой хроматографии электроспрейной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS) . Эти методы преодолели предыдущие недостатки низкого потока, нестабильные результаты, и низкая чувствительность специфичность5,6.
UPLC широко используется для изучения связи между IgG N-гликозилирование и некоторые заболевания (т.е. старение7, ожирение8, дислипидемия9, диабет II типа10, гипертония11, ишемический инсульт12, и болезнь Паркинсона13). По сравнению с другими тремя вышеупомянутыми методами, UPLC имеет следующие преимущества5,14. Во-первых, он обеспечивает относительный метод количественного анализа, а анализ данных, который включает в себя полное нормализацию площади, улучшает сопоставимость каждой выборки. Во-вторых, стоимость оборудования и требуемых знаний относительно невелики, что облегчает внедрение и преобразование биомаркеров гликозилирования в клинические приложения. Представлено здесь введение в UPLC, чтобы он мог быть более широко используется.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все предметы, включенные в протокол, были одобрены Комитетом по этике Столичного медицинского университета, Пекин, Китай12. Письменное информированное согласие было получено от каждого предмета в начале исследования.
1. Изоляция IgG
- Подготовка химических веществ, включая связывающий буфер (фосфат буферный солен, PBS): 1x PBS (pH 7.4), нейтрализующий буфер: 10x PBS (pH 6.6-6.8), eluent: 0.1 M formic кислота (pH q 2.5), нейтрализуя разрешение для eluent: 1 M ammonium bicarbonat, буфер: 20% этанол 20 мм Трис 0,1 М NaCl (pH 7.4), очищающий раствор для белка G: 0,1 М НаОХ и 30% пропан-2-ol.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень рН имеет решающее значение в этом протоколе. Elution IgG требует очень низкого рН, и есть риск потери сиаливных кислот из-за кислотного гидролизов. Таким образом, elution происходит в течение нескольких секунд, и рН быстро восстанавливается в нейтральном статусе, сохраняя целостность IgG и сиаливных кислот. - Подготовьте образцы: разморозьте замороженный образец плазмы, затем центрифугу на уровне 80 х г в течение 10 мин, и оставьте белок G монолитной пластины и вышеупомянутые химические вещества в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
- Передача 100 л образца (который может быть использован для обнаружения 2x для предотвращения первого отказа) в 2 мл коллекции пластины (здесь, в общей сложности шесть стандартных образцов, один контрольный образец »ультра-чистая вода» и 89 образцов плазмы были разработаны для 96 хорошо пластин и случайным образом назначены к тарелке).
- Разбавить образцы 1x PBS на 1:7 (v/v).
- Очистите фильтровальную пластину 0,45 мкм гидрофильной полипропилена (GHP) с 200 л ультра-чистой воды (повторите 2x).
- Перенесите разбавленные образцы в фильтровальную пластину и процедите образцы в коллекционную пластину с помощью вакуумного насоса (контроль вакуумного давления на уровне 266,6-399,9 па).
- Приготовление белка G монолитных пластин
- Откажитесь от буфера хранения.
- Очистите монолитные пластины с 2 мл ультра-чистой воды, 2 мл 1x PBS, 1 мл 0,1 М formic кислоты, 2 мл 10x PBS, 2 мл 1x PBS (последовательно), и удалить текущую жидкость с помощью вакуумного насоса.
- Перенесите отфильтрованные образцы в монолитную пластину белка G для связывания и очистки IgG, затем очистите монолитные пластины 2 мл 1x PBS (повторите очистку 2x).
- Elute IgG с 1 мл 0,1 М фомиевой кислоты и фильтровать образцы в пластину сбора с помощью вакуумного насоса, а затем добавить 170 л 1 М бикарбонат аммония в коллекции пластины.
- Обнаружение концентрации IgG с помощью спектрофотометра поглощения (оптимальная длина волны - 280 нм).
- Откройте программное обеспечение и выберите режим белка-CY3.
- Нарисуйте 2 злители ультра-чистой воды и загрузите его в экран, затем нажмите Бланк в программном обеспечении, чтобы очистить экран (повторить 1x).
- Нарисуйте 2 злители ультра-чистой воды и загрузите ее в экран, затем нажмите Образец в программном обеспечении для обнаружения ультра-чистой воды.
- Нарисуйте 2 ЗЛ образца IgG и загрузите его в экран, а затем нажмите Образец в программном обеспечении, чтобы обнаружить образец.
- Нарисуйте 2 злители ультра-чистой воды и загрузите его в экран, затем нажмите Бланк в программном обеспечении, чтобы очистить экран.
- Закройте программное обеспечение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Формула для расчета концентрации IgG заключается в следующем:
Коэффициент поглощения CIgG и вымирания (13,7) x 1000 мкг/мл
- Положите извлеченный IgG высохнуть в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию и сохранить извлеченные IgG (300 л извлеченных IgG в течение 4 ч).
- Удалите 300 л извлеченных IgG, если концентрация превышает 1000 мкг/мл.
- Удалите 350 л извлеченных IgG, если концентрация составляет от 500 до 1000 мкг/мл.
- Удалите 400 л извлеченных IgG, если концентрация составляет от 200-500 мкг/мл.
- Удалите 600 л извлеченных IgG, если концентрация меньше 200 мкг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация IgG должна быть предпочтительно йgt;200 мкг/мл для последующего обнаружения. Среднее количество IgG должно быть предпочтительно йgt;1,200 мкг, которые могут быть проверены 2x в случае первого теста не удается.
- Очистка белка G монолитной пластины для повторного использования
- Вымойте тарелку 2 мл ультрачистой воды, 1 мл 0,1 МН НаОХ (для удаления осажденных белков), 4 мл сверхчистой воды и 4 мл 1x PBS (последовательно), затем удалить протекающую жидкость с помощью вакуумного насоса.
- Вымойте тарелку 2 мл ультрачистой воды, 2 мл 30% пропан-2-ol (для удаления связанных гидрофобных белков), 2 мл сверхчистой воды и 4 мл 1x PBS (последовательно), затем удалить протекающую жидкость с помощью вакуумного насоса.
- Вымойте тарелку с 1 мл буфера (20% этанола 20 Мм Трис 0,1 М NaCl) и добавить 1 мл буфера (20% этанола 20 Мм Трис 0,1 М NaCl) к пластине, а затем оставить пластину при 4 градусах по Цельсию.
2. Гликан релиз
- Подготовка сушеных IgG и хранить химические вещества, включая 1,33% SDS, 4% Igepal (хранить вдали от света), и 5x PBS на RT.
- Приготовьте фермент PNGase F, разбавив фермент 250 U с 250 л ультра-чистой воды.
- Денатурация IgG
- Добавьте 30 кл. 1,33% SDS и перемешайте путем вихря, перенесите образец в духовку 65 градусов по Цельсию в течение 10 минут, затем выньте его из духовки и дайте отдохнуть в течение 15 мин.
- Добавьте 10 qL 4% Igepal и поместите его на встряхивая инкубатор в течение 5 минут.
- Удаление и высвобождение гликанов
- Добавьте 20 кЛ 5x PBS и 30-35 Л 0,1 моль/L NaOH, чтобы регулировать рН 8,0, и смешивать путем вихря. Добавьте 4 qL фермента PNGase F и смешайте путем вихря. Затем, инкубировать 18-20 ч в водяной бане 37 градусов.
- Положите выпущенные гликаны высохнуть в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию на 2,5-3,0 ч.
- Сохранить освобожденных гликанов при -80 градусов до дальнейшего измерения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение. Ключом к высвобождению гликанов является повышение активности фермента PNGase F для максимизации его эффективности.
3. Гликанная маркировка и очистка
- Приготовьте 2-аминобензамид (2-АБ) с маркировкой реагента 0,70 мг 2-AB, 10,50 л уксусной кислоты, 6 мг цианоборогидрида натрия (NaBH3CN) и 24,50 л диметилового сульфоксида (DMSO) (общий объем 35 мл). Затем добавьте уксусную кислоту, 2-AB, и NaBH3CN в DMSO в порядке.
- Пометьте гликанов с помощью 35 злител 2-AB маркировки реагента, передать помеченные гликаны на осциллятор в течение 5 минут, передача в духовку в течение 3 ч при 65 градусов по Цельсию, затем передать на RT в течение 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Весь шаг маркировки гликанов должен быть выполнен в то время как защищены от света. - Предварительно пролечить фильтровальную пластину 0,2 мкм GHP с 200 йл 70% этанола, 200 л ультра-чистой воды и 200 л 96% ацетонитрила (4 кВ), затем удалить отходы с помощью вакуумного насоса.
- Очистка 2-AB помечены гликан
- Добавьте 700 л 100% ацетонитрила в 2-AB помечены гликан и передачи в встряхивая инкубатор в течение 5 минут.
- Центрифуга при 134 х г в течение 5 мин (4 кВ).
- Перенесите образец на фильтровальную пластину 0,2 мкм GHP в течение 2 мин и удалите фильтр (текущую жидкость) с помощью вакуумного насоса.
- Вымойте 2-AB помечены гликан с 200 зл 96% ацетонитрила (4 кВ) и удалить фильтрата (текущая жидкость) с помощью вакуумного насоса 5x-6x.
- Elute 2-AB помечены гликан с 100 зл и глот ультра-чистой воды 3x.
- Перенесите 2-AB помечены гликан в духовку, чтобы высохнуть при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 3,5 ч.
- Сохраните помеченные N-гликаны при -80 градусах По Цельсию до дальнейшего измерения.
4. Гидрофильные взаимодействия хроматографии и анализа гликанов
- Кондиционирование приборов UPLC и подготовка мобильных фаз
- Подготовка мобильных фаз, включая растворитель A: 100 мМ аммония formate (рН No 4,4), растворитель B: 100% ацетонитрил, растворитель C: 90% ультра-чистой воды (10% метанола), и растворитель D: 50% метанола (ультра-чистая вода).
- Откройте программное обеспечение для управления мобильными фазами.
- Вымойте приборы UPLC при скорости потока 0,2 мл/мин (50% растворителя В и 50% растворителя С), балансируя 30 мин, затем при скорости потока 0,2 мл/мин (25% растворителя А и 75% растворителя В) балансируя 20 мин, затем скорость потока 0,4 мл/мин балансировки.
- Растворите помеченные N-гликаны с 25 зл смеси 100% ацетонитрила и ультра-чистой воды в соотношении 2:1 (v/v). Затем центрифугу на 134 г в течение 5 мин (4 кВ) и загрузите 10 qL помеченных N-гликанов в инструменты UPLC.
- Отделите помеченные N-гликаны со скоростью потока 0,4 мл/мин с линейным градиентом от 75% до 62% ацетонитрила в течение 25 мин. Затем выполните аналитическую выползует dextran калибровочной лестницей/гликопептидной колонкой на UPLC при 60 градусах Цельсия (здесь образцы хранились при 4 градусах Цельсия до инъекции).
- Обнаружить N-гликанфлуоресценции при возбуждении и длины волны выбросов 330 нм и 420 нм, соответственно.
- Интегрируйте гликаны на основе пикового положения и времени удержания.
- Рассчитайте относительную стоимость каждого гликанского пика (GP)/ все гликанские пики (GPs) (в процентах, %) следующим образом: GP1: GP1/GPs-100, GP2: GP2/GPs-100, GP3: GP3/GPs-100 и т.д.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Как показано на рисунке 1, IgG N-гликанов были проанализированы в 24 первоначальных Пиков IgG гликанов (GPs) на основе пикового положения и времени удержания. N-гликан структуры доступны через обнаружение масс-спектрометрии в соответствии с предыдущим исследованием (Таблица 1)15. Для обеспечения сопоставимых результатов применялась общая нормализация площади, в которой количество гликанов в каждом пи...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
UPLC служит в качестве метода относительного количественного анализа5,15. Полученные результаты свидетельствуют о том, что UPLC является стабильной технологией обнаружения с хорошей воспроизводимостью и относительной количественной точностью. Количество гликанов в каждом пике выражается в процентах от общей интегрированной площади с использованием UPLC, которая является относительным значением. Относительная количественная оценка повышает сопоставимость тестовых ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (81673247 и 81872682) и Австралийско-китайский совместный грант (NH и MRC - APP11112767 -NSFC 81561128020).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2-аминобензамид, 2-AB | Sigma, Китай | ||
| 96-луночная сборная пластина | AXYGEN | ||
| 96-луночная фильтровальная пластина | Pol | 0,45 мкм GHP | |
| 96-луночная монолитная пластина | BIA Separations | ||
| 96-луночная пластина ротор | Eppendorf Co., Ltd, Германия | T_1087461900 | |
| уксусной кислотой | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Инкубатор с постоянным встряхиванием / коромысло | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, Китай | ZWY-10313 | |
| Калибровочная лестница для декстрана / Гликопептидная колонка | Watts technology Co., Ltd, Китай | BEH колонна | |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Sigma, Китай | ||
| Динатрийфосфат | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Китай | ||
| Электрические духовки | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Муравьиная кислота | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit Sigma | , China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, Китай | ||
| Высокоскоростная центрифуга | Eppendorf Co., Ltd, Германия | 5430 | |
| Igepal | Sigma, Китай | ||
| Низкотемпературная центрифуга | Eppendorf Co., Ltd, Германия | ||
| Низкотемпературный холодильник | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Коллектор 96-луночная пластина | Ваттс технология Co., Ltd, Китай | 186001831 | |
| Метанол | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Китай | ||
| Milli-Q счетчик чистой воды | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Китай | ||
| тестер PH | Sartorius Co., Ltd, Германия | PB-10 | |
| Фосфатный буферный раствор, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Германия | 4672100, 0,5-10μ L & 10-100&м; L & 20-200&м; L & 1000μ l | |
| PNGase F фермент | Sigma, Китай | ||
| Дигидрофосфат калия | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Китай | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Китай | ||
| SDS | Sigma, Китай | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Китай | ||
| Цианоборогидрид натрия (NaBH3CN) | Sigma, Китай | ||
| Спектрофотометр | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Переносная жидкая пушка | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, Китай | 4672100 | |
| Tris | Amresco, Америка | ||
| Сверхнизкотемпературный холодильник | Thermo Co., Ltd, Америка | МЛТ-1386-3-В; MDF-382E | |
| Сверхпроизводительная жидкостная хроматография | Watts technology Co., Ltd, | Китай Acquity MLtraPerformance LC | |
| Вакуумный насос | Watts technology Co., Ltd, Китай | 725000604 | |
| Испаряющая машина/сушилка | Eppendorf Co., Ltd, Германия | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, Китай | NP-30S | |
| Тестер инструментов на водяной бане | Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Весовые весы | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | МП200Б |
Ссылки
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392(2013).
- Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65(2018).
- Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598(2014).
- Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841(2013).
- Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779(2014).
- Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20(2014).
- Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235(2018).
- Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240(2017).
- Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379(2016).
- Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123(2018).
- Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501(2017).
- Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208(2010).
- Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111(2011).
- Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95(2000).
- Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963(2016).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
