Характеристика функционально связанных miRNAs в глиобластоме и их инженерии в искусственные кластеры для генной терапии

Vivek Bhaskaran; Pierpaolo Peruzzi

doi:10.3791/60215

Методическая статья

Характеристика функционально связанных miRNAs в глиобластоме и их инженерии в искусственные кластеры для генной терапии

DOI:

10.3791/60215

⸱

4 октября 2019 г.

Vivek Bhaskaran¹ , Pierpaolo Peruzzi¹

¹Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital-Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описан описано здесь протокол для характеристики модулей биологически синергетических miRNAs и их сборки в короткие трансгены, что позволяет одновременно переэкспрессии для применения генной терапии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биологическое значение микроРНК (миРНК) в здоровье и болезни в значительной степени зависит от конкретных комбинаций многих одновременно дерегулированных миРНК, а не на действие одной миРНК. Характеристика этих конкретных модулей miRNAs является фундаментальным шагом в максимизации их использования в терапии. Это чрезвычайно актуально, потому что их комбинаторные атрибуты могут быть практически использованы. Описано здесь метод определения конкретной подписи miRNA, относящейся к контролю онкогенных хроматиновых репрессоров при глиобластоме. Подход сначала определяет общую группу miRNAs, которые дерегулированы в опухолях по сравнению с нормальной ткани. Анализ дополнительно уточняется дифференциальными условиями культуры, подчеркивая подгруппу миРНК, которые одновременно выражаются в конкретных клеточных состояниях. Наконец, miRNAs, которые удовлетворяют эти фильтры объединяются в искусственные полицистронные трансгены, которая основана на эшафот естественно существующих генов miRNA кластеров, а затем используется для переэкспрессии этих модулей miRNA в принимающих клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miRNAs предлагают непревзойденную возможность для развития широкого подхода генной терапии ко многим заболеваниям^1,^2,^3,включая рак^4,⁵. Это основано на нескольких уникальных особенностей этих биологических молекул, в том числе их небольшой размер^6,простой биогенез⁷, и естественная тенденция к функции в ассоциации⁸. Многие заболевания характеризуются специфическими шаблонами выражения миРНК, которые часто сходятся на регуляции сложных биологических функций^9. Цель этого метода заключается в том, чтобы сначала определить стратегию для выявления групп miRNAs, которые синергетически актуальны для конкретных клеточных функций. Следовательно, в нем обеспечивается стратегия восстановления таких комбинаций miRNA в исследованиях и приложениях ниже по течению.

Этот метод позволяет осуществлять функциональный анализ нескольких миРНК одновременно, используя их одновременное таргетирование большого количества мРНК, тем самым подизнося сложные ландшафты болезней. Этот подход был недавно использован для определения группы из трех miRNAs, что 1) одновременно downregulated в рак мозга и 2) показать сильную модель совместного выражения во время нервной дифференциации, а также в ответ на генотоксический стресс от радиации или Агент алкилирования ДНК. Комбинаторный повторное выражение этого модуля из трех miRNAs метод кластеризации описано ниже приводит к глубокому вмешательству в биологии раковых клеток и может быть легко использован в качестве стратегии генной терапии для доклинических исследований¹⁰. Этот протокол может представлять особый интерес для тех, кто участвует в исследованиях miRNA и его трансляционных приложениях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Характеристика функционально связанных miRNAs в Глиобластоме

Анализ широкого дифференциального выражения miRNA при глиобластоме по сравнению с мозгом
1. Во-первых, определить наиболее существенно дерегулированных miRNAs в опухоли. Это может быть достигнуто с помощью по крайней мере трех различных методов:
  1. Шахта атлас генома рака, найденный в https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, для секвенирования данных¹¹.
  2. Выполните анализ микроаррей из свежего оперативного образца¹².
  3. Используйте ранее опубликованные наборы данных¹³.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Какой бы метод ни был выбран, выход обеспечивает массовый набор miRNAs, выражение которых статистически коррелирует (прямо или обратно) с биологией опухоли. Эта начальная группа представляет собой пул miRNAs, которые дополнительно анализируются для идентификации подмножества miRNAs, отображающих наиболее строгую функциональную ассоциацию, выполняя более динамичный анализ изменений выражения, как обсутна ниже.
Анализ экспрессии miRNA, специфичный для условий
1. Индукция клеточной дифференциации:
  1. Используйте предварительно покрытые поли-D-лизин (PDL) пластиковые блюда в пользу формирования монослойной культуры. Для покрытия посуды растворите PDL в воде при концентрации 100 мкг/мл. Используйте 1 мл раствора на 25 см²поверхности. Промыть 2x с PBS 6 ч после применения решения PDL.
  2. Плита человеческих нервных стволовых клеток в равных количествах (100000 клеток / 5 мл) либо в стволовых клетках (нейробазальная среда B27 дополнение 20 нг/мЛ EGF/FGF), астроцитарная дифференциация среды (DMEM - 10% FBS), либо нейронной дифференциации среды (нейробазальная среда B27 добавка, 2 мм ретинойной кислоты)¹⁴. Протокол для дифференциации олигодендроцитов требует добавления IGF-1 (200 нг/мл) после удаления EGF/FGF^14,¹⁵.
  3. После клеточного покрытия, поместите в инкубатор в течение 1 недели при 37 градусах Цельсия, 5% CO₂.
2. Извлечение РНК:
  1. Через 7 дней удалите клетки из инкубатора и удалите среду.
  2. Вымойте клетки с помощью PBS (5 мл). Затем добавьте 1 мл лизисного реагента (см. Таблица Материалов),чтобы линзировать клетки и соскребать клетки в 1,5 мл микрофуга трубки с помощью клеточного скребок. Держите трубки, содержащие лисидные клетки при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
  3. Приступить к полной изоляции РНК в соответствии с инструкциями производителя.
3. анализ экспрессии miRNA:
  1. Количественное дифференциальное выражение конкретных miRNAs определены в шаге 1.1 среди трех моделей дифференциации в режиме реального времени PCR, используя зонды TaqMan и следуя протоколам производителя для обратной транскрипции и pcR усиления ( Рисунок 1).
Проверка кластеров miRNA с помощью стрессовых проблем
1. Культура G34 глиобластомы стволовых клеток в нейробазальной среде B27 дополнения 20 нг /мЛ EGF / FGF. Начните с 1 х 10⁶ клеток в 5 мл в 25 см² низкой колбе крепления.
2. Начиная с 48 ч после покрытия, добавить удвоение концентрации ДНК алкилятинг агента темозоломид (ТМЗ) каждые 5 дней, а именно:
  1. Начните с 5 мкм в течение 5 дней. Через 5 дней, удалить среду и заменить свежей среде без темозоломид, чтобы выжившие клетки, чтобы восстановиться. После 48 ч добавьте 10 мкм ТМЗ и инкубинуте еще 5 дней.
  2. Повторите шаг 1.3.2.1, удваивая концентрацию ТМЗ каждый раз, пока не будет достигнута концентрация не менее 100 мкм и клетки не станут устойчивыми к препарату^10.
3. В параллельном эксперименте облучают клетки G34 следующим образом:
  1. Начиная с 48 ч после покрытия 1 х 10⁶ клеток в 5 мл в 25 см² низкой колбы крепления, облученные клетки с 2 Gy энергии (любой облучение, обеспечивающее фотонные выбросы является приемлемым). Верните клетки в инкубатор и не мешайте. После 48 ч, облучать клетки снова с дополнительными 2 Gy энергии.
  2. Повторите шаг 1.3.3.1 4x до тех пор, пока не будет введено в общей сложности 10 Ги энергии.
  3. Верните клетки в инкубатор и дайте им восстановиться в свежей среде, по крайней мере за 5 дней до анализа ниже по течению.
4. После индукции сопротивления, лиза клетки с помощью лиза реагента и экстракт общей РНК в соответствии с протоколом производителя.
5. Проанализируйте экспрессию конкретных miRNAs, выявленных в разделах 1.1-1.2, описанных в шаге 1.2.1(Рисунок 2).
Характеристика функциональной конвергенции кластерных миРНК
1. Получить прогнозируемый таргеттом каждого miRNAs, определяемый в разделах 1.2-1.3, полученных с помощью инструментов прогнозирования миРНК.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы прибегаем к TargetScan, так как его алгоритм периодически обновляется¹⁶. Дополнительные инструменты прогнозирования miRanda¹⁷, miRDB¹⁸, и DIANA-miRPath¹⁹. Все эти программы являются бесплатными, веб-приложений.
  1. На первой странице Targetscan выберите miRNA, представляющий интерес, из предварительно заселенного меню drop-down. Нажмите кнопку Отправка.
  2. Скачать полученный список целей в виде электронной таблицы с помощью ссылки таблицы загрузки (Дополнительная диаграмма 1).
  3. Чтобы уменьшить вероятность ложноположительных прогнозов, включите только цели в столбец сохраненных сайтов в анализы ниже по течению. Кроме того, дальнейшая строгость может быть получена с помощью дополнительных программ прогнозирования miRNA (см. выше) и только включая цели, которые являются общими для всех алгоритмов.
2. Классифицировать результирующих targetomes в соответствии с Ген онтологии категорий с помощью ToppGene Suite²⁰ для оценки обогащения путей, которые являются общими для каждого miRNA.
  1. Вставьте список целей, полученных от шага 1.4.1 в окне "Учебный набор генов", используя символ HGNC в качестве типа входа. Нажмите Отправить Программа предоставит таблицу вывода, показывающую наиболее значимые категории "Go" для введенного списка генов(Дополнительная диаграмма 2).
3. Чтобы, наконец, установить вклад каждого miRNA в регулирование общего пути или клеточного процесса (в данном случае, регулирование хроматина), проверьте каждый таргеттом, полученный в шаге 1.4.1 против полного списка генов, участвующих в конкретном клеточном процессе ( т.е. регулирование хроматина), используя функцию диаграммы Венна, представленную на веб-сайте биоинформатики и эволюционной геномики http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Эта программа позволяет пересечение нескольких групп в то же время(рисунок 3). Конкретные уникальные цели, предоставляемые каждой miRNA затем аннотируются и отбираются для вниз по течению функциональных экспериментов.
  1. На первой странице программы, загрузить или скопировать / вставить список, если целевые мРНК для каждого miRNA или интерес к соответствующим окнам. Назовите каждый список уникальным идентификатором.
  2. Нажмите Отправить. Программа обеспечит визуальный выход диаграммы Венна с числом генов в каждом секторе, а также полный список мРНК для каждого поднабора и пересечения комбинаций.

2. Сборка модулей miRNA в полицистронный трансгенный кластер

Приготовление трансгенных эшафотов на основе кластерного локуса miR-17-92
1. Получить нуклеотидную последовательность скопления miR-17-92 из браузера генома Ensembl^21. Выберите базовую пару 800 фунтов ,основной" последовательности, охватывающей все шесть закодированных шпильки miRNA локуса и по крайней мере 200-нуклеотидных фланговых последовательностей как вверх по течению (5') и вниз по течению (3') основной последовательности.
2. Вставьте последовательность выше в любую программу редактирования слов.
3. Определите последовательность каждого из шести родных шпильок, извлекая их в miRBase^22. Отметьте каждую из этих последовательностей в пределах диапазона ранее идентифицированной последовательности «ядра». Любые последовательности между каждой шпилькой представляют собой последовательности прокладки, которые важны для правильной обработки трансгена.
4. Удалите родные последовательности шпильки из "основной" последовательности, за исключением 3-5 нуклеотидов на 5' и 3'концах каждой шпильки, которая будет служить в качестве приемца для новых шпильки.
Строительство нового трансгена, кодирующего несколько miRNA выбора
1. Получение шпильки последовательности miRNAs предназначен быть overexpressed в трансгене от miRBase. Внимательно обратите внимание на конкретные нуклеотиды, которые являются местами расщепления микропроцессоров.
2. Замените удаленные шпильки (шаг 2.1.4) шпильками последовательностей желаемых миРНК, полученных в шаге 2.2.1.
3. Добавление желаемых последовательностей ограничений в обоих фланговых областях трансгена, чтобы облегчить подклонирование в векторы доставки выбора. Убедитесь, что выбранные последовательности ограничений не присутствуют в самой последовательности.
4. Для отрицательного контроля используйте 20 нуклеотидные последовательности, чтобы заменить естественную 20-нуклеотидную последовательность каждой зрелой миРНК. Создайте эти скремблированные последовательности с помощью онлайн-инструмента, такого как https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
Проверка двумерной структуры трансгена
1. Копировать полную трансгенную последовательность в RNA структуры прогнозирования программы RNAweb Fold²³.
2. Используя стандартные настройки программы, нажмите Proceed.
3. Проанализируйте графический выход, особенно на наличие четко определенных шпильок и наличие двухцепочечных стволовых структур по крайней мере 11 нуклеотидов, приближенных к месту расщепления микропроцессора. Кроме того, посмотрите на отсутствие ветвления точек в шпильке последовательности(Рисунок 4).

3. Получение Трансгенов путем синтеза ДНК

После проектирования и силико проверки кластера химерных miRNA, получить рабочую последовательность с помощью синтеза ДНК от коммерческих поставщиков²⁴ и приступить к вниз по течению клонирования в векторы и трансгенной доставки. Мы использовали лентивирусные векторы для доставки in vitro¹⁰ и адено-ассоциированных вирусов (AAVs) для внутричерепной доставки in vivo^25.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод позволил характеристику модуля из трех miRNAs, которые последовательно downregulated в опухолях головного мозга, которые совместно выражены специально во время дифференциации нейронов (Рисунок 1) и участвует в реакции выживания опухоли после терапии(рисунок 2). Это достигается путем регулирования сложного онкогенного хроматина репрессивного пути. Эта модель совместного выражения предложила сильную синергетической актив...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол основан на том, что вместо того, чтобы функционировать в изоляции, miRNAs биологически актуальны, работая в группах, и эти группы транскрипционно определяются конкретными клеточными контекстами²⁶. Для обоснования такого подхода с точки зрения перевода вводится протокол наблюдения, позволяющий воссоздать эту многомиРНК-модель в клетках/тканях. Это возможно, воспользовавшись относительно простым биогенезом miRNAs, при котором распознавание характерной шпильки miRNA микропроцессором нео...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не сообщают о конфликте интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить членов Лаборатории нейроонкологии Харви Кушинга за поддержку и конструктивную критику. Эта работа была поддержана NINDS гранты K12NS80223 и K08NS101091.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,4% низкая температура плавления агарозы	IBI Scientific	IB70058
0,45 & микро; M стерильный фильтрующий блок	Merck Millipore	SLH033RS
1,5 мл Микроцентрифужная пробирка	Eppendorf	22431081
6-луночные планшеты	Greiner Bio-One	657160
Атимические мыши (FoxN1 nu/nu)	Envigo	069(nu)/070(nu/+)
B-27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	12587010
Колба для клеточных культур	Greiner Bio-One	660175
Скребок для клеток, 16 см	Облучатель Sarstedt	83.1832
Цезий 137	JL Sheperd and Associates	Core Facility (Гарвардская медицинская школа)
Хлороформ	Sigma-Aldrich	439142-4L
DMEM, высокий уровень глюкозы, пируват	Thermo Fisher Scientific	11995040
Dulbecco' s фосфатно-солевой буфер	Gibco	14190144
раствор Eosin Y	Sigma-Aldrich	E4009
Фетальная бычья сыворотка	Sigma-Aldrich	F9665
Раствор формалина	Sigma-Aldrich	HT501128
добавка GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEK-293	American Type Culture Collecti	ATCC CRL-1573
Раствор гематоксилина	Sigma-Aldrich	1051750500
первичных стволовых клеток глиомы человека (GBM62)			Предоставлено доктором Э. А. Чиокка (Brigham and Women' s Hospital, Бостон, Массачусетс)
Первичные стволовые клетки глиомы человека (MGG4)			Предоставлено доктором Хироаки Вакимото (Массачусетская больница общего профиля, Бостон, Массачусетс)
Лентивирусный вектор pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP	System Biosciences	CD511B-1
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
Микроцентрифуга охлаждаемая	Eppendorf	модель No 5424 R, каталожный No 5404000138
Монтажная среда	Thermo Fisher Scientific	4112APG
Высокоскоростные поликарбонатные трубки для центрифуги с круглым дном	Thermo Fisher Scientific	3117-0380PK
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	2000c
Нейронные клетки-предшественники (NPC)			Предоставлено доктором Якубом Годлевски (Brigham and Women' Больница, Бостон, Массачусетс)
Нейробазальная среда	Thermo Fisher Scientific	21103049
Nikon eclipse Ti моторизованная система флуоресцентного микроскопа	Nikon, Япония	14314
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985088
ПЦР пробирки	Sigma-Aldrich	CLS6571-960EA
Пенициллин-стрептомицин	Thermo Fisher Scientific	15140122
чашки Петри 94/16	Greiner Bio-One	632180
Поли-D-лизин	Sigma- Aldrich	P4707
Рекомбинантный человеческий EGF	ПепроТех	AF-100-15
Рекомбинантный человеческий FGF-basic	ПепроТех	AF-100-18B
Ретиноевая кислота	Gibco	12587-010
Набор для миниподготовки РНК	Direct-zol	R2050
S1000 Термоамплификатор	Bio-Rad	1852196
микрооблучатель для мелких животных с визуальным контролем	Xstrahal Life Sciences, Великобритания	Основное предприятие (Институт рака Дана-Фарбер, Бостон, Массачусетс)
Ультрацентрифуга Sorvall WX+	Thermo Fisher Scientific
StemPro Accutase	Thermo Fisher Scientific	A1110501
система ПЦР в реальном времени StepOne	Applied Biosystems
Шкаф биобезопасности SterilGARD	The Baker Company	SG403A-HE
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
T98-G	American Type Culture Collecti	ATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	4366596
TaqMan Универсальная мастер-смесь для ПЦР	Thermo Fisher Scientific	4324018
Темозоломид	Tocris Bioscience	2706
Tissue-Tek оптимальная температура резки	Научный	NC9636948
Fisher TRIzol Reagent	Реактив Thermo Fisher Scientific	15596026	Lysis
U251-MG	American Type Culture Collecti	ATCC HTB-17
U87-MG	American Type Culture Collecti	ATCC HTB-14
ViraPower Lentivector Expression system	Thermo Fisher Scientific	K4970-00
Вода, ВЭЖХ марки	Fisher	W54
Ксилол	Сигма-Олдрич	534056

750001004376357

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).
Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767(2018).
Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442(2019).
Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044(2009).
Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005(2015).
Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
Aken, B. L., et al. Ensembl 2017. Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).
Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
Lorenz, R., et al. Vienna RNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26(2011).
Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812(2017).
Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437(2011).
Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Характеристика функционально связанных miRNAs в глиобластоме и их инженерии в искусственные кластеры для генной терапии

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи