Методическая статья

Характеристика индивидуальных белковых агрегатов с помощью инфракрасной наноспектроскопии и микроскопии атомной силы

DOI:

10.3791/60108

⸱

12 сентября 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2Institute of Biotechnology, Life Sciences Center, Vilnius University, 3Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем применение инфракрасной наноспектроскопии и атомной микроскопии высокого разрешения для визуализации процесса самосборки белка в олигомерные агрегаты и амилоидные фибрилты, которые тесно связаны с началом и развитием широкого спектра нейродегенеративных расстройств человека.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Феномен неправильного сворачивания и агрегации белка приводит к образованию высокоразногенных белковых агрегатов, которые связаны с нейродегенеративными состояниями, такими как болезни Альцгеймера и Паркинсона. В частности, низкий молекулярный вес агрегатов, амилоидных олигомеров, было показано, обладают общими цитотоксическими свойствами и причастны как нейротоксины во многих формах слабоумия. Мы иллюстрируем использование методов, основанных на атомной микроскопии силы (AFM) для решения сложной задачи характеристики морфологических, структурных и химических свойств этих агрегатов, которые трудно изучить с помощью обычных структурных методы или объемные биофизические методы из-за их неоднородности и преходящей природы. Подходы к микроскопии сканирования теперь способны исследовать морфологию амилоидных агрегатов с субнанометровым разрешением. Мы показываем здесь, что инфракрасная (ИК) наноспектрокопия (AFM-IR), которая одновременно использует высокое разрешение AFM и химическую силу распознавания ИК-спектроскопии, может пойти дальше и позволить характеристику структурных свойств отдельных белок агрегатирует, и таким образом предлагает проницательность в механизмы агрегации. Поскольку подход, который мы описываем, может быть применен также к исследованиям взаимодействий белковых сборок с небольшими молекулами и антителами, он может предоставить фундаментальную информацию для разработки новых терапевтических соединений для диагностики или лечения нейродегенеративных расстройств.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Более 40 миллионов человек во всем мире в настоящее время страдают от нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера (AD)1 и Паркинсона (PD)2 заболеваний. В более общем плане, более пятидесяти патологий связаны на молекулярном уровне с протеином misfolding и агрегации, процесс, который приводит к распространению нерастворимых фибриллярных белковых агрегатов, известных как амилоидные отложения3, 4. Молекулярное происхождение нейродегенерации и ее связи с белковыми конформанформашническими изменениями белков, приводящими к образованию амилоидов, однако, остаются неясными, в значительной степени из-за высокого уровня неоднородности, преходящей природы и наномасштаба размеры патологических агрегатов4,5.

Высоко успешные исследования белковых структур в последние несколько десятилетий были широко основаны на использовании массовых методов, включая рентгеновскую кристаллографию, криоэлектронную микроскопию и ядерную магнитно-резонансную спектроскопию5, 6 , 7 (г. , 8 , 9. В рамках этого класса методов, инфракрасная (ИК) спектроскопия стала чувствительным аналитическим инструментом, чтобы разгадать химические свойства биологических систем, таких как белки8. Методы ИК позволяют количественно освящать вторичные и четырехнорные структурные изменения во время их неправильного сворачивания и агрегации. Кроме того, для дальнейшей расшифровки на микроскопическом уровне механистических деталей, участвующих в сложных ландшафтах свободной энергии белка во время их агрегации, важным достижением стала разработка инструментов химической кинетики, которые будут распространяться на сложные самосборки пути, включая амилоидные фибрилиды формирования5,6,7,10,11,12. Однако массовые спектроскопические методы обеспечивают только среднюю информацию о неоднородном ансамбле видов, присутствующих в растворе или участвующих в конкретных микроскопических шагах, тем самым делая исследование биофизических свойств человека агрегированные виды, бросающие вызов на наноуровне13,14.

За последние десятилетия появилось несколько методов микроскопии, способных работать на масштабах меньше, чем предел дифракции света. Этот класс методов включает электронную микроскопию (EM) и атомную силовую микроскопию (AFM). В то время как сканирование электронной микроскопии (SEM) и трансмиссионная электронная микроскопия (TEM) обеспечивают двумерные (2D) изображения образца, AFM появился в последние десятилетия как мощный и универсальный метод для изучения трехмерных (3D) морфологий, как а также наномеханические свойства образца с субнанометровымразрешением13,14,15,16,18,19, 20 , 21 год , 22 Г. , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. Обоснование изучения агрегации белка через AFM является то, что этот подход позволяет исследования морфологии отдельных видов, присутствующих в решении13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. В частности, путем мониторинга образца в качестве функции времени, AFM позволяет иссмотреть эволюцию морфологии видов в образце, что позволяет следить и визуализировать пути формирования амилоидов23, 25,38,39,40,41,42. Кроме того, AFM позволяет количественно определить структурные параметры, такие как поперечные высоты и длины отдельных видов, присутствующих в растворе13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 г. , 46 , 47 год , 48. Однако, изучение одного биофизического свойства, такого как морфология, часто недостаточно при изучении неоднородных и сложных биологических систем. AFM, SEM или TEM методы визуализации сами по себе не легко выявить химические свойства неоднородных видов амилоидных агрегатов на наноуровне.

Основной прогресс в анализе неоднородных биологических образцов такого масштаба был сделан недавно с развитием и применением в области агрегации белка инфракрасной наноспектроскопии (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Этот инновационный метод использует сочетание пространственного разрешения AFM (1–10 нм) с химическим анализом ИК. Техника AFM-IR основана на измерении фототермального индуцированного резонансного эффекта, управляемого ИК-лазером, и на измерении теплового расширения образца, исследуемого по наконечнику AFM. Образец может быть освещен ИК-лазером непосредственно сверху или снизу в общем внутреннем отражении, так же, как и в обычной инфракрасной спектроскопии24,42,52,53 . ИК-лазер может пульсировать с типичными частотами в порядке сотен килогерц (1-1000 кГц) и настроен на широкий спектральный диапазон, как правило, между 1000-3300 см-1. Хотя лазерный источник охватывает область диаметром 30 мкм, пространственное разрешение метода AFM-IR номинально определяется диаметром наконечника AFM, который обнаруживает локальное тепловое расширение системы. AFM-IR хорошо подходит для изучения биологических образцов, потому что ИК-сигнал пропорционален их толщине до 1,1,5 мкм, и полученные спектры ИК, как правило, в согласии с соответствующими спектрами передачи FTIR13,54 ,55. По этой причине, установленные методы анализа в спектроскопии могут быть легко применены, такие как изучение химических сдвигов, изменение формы полосы и де-свертывания второй анализ производных52. В целом, сочетая пространственное разрешение AFM с химической силой распознавания ИК-спектроскопии, AFM-IR позволяет одновременно приобрести широкий спектр морфологических, механических и химических свойств образца на наноуровне.

Здесь мы иллюстрируем протокол для характеристики процесса агрегации белка, который использует сочетание in vitro флуоресценции анализы, с высоким разрешением AFM изображений и наномасштабных AFM-ИК. Этот комбинированный подход уже преуспел в предоставлении подробных результатов в изучении химических и структурных свойств отдельных микрокапель, образованных белковыми агрегатами, в изучении разделения фаз жидко-жидкого белка, а также в изучение неоднородности и биофизических свойств отдельных агрегированных видов на наномасштабе23,26,38,45,50,53, 56,57.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Агрегация анализы на флуоресценции пластины читателей

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный здесь протокол является примером того, как изучать агрегацию любого белка или пептида химической кинетикой. В частности, он описывает оптимизированный протокол для изучения агрегации пептида АЗ42, который участвует в начале и прогрессировании болезни Альцгеймера58,59. Аналогичный протокол может быть скорректирован и принят в сторону изучения агрегации любого белка или пептида.

  1. Получить очень чистый мономерный раствор Аз42 с помощью ионно-обмена и размера исключения хроматографии методы различать белковые фракции, содержащие A q42, и изолировать мономерную фракцию от других агрегированных форм АЗ42 получил58 , 59.
  2. Разбавить пептид АЗ42 в буфере фосфата натрия 20 мМ, 200 мкм ЭДТА при рН 8,058 до желаемой конечной концентрации в диапазоне от 1 кв.м,5 м/м, в трубках с низким уровнем связывания 1,5 мл. Образцы, собранные для измерений AFM, не должны содержать флуоресцентный краситель, используемый в агрегации (тиофлавин T, ThT), так как он может ввести артефакты во время осаждения образцов для анализа AFM. Таким образом, подготовьте трипликации двух идентичных решений: i) первого, содержащего мономерный АЗ42, чтобы следить за процессом агрегации AFM; ii) второй, содержащий мономерию АЗ42 с добавлением 20 ММ ТТ в качестве трассировщика для мониторинга кинетики агрегации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выполнять шаги 1.1 и 1.2 на льду. Эта процедура заключается в том, чтобы мономерное решение A'42 не агрегируется до тех пор, пока не будет инициировано в считывателе пластин. При обработке образцов, тщательное pipetting имеет важное значение, чтобы избежать введения любых пузырьков воздуха, которые могут повлиять на образец белка.
  3. Пипетка 80 л каждого образца в каждой скважине 96-ну хорошо, полурайонной пластины черного полистирола с четким дном и необязательными поверхностями.
  4. Запечатайте пластину фольгой, чтобы свести к минимуму испарение образца в течение агрегации.
  5. Уравновесите температуру считывателя пластин до 37 градусов по Цельсию.
  6. Настройка протокола агрегации для чтения измерений флуоресценции с фиксированными интервалами времени, на волне возбуждения 440 нм и длине волны выбросов 480 нм. Агрегация должна быть начата в потихих условиях.
  7. Вставьте пластину в считыватель пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно быть осторожным при обработке пластины, чтобы гарантировать, что агрегация не срабатывает до начала считывателя пластины. Используйте настройки регулировки усиления, чтобы обеспечить оптимальное считывание флуоресценции каждого образца.
  8. Начало измерения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент агрегации завершается, когда кривая сигмоидальной флуоресценции ThT достигает плато58.

2. Подготовка образцов для измерений AFM и nano-IR

  1. Клей высокого качества класса V1 слюды диск высокого качества магнитной нержавеющей стали диск с помощью клея вкладок или двусторонней лентой.
  2. Etch mica, поместив кусок клейкой ленты на поверхность слюды и снимая верхний слой слюды. Эта процедура позволит создать чистую, атомарно плоскую поверхность, подходящую для осаждения образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выгравированная поверхность должна быть однородной и гладкой.
    ВНИМАНИЕ: Не прикасайтесь и не дышите прямо над свежевыграстиной слюдой, так как это введет артефакты.
  3. Пауза/остановка измерения считывания пластин, чтобы собрать интересующую точку времени в процессе агрегации белка.
  4. Удалите герметичной фольги и соберите 10 qL aliquot образцов без ThT из колодца в 1,5 мл низкосвязных труб.
  5. Депозит 10 л образца на свежевыграстиную слюду. Для измерений AFM-IR образцы должны быть отложены на свежеубранном золотом субстрате.
  6. Инкубировать раствор на слюде в течение 1 мин, чтобы физорбация.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное время инкубации позволит лучше всасывания на поверхности, но может вызвать искусственную самоорганизацию и самосборку25. Чтобы избежать этих эффектов, спрей осаждения могут быть использованы25.
  7. Промыть три раза с 1 мл ультрачистой воды.
  8. Высушите под нежным потоком азота для измерения образца в воздушной среде.

3. AFM изображение морфологии белковых агрегатов

ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения морфологии могут быть выполнены как в контактном, так и в динамическом режиме, в следующих шагах последний описан, так как он уменьшает боковые силы для измерения 3D морфологии образца с высоким разрешением. Измерения AFM-IR будут проводиться в контактном режиме для повышения соотношения сигнала к шуму AFM-IR.

  1. Включите систему AFM по крайней мере за 30 минут до проведения измерений, чтобы система могла достичь тепловой устойчивости. Нажмите на настройку,а затем на зонд. В окне изменения зонда нажмите на Следующую, чтобы подготовиться кэтапу фокуса .
  2. Выключите переключатель луча AFM (если он включен). Разблокируйте замки dovetail, отключите голову от системы и в окне изменения зонда нажмите на Next.
  3. Установите кантилевер AFM на держатель зонда. Подключите голову к системе и заблокируйте замки dovetail.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные кантилеверы для изучения биологических образцов в динамическом режиме AFM имеют весеннюю постоянную диапазон еженедельника от 2-40 Нм -1 и радиус вершины в диапазоне от 2,8 нм14.
  4. Включите переключатель лазерного луча AFM и в окне изменения зонда щелкните дальше.
  5. В всплывающем окне нажмите на Нет, если тип кантилевера не изменился. Отрегулируйте оптические ручки выравнивания, чтобы найти кантилевер. Отрегулируйте фокус на кантилевер е и нажмите на Next.
  6. В всплывающем окне нажмите на Да, если основное внимание сосредоточено на кантилевере.
  7. Расположите лазерный луч в конце кантилевера, используя ручки, контролирующие положение лазера обнаружения. Максимальное общее количество сигнала, измеряемого фотодиодом из четырех квадрантов, по крайней мере, до 1 V с помощью ручек, контролирующих положение отклоняемого лазерного луча на позиции чувствительного фотодиода (PSPD). В окне изменения зонда нажмите на Следующий, а затем на Закрыть.
  8. Подождите 15 минут для кантилевера, чтобы достичь тепловой стабильности. При необходимости отредугните положение отклоняемого лазерного луча на PSPD.
  9. Нажмите на NCM SWEEP, выберите желаемую амплитуда колебаний, нажмите на Фаза использования, нажмите на авто и настроить кантилевер близко к максимуму своего первого свободного резонанса колебаний, который составляет примерно 300 кГц для кантилевер с пружинной константой 40 Н м-1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка кантилевера из максимума его свободного резонанса обеспечивает более высокую стабильность измерений14.
  10. Поместите образец на держатель образца. Выберите подходящие параметры изображения. Типичная скорость сканирования составляет 0,3-1,0 Гц для области сканирования 1 х 1 мкм2 до 5 мкм2. Типичное разрешение требуется между 256 х 256 и 1024 х 1024 пикселей. Нажмите на область сканирования, чтобы выбрать размер сканирования и число пикселей.
  11. Сосредоточьте оптический вид на образец. Нажмите на подход, чтобы приблизиться к поверхности образца. После того, как подход завершен нажмите на Лифт 100 мкм, чтобы подняться aFM наконечник 100 мкм над поверхностью образца. Нажмите Расширить оптическое изображение образца. Нажмите на панель Фокус-стейдж, чтобы сфокусировать представление на поверхности образца.
  12. Используйте стрелки для перемещения в области выборки интереса. Завладовайте поверхность, нажимая кнопку "Подход". Нажмите на кнопку Line Scan и проверьте, хорошо ли следует наконечник поверхности, при необходимости отрегулируйте точку набора.
  13. Начните визуализацию поверхности образца, нажав кнопку сканирования. Во время визуализации, чтобы избежать большой силы изображения и сохранить последовательность в независимых образцов, поддерживать постоянный режим фазовых изменений, не превышающих20 "42.
  14. Введите имя файла и выберите базовый каталог, где будет сохранено приобретенное изображение.

4. Инфракрасное наноспектроскопное измерение белковых агрегатов

  1. Включите систему AFM-IR и инфракрасный (ИК) лазер60 30-60 мин перед измерениями для тепловой стабилизации. Типичными лазерами для aFM-IR- приборов являются оптические параметрные осцилляторы (OPO) и квантовые каскадные лазеры (ККЛ).
  2. Откройте встроенное программное обеспечение для управления инструментом. Нажмите на файл, а затем на новый, чтобы открыть новый файл nanoIR. Нажмите кнопку инициализировать, чтобы начать систему AFM-ИК.
  3. Откройте крышку прибора и установите на системе AFM-IR кремниевое золотое покрытие с номинальным радиусом 30 нм и пружинной константой 0,2 Н/м для измерения образца в контактном режиме.
  4. Нажмите на нагрузку в разделе AFM зонд, а затем следующий. В фокусе на зонд раздел нажмите на стрелки, чтобы сосредоточить камеру на cantilever. В образке раздела XY движения,использовать стрелки, чтобы поместить поперечный воздух в конце кантилевера.
  5. Поверните ручки, контролирующие положение лазера обнаружения, чтобы позиционировать лазер в конце кантилевера. Поверните лазерные ручки, чтобы обнаружить и максимизировать сумму, измеренную четыре квадранта фотодиод значение nogt;3 V. Поверните ручку отклонения, чтобы настроить отклонение кантилевера до -1 V, а затем нажмите дальше. Закройте крышку инструмента.
  6. В разделе сосредоточьтесь на образце, используйте стрелки, чтобы сфокусировать камеру на образце. Затем, в образце раздела XY движения использовать стрелки для перемещения в области интереса образца и нажмите на подход и заниматься.
  7. В окне микроскопа выберите в качестве входов интересуемые каналы для картирования биофизических свойств образца. В частности, выберите высоту для морфологии, Amplitude 2 для поглощения ИК и частоту PLL для картирования контактного резонанса наконечника.
  8. В разделе сканирования AFM окна управления используйте те же параметры, что и в разделе 3 (т.е. скорость сканирования 0,1 х 1,0 Гц, между 256 x 256 и 1024 x 1024 пикселями). Выбирайте в качестве значения прибыли в соответствии с шероховатостью образца: интегральная I No 1'10 и пропорциональная P - 10-30. Затем нажмите на сканирование, чтобы получить карту морфологии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Морфология может быть аналогичным образом измерена в режиме динамического касания, но измерения AFM-IR выполняются здесь, в контактном режиме, чтобы иметь более высокие соотношения сигнала к шуму.
  9. После того, как отображение морфологии закончено, в окне микроскопа нажмите на карту высоты, чтобы расположить зонд в верхней части одного агрегата. Затем в разделе nanoIR окна управления, нажмите на начало ИК, чтобы осветить образец с ИК-лазером.
  10. Чтобы сфокусировать инфракрасный лазер на кантилевере, нажмите на оптимизацию. В этом окне, написать wavenumber, где образец будет иметь высокую абсорбцию и нажмите добавить. Для белка, типичное значение 1655 см-1. Нажмите на сканирование, чтобы найти положение ИК лазера и нажмите на обновление, чтобы выровнять свое положение с кантилевером. Закройте окно.
  11. В разделе общего наноир настройки, написать волнообразное число, где высокая абсорбция в относительном поле, как ожидается. Затем отключите опцию Band Pass Filter и посмотрите на показания счетчика и на быстрое преобразование Фурье (FFT) реакции кантилевера. В окне FFT переместить зеленый курсор, чтобы прочитать частоту резонанса кантилевера. Типичное значение FFT резонанса кантилеверов составляет около 300 кГц. Напишите это значение частоты резонанса в общем разделе в поле freq. centre и используйте фрек. окно 50 кГц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите лазерную мощность, которая является достаточно низкой, чтобы не насытить показания счетчика и иметь искажения в ответ елейтера и не перегревать образец.
  12. Нажмите на лазерное окно мелодии импульса, чтобы использовать резонансный расширенный режим. Выберите частотный центр 300 кГц, диапазон мелодий 50 кГц и цикл службы лазера 5%. Нажмите на приобретение подметать частоту импульса лазера. Используя курсор на графике, настроить лазерный импульс на частоту механической реакции теплового расширения образца, поглощающего ИК-свет. Затем выберите опцию PLL для мониторинга контактного резонанса между образцом и кончиком. Нажмите нулевую кнопку в окне PLL и тик позволяют отслеживать контактный резонанс образца-наконечника. Выберите цельный прирост I 0,5 и пропорциональный выигрыш P и 10. Закройте окно.
  13. Откройте снова окно оптимизации и найдите положение ИК-лазера, по крайней мере, 3 волновых числа, соответствующие основным абсорбционным полосам образца (миде-диапазон i-II-III) и по крайней мере по одной волновой номер для каждого чипа лазера.
  14. Нажмите на Инструменты ИК Фонная калибровка (ru) Новые. В окне выберите спектроскопическую область интереса (1800–1200 см-1 для изучения белковых образцов); выбрать ту же частоту пульса, что и в шаге 4.12, и цикл службы 5%; нажмите на быстрое приобретение и выберите скорость лазера, типичный диапазон для квантового каскадного лазера составляет от 20 до 500 см-1. Нажмите на приобретение для измерения ИК лазерного фона. Этот фоновый спектр будет использоваться для нормализации измеренных наномасштабных локализованных спектров. Закройте окно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если быстрый лазерный и резонанс расширенный режим не доступен, пропустить шаг 4.12 и выбрать ступенчатый спектр вместо быстрого в обоих фона и ИК-спектра приобретения окон. Однако единая совокупная чувствительность не будет достигнута.
  15. В настройках ИК-спектра выберите разрешение ИК-спектра между 1,4 см-1 и рядом средних средних частот, по крайней мере, 64x. Нажмите на приобретение для измерения наномасштабного локализованного ИК-спектра в белковом диапазоне (1800-1200 см-1).
  16. Чтобы приобрести наномасштабную химическую карту, выберите вариант ИК-изображения, выберите волну интереса (например, 1655 см-1 для мадин-диапазона I) и нажмите на сканирование в окне сканирования AFM.
  17. Как только отображение завершено, перейдите к файлу и сохраните измерения. Для анализа приобретенных карт морфологии, контактно-резонансной и химии, а также наномасштабных локализованных спектров используйте встроенное программное обеспечение для обработки изображений AFM. Спектры и изображения могут быть сохранены как файлы .csv или .axz для дальнейшего детального анализа с коммерческим программным обеспечением.

5. Обработка изображений и анализ поперечных измерений

  1. Плоские необработанные изображения14,17,19,41,42,59 с помощью встроенного программного обеспечения для обработки изображений AFM или коммерческого программного обеспечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Агрегаты должны быть замаскированы из расчета, чтобы избежать артефактов анализа и недооценки их измеренной высоты.
  2. Сгладить изображение на 0 порядка плоскости подходят вычитания.
  3. Сгладить изображение по плоскости, а затем линию за строкой в порядке1-й регрессии, второй шаг повторяется до тех пор, пока плоский базовый участок в профиле линии изображения не будет достигнут.
  4. Если образец очень переполнен, содержит исключительно высокие агрегаты или сканер лук артефакт присутствует, сгладить изображение с помощью2-й регрессии порядка подходят.
  5. Измерение агрегированной высоты и ширины от профиля линии, взятого перпендикулярно фибрильной оси14,17,19,41,42,59.
  6. Измерение длины фибрилки параллельно фибрильной оси14,17,19,41,42,59.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репрезентативный временной курс агрегации АЗ42, измеряемый по оценке флуоресценции ThT, показан на рисунке 1. Процесс агрегации обычно характеризуется сигмоидальной кривой, где фаза запаздывания первоначально наблюдается, и сопровождается крутой фазой роста, прежде чем кривая достигнет плато, когда равновесное устойчивое состояние достигает6,7 , 58. Важно обеспечить использование оптимизированного п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первым важным шагом в этом протоколе является подготовка мономерных белков, например, в случае решения АЗ42, описанного в шагах 1.1 и 1.2. Важно инициировать процесс агрегации из высоко чистого, мономерного раствора, так как наличие олигомерных или агрегированных видов может привести к плохой воспроизводимости кинетики агрегации58, и вызвать артефакты в AFM измерения (например, фибриллярные виды будут очевидны на начальных стадиях агрегации), что может привести к неправильной интерпретации данных....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Швейцарский национальный фонд науки (SNF) за финансовую поддержку (грант номер P2ELP2-162116 и P300P2-171219), Дарвинколледж, программа Erasmus для финансовой поддержки (грант номер 2018-1-LT01-KA103-046719-1540-P3) исследования, приведёвшие к этим результатам, получили финансирование от Европейского исследовательского совета в рамках Седьмой Рамочной программы Европейского союза (FP7/2007-2013) через грант ERC PhysProt (соглашение No 337969), Фонд Ньюмана (T.P.J.K.) и The Кембриджский центр по неиспужным заболеваниям (C.G., M.V., и T.P.J.K.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Система AFM-IR AnasysInstrumentsnanoIR 2 или 3Системы измерения теплового расширения в контактном и резонансном режиме
Corning 96-луночный Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS MicroplateCorning3881
Corning Microplate Алюминиевая уплотнительная лентаCorning6570
Двусторонние клейкие дискиAGAR ScientificAGG3347N
FLUOstar OmegaBMG Labtech415-101Тарелка
Слюдяной диск 10 мм V1AGAR ScientificAGF7013
Park NX10 AFM системаParkSystems N/AАтомно-силовой микроскоп
Утконос Ультраплоская золотая фишкаPlatypus TechnologiesAU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 кантилеверыPark SystemsPPP-NCHR-10
Пробирки с белком LowBind, 2,0 млEppendorf30108132
кантилеверы с золотым покрытием кремнияAnasys InstrumentsPR-EX-nIR2
SPM диски для образцов 12 ммAGAR ScientificAGF7001

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  2. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 1-21 (2017).
  3. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: A summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86, 27-68 (2017).
  5. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 384-396 (2014).
  6. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11, 252-272 (2016).
  7. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326, 1533-1537 (2009).
  8. Barth, A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767, 1073-1101 (2007).
  9. Fitzpatrick, A. W. P., et al. Atomic structure and hierarchical assembly of a cross- amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5468-5473 (2013).
  10. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9758-9763 (2013).
  11. Michaels, T. C. T., Lazell, H. W., Arosio, P., Knowles, T. P. J. Dynamics of protein aggregation and oligomer formation governed by secondary nucleation. Journal of Chemical Physics. 143, (2015).
  12. Šarić, A., Michaels, T. C. T., Zaccone, A., Knowles, T. P. J., Frenkel, D. Kinetics of spontaneous filament nucleation via oligomers: Insights from theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 145, 211926(2016).
  13. Ruggeri, F. S., Habchi, J., Cerreta, A., Dietler, G. AFM-based single molecule techniques: Unraveling the amyloid pathogenic species. Current Pharmaceutical Design. 22, 3950-3970 (2016).
  14. Ruggeri, F. S., Šneideris, T., Vendruscolo, M., Knowles, T. P. J. Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 664, 134-138 (2019).
  15. Iljina, M., et al. Nanobodies raised against monomeric α-synuclein inhibit fibril formation and destabilize toxic oligomeric species. BMC Biology. 15, 1-14 (2017).
  16. Schilling, C., et al. Sequence-Optimized Peptide Nanofibers as Growth Stimulators for Regeneration of Peripheral Neurons. Advanced Functional Materials. 1809112, 1-15 (2019).
  17. Chiki, A., et al. Mutant exon1 huntingtin aggregation is regulated by T3 phosphorylation-induced structural changes and crosstalk between T3 phosphorylation and acetylation at K6. Angewandte Chemie - International Edition. 56, 5202-5207 (2017).
  18. Sieste, S., et al. Water-dispersible polydopamine-coated nanofibers for stimulation of neuronal growth and adhesion. Advanced Healthcare Materials. 7, 1-11 (2018).
  19. De, S., et al. Different soluble aggregates of Aβ42 can give rise to cellular toxicity through different mechanisms. Nature Communications. 10, 1541(2019).
  20. Chang, K. C., Chiang, Y. W., Yang, C. H., Liou, J. W. Atomic force microscopy in biology and biomedicine. Tzu Chi Medical Journal. 24, 162-169 (2012).
  21. Variola, F. Atomic force microscopy in biomaterials surface science. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 2950-2959 (2015).
  22. Drolle, E., Hane, F., Lee, B., Leonenko, Z. Atomic force microscopy to study molecular mechanisms of amyloid fibril formation and toxicity in Alzheimer’s disease. Drug Metabolism Reviews. 46, 207-223 (2014).
  23. Ruggeri, F. S., et al. Identification and nanomechanical characterization of the fundamental single-strand protofilaments of amyloid α-synuclein fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7230-7235 (2018).
  24. Ruggeri, F. S., et al. Infrared nanospectroscopy characterization of oligomeric and fibrillar aggregates during amyloid formation. Nature Communications. 6, 1-9 (2015).
  25. Ruggeri, F. S., et al. Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Qamar, S., et al. FUS phase peparation is modulated by a molecular chaperone and methylation of arginine cation-π interactions. Cell. 173, 720-734 (2018).
  27. Habchi, J., et al. Cholesterol catalyses Aβ42 aggregation through a heterogeneous nucleation pathway in the presence of lipid membranes. Nature Chemistry. 10, 673-683 (2018).
  28. Sweers, K. K. M., Stöckl, M., Bennink, M. L., Subramaniam, V. Characterizing nanoscale morphologic and mechanical properties of α-Synuclein amyloid fibrils with atomic force microscopy. Bio-nanoimaging: Protein Misfolding & Aggregation. Uversky, V. N., Lyubchenko, Y. L. , London, UK. 309-322 (2014).
  29. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly Insights from scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 173, 1-13 (2011).
  30. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Devlin, G. L., Dobson, C. M., Welland, M. E. Analysis of structural order in amyloid fibrils. Nanotechnology. 18, (2007).
  31. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. , 6546-6561 (2016).
  32. Knowles, T. P. J., Oppenheim, T. W., Buell, A. K., Chirgadze, D. Y., Welland, M. E. Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins. Nature Nanotechnology. 5, 204-207 (2010).
  33. Knowles, T. P. J., Smith, J. F., Craig, A., Dobson, C. M., Welland, M. E. Spatial persistence of angular correlations in amyloid fibrils. Physical Review Letters. 96, 1-4 (2006).
  34. Knowles, T. P. J., et al. Twisting transition between crystalline and fibrillar phases of aggregated peptides. Physical Review Letters. 109, 158101(2012).
  35. Knowles, T. P., et al. Role of intermolecular forces in defining material properties of protein nanofibrils. Science. 318, 1900-1903 (2007).
  36. Smith, J. F., Knowles, T. P. J., Dobson, C. M., MacPhee, C. E., Welland, M. E. Characterization of the nanoscale properties of individual amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 15806-15811 (2006).
  37. Sokolov, D. V. Atomic force microscopy for protein nanotechnology. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 300, 323-367 (2013).
  38. Ruggeri, F. S., et al. Influence of the β-sheet content on the mechanical properties of aggregates during amyloid fibrillization. Angewandte Chemie - International Edition. 54, 2462-2466 (2015).
  39. Jeong, J. S., Ansaloni, A., Mezzenga, R., Lashuel, H. A., Dietler, G. Novel mechanistic insight into the molecular basis of amyloid polymorphism and secondary nucleation during amyloid formation. Journal of Molecular Biology. 425, 1765-1781 (2013).
  40. Adamcik, J., Mezzenga, R. Study of amyloid fibrils via atomic force microscopy. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 17, 369-376 (2012).
  41. Deguire, S. M., et al. N-terminal huntingtin (Htt) phosphorylation is a molecular switch regulating Htt aggregation, helical conformation, internalization, and nuclear targeting. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
  42. Ruggeri, F. S., et al. Nanoscale studies link amyloid maturity with polyglutamine diseases onset. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  43. Adamcik, J., et al. Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic force microscopy images. Nature Nanotechnology. 5, 423-428 (2010).
  44. Lin, Y. C., Komatsu, H., Ma, J., Axelsen, P. H., Fakhraai, Z. Quantitative analysis of amyloid polymorphism using height histograms to correct for tip convolution effects in atomic force microscopy imaging. RSC Advances. 6, 114286-114295 (2016).
  45. Mannini, B., et al. Stabilization and characterization of cytotoxic Aβ40 oligomers isolated from an aggregation reaction in the presence of zinc ions. ACS Chemical Neuroscience. , (2018).
  46. Medalsy, I., Hensen, U., Muller, D. J. Imaging and quantifying chemical and physical properties of native proteins at molecular resolution by force-volume AFM. Angewandte Chemie - International Edition. 50, 12103-12108 (2011).
  47. Dufrêne, Y. F., Martínez-Martín, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Müller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve–based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  48. Takai, E., et al. Scanning electron microscope imaging of amyloid fibrils. American Journal of Biochemistry and Biotechnology. 10, 31-39 (2014).
  49. Dazzi, A., et al. AFM-IR: Combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66, 1365-1384 (2012).
  50. Volpatti, L. R., et al. Micro- and nanoscale hierarchical structure of core-shell protein microgels. Journal of Materials Chemistry B. 4, 7989-7999 (2016).
  51. Galante, D., et al. A critical concentration of N-terminal pyroglutamylated amyloid beta drives the misfolding of Ab1-42 into more toxic aggregates. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 79, 261-270 (2016).
  52. Ruggeri, F. S., et al. Identification of oxidative stress in red blood cells with nanoscale chemical resolution by infrared nanospectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 19, 1-14 (2018).
  53. Ramer, G., Ruggeri, F. S., Levin, A., Knowles, T. P. J., Centrone, A. Determination of polypeptide conformation with nanoscale resolution in water. ACS Nano. 12 (7), 6612-6619 (2018).
  54. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and applications in nanoscale infrared spectroscopy and chemical imaging. Chemical Reviews. 117, 5146-5173 (2017).
  55. Lahiri, B., Holland, G., Centrone, A. Chemical imaging beyond the diffraction limit: experimental validation of the PTIR technique. Small. 9 (3), 439-445 (2013).
  56. Ansaloni, A., et al. One-pot semisynthesis of exon 1 of the huntingtin protein: New tools for elucidating the role of posttranslational modifications in the pathogenesis of Huntington’s disease. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (7), 1928-1933 (2014).
  57. Khalaf, O., et al. The H50Q mutation enhances α-synuclein aggregation, secretion, and toxicity. Journal of Biological Chemistry. 289, 21856-21876 (2014).
  58. Hellstrand, E., Boland, B., Walsh, D. M., Linse, S. Amyloid β-protein aggregation produces highly reproducible kinetic data and occurs by a two-phase process. ACS Chemical Neuroscience. 1, 13-18 (2010).
  59. Limbocker, R., et al. Trodusquemine enhances Aβ42 aggregation but suppresses its toxicity by displacing oligomers from cell membranes. Nature Communications. 10 (1), 225(2019).
  60. Lu, F., Belkin, M. A. Infrared absorption nano-spectroscopy using sample photoexpansion induced by tunable quantum cascade lasers. Optics Express. 19, 1902-1904 (2011).
  61. Jiao, Y., Schäffer, T. E. Accurate height and volume measurements on soft samples with the atomic force microscope. Langmuir. 20, 10038-10045 (2004).
  62. Müller, D. J., Engel, A. The height of biomolecules measured with the atomic force microscope depends on electrostatic interactions. Biophysical Journal. 73, 1633-1644 (1997).
  63. Heymann, J. B., Moller, C., Muller, D. J. Sampling effects influence heights measured with atomic force microscopy. Journal Of Microscopy-Oxford. 207, 43-51 (2002).
  64. Marinello, F., Balcon, M., Schiavuta, P., Carmignato, S., Savio, E. Thermal drift study on different commercial scanning probe microscopes during the initial warming-up phase. Measurement Science and Technology. 22, 9(2011).
  65. Marinello, F., Bariani, P., De Chiffre, L., Savio, E. Fast technique for AFM vertical drift compensation. Measurement Science and Technology. 18, 689-696 (2007).
  66. Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in AFM imaging (Clifton, N.J.). Methods in Molecular Biology. 242, 25-27 (2004).
  67. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. New York, NY. 31-43 (2011).
  68. Marinello, F., Carmignato, S., Voltan, A., Savio, E., De Chiffre, L. Error Sources in Atomic Force Microscopy for Dimensional Measurements: Taxonomy and Modeling. Journal of Manufacturing Science and Engineering. 132, 030903(2010).
  69. Ukraintsev, E., Kromka, A., Kozak, H., Reme, Z., Rezek, B. Artifacts in Atomic Force Microscopy of Biological Samples. Atomic Force Microscopy Investigations into Biology - From Cell to Protein. Frewin, C. L. , (2012).
  70. Tsukruk, V. V., Singamaneni, S. Scanning Probe Microscopy of Soft Matter: Fundamentals and Practices. , Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim, Germany. (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

AFM IR

Похожие статьи