Мы описываем наш протокол для измерения биологических ритмов в белковом катаболизме с помощью аутофагии и протеасомы в печени мыши.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение суточных ритмов в аутофагическом и протеасомальном потоке
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Клетки используют несколько методов переработки нежелательных белков и других материалов, в том числе лисосомальных и нелисосомальных путей. Основной лизосомы-зависимый путь называется аутофагией, в то время как основным нелизосомным методом белкового катаболизма является система убиквитин-протеаомы. Недавние исследования в модельных организмах показывают, что активность как аутофагии, так и системы убиквитин-протеасомы не является постоянной в течение дня, а вместо этого изменяется в соответствии с ежедневным (циркадным) ритмом. Способность измерять биологические ритмы в белковом обороте важна для понимания того, как достигается контроль качества клеток, и для понимания динамики конкретных белков, представляющих интерес. Здесь мы представляем стандартизированный протокол для количественной оценки аутофагического и протеасомального потока в виво, который фиксирует циркадный компонент текучести белка. Наш протокол включает в себя детали для обработки мышей, обработки тканей, фракционирования и аутофагической количественной оценки потока с использованием печени мыши в качестве исходного материала.
Введение
Циркадные ритмы относятся к ежедневным, предсказуемым изменениям в биологической функции, которые очевидны по всей природе. Они существуют на всех биологических масштабах, от макроскопических поведений, таких как циклы сна и бодрствования, до молекулярных явлений, таких как ритмическое изобилие биомолекул. В последние годы исследования циркадных ритмов были преобразованы открытием «генов часов», которые имеют решающее значение для поколения циркадного ритма. Исследования в часы гена нокаут мышей показали центральную роль для циркадных ритмов в временно организации основных клеточных процессов, таких как метаболизм1. Среди способов циркадных ритмов сделать это произошло путем придав височной структуры белка катаболизма.
Несколько групп, включая нашу показали, что два основных пути для клеточного белка катаболизма, аутофагии и убиквитин-протеасомы системы, подлежат суточные ритмы2,3,4,5. Аутофагия представляет лизосо-зависимую руку протеинового катаболизма, в которой белки, представляющие интерес, доставляются в эту универсательную органель либо через строительство нового везикула (макроавтофагия), либо через прямую транслокацию, хотя канал (chaperone опосредовано аутофагии)6. Убиквитин-протеасома система является основным не-лизосомный путь, где белки поли-убиквитина, а затем подается в протеасоме, макромолекулярной деградативной машины найти по всей цитоплазмы и ядра7,8. Ритмы в аутофагической и протеасомной активности имеют важное значение, поскольку они, вероятно, играют определенную роль в сотовой домашнего хозяйства. В результате, это ценно иметь стандартизированную процедуру, которая может обнаружить ежедневные колебания в катамализме белка, который совместим с доклиническими моделями болезней.
Здесь мы предоставляем наш протокол для количественной оценки суточных вариаций в аутофагном потоке в печени мыши, который послужил основой для работы в нашей лаборатории3,9. Наш метод классифицируется как "оборот ный"10, подход, используемый многочисленными группами для измерения протеолитической активности (или потока). При таком подходе ингибиторы протеазы, характерные для лизосомы или протеасомы, вводятся мышам, а затем образцы тканей получаются после фиксированного промежутка времени. Параллельно, образцы тканей получаются у мышей, подвергаемых фиктивным инъекциям. Образцы тканей гомогенизированы, а затем биохимически разделены для получения обогащенных лизоомами и цитоплазмических фракций. Эти фракции затем анализируются параллельно с помощью западных blotting с использованием антител, характерных для макроаутофагии маркеров (LC3b и p62) или протеасомальных субстратов (поли-убиквитинат белка). Со временем животные, вводимые ингибиторами протеазы, накапливают белки, которые обычно были переработаны. В результате, скорость оборота выводится путем сравнения обилия маркерных белков в протеаз-ингибитор обработанных образцов для фиктивных образцов. Повторяя этот метод с фиксированными временными интервалами в течение дня можно реконструировать циркадные вариации в протеолизах(рисунок 1A).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Описанный здесь протокол был одобрен Вашингтонским университетом в Сент-Луисе Комитетом по уходу за животными и использованию животных (IACUC).
1. Мышь жилищного и экспериментального дизайна
- Для обнаружения ежедневных ритмов в белковой текучести, домашние мыши (мужчины или женщины C57BL/6J, 4-8 недель, 20-25 г) в соответствии со стандартными 12 ч светлых/темных циклов с пищей при условии ad libitum. Чтобы избежать подчеркивания животных, акклиматизировать мышей, по крайней мере одну неделю в объекте до использования и избежать одного жилья. Для доказательства того, что ритмы в белковом катаболизме действительно циркадные (т.е. движимые внутренними биологическими часами животного), домашние мыши в постоянных темных условиях, заботясь, чтобы избежать воздействия мышей на экзогенный свет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о мыши жильядля циркадного ритма экспериментов см. - Для каждого момента, выделить три мышей в качестве фиктивного контроля и по крайней мере три мышей для каждого типа ингибитора протеазы используется (лейпептина для аутофагического потока и бортезомиб для протеасомальных измерений потока). План на шесть временных точек равномерно расположены на 4 ч интервалы в течение дня / ночи цикла для получения образцов тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: 24 ч, 6 время точки эксперимент с фосфат-буферной солей (PBS), лейпептина и бортезомиб потребует в общей сложности 54 мышей (3 за лечение х 3 лечения х 6 точек времени).
2. Подготовка гомогенизации решение, ингибитор фондовых решений, и флаконы для мыши печени коллекция
- Приготовьте свежий буфер гомогенизации (HB) и держите на льду: 10 мм Tris-HCl pH 7.5, 250 мМ сахароза, 5 мМ EDTA pH 8.0 и 1 таблетка ингибитора протеазы на 100 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: На одну мышь приходится около 10 мл HB. - Для обработки биологических образцов ниже по течению, каждый образец требует 15 мл конической трубки для хранения сырой гомегенат, 15 мл трубки для хранения постядерного супернатанта, два 1,5 мл микроцентрифуговых труб для хранения 3000 х г и 20000 х гранулированных материал, соответственно, и 1,5 мл микроцентрифуговой трубки для удержания цитоплазмической фракции. Добавьте 7 мл холодного HB к каждой трубке, предназначенной для сырой гомегенаты и держать на льду.
- Приготовьте 2 мг/мл бульонного раствора лейпептина геми-сульфата в стерильных PBS. Также приготовьте 50 мг/мл раствор бортезомиба в диметилсульфодоксид (DMSO). Aliquot и хранить решения при -80 градусах Цельсия.
3. Администрация ингибитора протеазы
- Оттепель леупептина (2 мг/мл) и бортезомиб (50 мг/мл) стоковых растворов до комнатной температуры 15 мин до каждой временной точки. Запас лейпептина готов к инъекциям. Разбавить бортезомиб в стерильных PBS, чтобы дать 50 мкг/мл рабочего раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бортезомиб светочувствительный, поэтому защитите рабочий запас от света до использования. - Взвешивать мышей и выполнять интраперитонеальные инъекции "фиктивных" PBS (0,5 мл), лейпептина (40 мг/кг) или бортезомиба (1,6 мкг/кг). Возвращение мышей в соответствующие отмеченные клетки, сгруппированные по типу инъекций, которые они получили. Запись времени мышей лечат или манипулировать в стандартизированной таблице (см. Дополнительный файл "Образец данных").
ПРИМЕЧАНИЕ: Калькулятор дозы включен в качестве помощи в дополнительном файле "Образец данных". Важно выполнять инъекции оперативно и в том же порядке от точки времени к временному минимуму, чтобы свести к минимуму изменчивость.
4. Приобретение и хранение тканей
- Через два часа после инъекции усыпляет мышей по одному в соответствии с утвержденным институционально протоколом IACUC. Например, анестезируют мышей, а затем эвтаназии путем вывиха шейки матки. Приступайке к этапу вскрытия сразу после эвтаназии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в полной анестезии до вывиха шейки матки, щипая передние лапы без наблюдаемого рефлекса. - Удалите левую дочку печени, сделав разрез 1,5-2,0 см ножницами Metzenbaum на брюшной брюшной полости мыши. Экстернизовать левую долбу печени и подрезать ее хирургическими ножницами. Погрузите образец печени в 7 мл ледяного HB в соответствующую коническую трубку 15 мл. Держите образец на льду на протяжении всей обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться на льду или при 4 градусах Цельсия на ночь перед началом работы. Если стандартные маркеры макроавтофагии и протеасомальной активности являются единственными предполагаемыми считывателями, образцы печени могут быть заморожены в жидком азоте и храниться при -80 градусов по Цельсию для последующей обработки. Для изучения других целей деградации (например, с помощью протеомики) обработайте образцы без замораживания. - Приступить к эвтаназии и вскрыть следующую мышь, пока все образцы не будут приобретены. Обработка мышей в том же порядке группы они были введены и записывать продолжительность этого шага (см. Дополнительный файл "Образец данных"). Каждая мышь должна быть обработана в менее чем 5 мин, чтобы ограничить разницу в времени воздействия для инъекционных ингибиторов.
5. Биохимическое фракционирование образцов печени
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1B показана схема фракционирования.
- Перенесите каждый образец печени и 7 мл HB в 15 мл мощности Dounce гомогенизатор. Гомогенизировать образец 10 штрихами рыхлого поршня и 15 штрихами плотного поршня. Верните результирующую грубую гомегенату в коническую трубку 15 мл, из нее возникла. Повторяйте до тех пор, пока все образцы печени не будут однородны.
- Спин сырой гомегенат образцов на 700 х г в течение 10 минут при 4 кв С, чтобы пеллеты ядер и мусора. Перенесите верхние 4 мл постядерного супернатанта(S1) в свежую коническую трубку 15 мл.
- Определите концентрацию белка фракции S1 с помощью Брэдфорда или bicinchoninic кислоты (BCA) анализы в соответствии с инструкциями производителя. Затем уравнять концентрации всех образцов до 2,1 мг/мл или к желаемой концентрации, добавляя свежий HB в S1, где это необходимо. Нормализованные образцы являются "Тотальный белок"(Tot) фракции. Для аналитических целей и улучшения качества, aliquot 500 л л.с. фракции Tot и храните при -80 градусах Цельсия.
- Перенесите 1,5 мл оставшейся фракции Тот в микроцентрифугую трубку и закрутите при 3000 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия. Передача 1 мл результирующего супернатанта(S2)в свежую микроцентрифуговую трубку и установить на лед.
- Аспирируйте оставшийся супернатант и промойте гранулы 3000 х г (3KP) дважды с 1,5 мл холодного HB. Гранулы 3KP могут храниться в сухих сухими при -80 градусах По течению, если ожидается протеомика ниже по течению. Если ожидается только западное промотирование, приостановите 3KP гранулы в 200 qL натрия dodecyl sulfate polyacrylamide гель электрофорез (SDS-PAGE) образец буфера(Таблица материалов) и кипятить при 95 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
- Спин S2 фракции на 20000 х г в течение 20 минут при 4 c. Перенесите полученный супернатант(S3) в свежую микроцентрифуговую трубку. S3 является цитоплазматной(Cyto) фракции. Для SDS-PAGE смешайте 150 злиц фракции Cyto с 50 qL 4x SDS-PAGE образец буфера и кипятите при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
- Аспирируйте оставшийся супернатант из гранул 20 000 х г (20KP)и дважды промойте 1,5 мл холодного HB. Гранулы 20KP могут храниться в сухих сухими при -80 градусах По течению, если ожидается протеомика ниже по течению. Если ожидается только западное промотирование, приостановите 20KP гранулы в 100 злицу буфера образца SDS-PAGE и кипятите при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
6. Западный Blotting Readout
- Для количественной оценки макроавтофагического и протеасомального потока через западный блоттинг, составьте запасной раствор очищенного GST-LC3b (2 мкг/мл), p62-His6 (2 мкг/мл) и Lys48 связанного полиубичина (K48-Ub, 50 мкг/мл) в 1x образце SDS-PAGE. После кипения при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 мин, aliquot и хранить при -80 градусов по Цельсию для использования в будущем.
- Во время SDS-PAGE, генерировать 6-точечную стандартную кривую стандартной белковой смеси путем последовательного разбавления 1:3 в 1x SDS-PAGE образец буфера. Загрузите 10 qL каждого стандартного образца кривой на 26 скважин 4-12% SDS-PAGE миди-гель, а затем заранее стандарты белка (Таблица материалов), коммерческий молекулярный стандарт веса.
- Для измерения аутофагического потока, загрузить 12 л образца 3KP в каждой скважине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предполагая, обман, bortezomib, и лейпептина лечения были сделаны и предполагая, 3 мышей за лечение, каждый раз точка должна состоять из 9 образцов. Таким образом, каждый миди-гель может вместить 2 точки времени плюс стандартная кривая и типичный эксперимент серии времени потребует 3 миди-гелей для считывания. - Для измерения протеасомального потока, нагрузка 12 л фракции Cyto в каждую скважину.
- Отдельные образцы белка SDS-PAGE и перенос на мембраны поливинилидена фтора (PVDF) с использованием стандартных протоколов. Если ожидается западное прометы для LC3b, передача гелей с использованием 20% метанол-содержащего буфера передачи. В противном случае, использовать 10% метанола-содержащих переноса буфера, поскольку это позволит более эффективно йенсотовой передачи высокого молекулярного веса белков видов.
- Выполните западное промотирование с помощью стандартных протоколов. Для анализа макроавтофагического потока, помарки мембраны, содержащие 3KP образцы с анти-p62 или анти-LC3b антител (1:1,000) на ночь при 4 градусах Цельсия. Для анализа протеасомального потока, помок мембраны, содержащие цито образцов с анти-Lys48 конкретных полиубиквитин (1:1,000) на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Изображение западных помарки с использованием стандартных вторичных антител и устройств визуализации. Изображение всех мембран, которые представляют собой данный эксперимент временных рядов вместе.
7. Анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите дополнительный файл "Образцы данных".
- Для выполнения денситометрии на западных образцах помот, используйте стандартное графическое программноеобеспечение, Image Studio, или в качестве альтернативы ImageJ.
- Выполняйте денситометрические измерения на полосах, представляющих интерес как для стандартной кривой, так и для экспериментальных образцов. В Image Studio, используя p62 в качестве примера, нарисуйте длинный прямоугольник, охватывающий мономер белка внизу и простирающийся к верхней части мембраны. Копировать, вставить и переместить прямоугольник в оставшиеся образцы. Важно, чтобы прямоугольник использовался для количественной оценки, согласовывая между образцами.
- Сохранить количественную оценку в электронной таблице, нажав на таблицу отчета и запуска в правом нижнем углу окна анализа.
- Создайте денситометрическую стандартную кривую с электронной таблицей с использованием последовательно разбавленного стандартного образца и используйте либо линейную, либо полиномальную регрессию для получения наилучшего стандартного уравнения кривой. Используя это уравнение, экстраполировать количество p62, LC3b-II или Lys48-поли Уб в экспериментальных образцах.
- Для получения измерений потока вычесть экстраполированный белок каждого ингибитора обработанных образцов из среднего значения образцов PBS из той же временной точки (см. Дополнительный файл "Образец данных").
- Оцените статистическую значимость временных колебаний текучести белка с помощью 1-way ANOVA. Это может быть сделано с помощью стандартного программного обеспечения электронной таблицы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Репрезентативные данные представлены на рисунке 2A,B, и количественная оценка этих данных представлена на рисунке 2C,D (см. также дополнительный файл "Образец данных"). Для простоты мы не изобразили элементы управления погрузкой на рисунке 2, но они должны быть получены параллельно. Как правило, западные помарки против З-актина используются для этой цели, но общего белка пятно (напр...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наш протокол описывает технически простое средство измерения биологических ритмов в белковой обороте у мышей с использованием широко доступного оборудования молекулярной биологии. Из-за продолжительности экспериментов серии времени и количества биологических образцов, участвующих, важно быть последовательным на протяжении всего эксперимента в отношении того, как мышей вводят, сроки приобретения тканей и биохимической обработки Образцы. Инъекции, эвтаназия и вывих шейки матки могут потребовать от оператора практики до нач...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа финансировалась ЗА счет RO1HL135846 и гранта Института развития детей (PD-II-2016-529).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 4x SDS PAGE Буфер для образцов | Invitrogen | Cat# NP0008 | |
| Bortezomib | EMD Millipore | Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7 | |
| Image Studio | LICOR | N/A | |
| Immobilon-FL PVDF мембрана 0,45 мкм | Merck Millipore Ltd | Cat# IPFL00010 | |
| K48-linkage специфический полиубиквитин (D9D5) Технология передачи сигналов кроличьих mAb | клеток | Cat#8081S; RRID:AB_10859893 | |
| LC3a | Boston Biochem | Cat# UL-430 | |
| LC3b антитела | Novus | Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146 | |
| Технология клеточной сигнализации | антител LC3b | Cat#2775; RRID:AB_915950 | |
| Леупептин | Сигма | Кат# L2884; CAS: 103476-89-7 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | Cat# WG1403BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Fisher Scientific | Cat# NP0007 | |
| P62-his | Novus | Cat# NBP1-44490 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | Cat# 1610373 | |
| Кролик Anti-p62/SQSTM1 | Millipore-Sigma | Cat#P0067; RRID:AB_1841064 | |
| rhPoly-Ub WT (2-7) (K48) | Boston Biochem | Cat# UC-230 | |
| SDS-PAGE Midi-size Gels | Invitrogen | Cat# WG1403 | |
| SIGMAFAST Ингибитор протеазы таблетки | Millipore-Sigma | Cat# S8830 |
Ссылки
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. The meter of metabolism. Cell. 134 (5), 728-742 (2008).
- Ma, B. Y., et al. LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages. Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).
- Ryzhikov, M., et al. Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy. Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).
- Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
- Desvergne, A., et al. Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts. Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Ciechanover, A. Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting. Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).
- Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
- Haspel, J., et al. Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay. Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Phenotyping Circadian Rhythms in Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).
- Hughes, M. E., et al. Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms. Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
