Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Протокол на основе FACS для изоляции РНК из вторичных клеток Дрозофилы Мужской Аксессуар Glands

6.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60218

⸱

5 сентября 2019 г.

 ,  , 
1Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для разъединения и сортировки определенной популяции клеток из самцов вспомогательных желез Дрозофилы (вторичных клеток) для секвенирования РНК и RT-qPCR. Изоляция клеток осуществляется путем очистки FACS вторичных клеток GFP-выражения после многоступенчатого процесса диссоциации, требующего вскрытия, пищеварения протеаз и механической дисперсии.

Аннотация

Чтобы понять функцию органа, часто полезно понять роль его составных популяций клеток. К сожалению, редкость отдельных популяций клеток часто затрудняет получение достаточного количества материала для молекулярных исследований. Например, вспомогательная железа мужской репродуктивной системы Дрозофилы содержит два различных типа секреторных клеток. Основные клетки составляют 96% секреторных клеток железы, в то время как вторичные клетки (SC) составляют оставшиеся 4% клеток (около 80 клеток на мужчину). Хотя оба типа клеток производят важные компоненты семенной жидкости, только несколько генов, как известно, специфичны для SCs. Редкость SCs, до сих пор, препятствует транскриптомического анализа исследования этого важного типа клеток. Здесь представлен метод, позволяющий очищать SCs для извлечения РНК и секвенирования. Протокол состоит в первом рассекать железы от мух, выражающих SC-специфический репортер GFP, а затем подвергая эти железы протеазы пищеварения и механической диссоциации для получения отдельных клеток. После этих шагов, индивидуальные, живые, GFP-отмеченные клетки сортируются с помощью флуоресцентного активированного сортировки клеток (FACS) для очистки РНК. Эта процедура дает SC-специфические РНК от 40 мужчин в состоянии вниз по течению RT-qPCR и / или РНК секвенирования в течение одного дня. Быстрота и простота процедуры позволяет в короткий период времени определить транскриптомы различных мух из разных генотипов или условий окружающей среды.

Введение

Органы состоят из нескольких типов клеток, каждый из которых имеет дискретные функции, а иногда и выражающие совершенно разные наборы генов. Чтобы получить точное понимание того, как функционирует орган, часто важно изучить каждый отдельный тип клеток, который составляет этот орган. Одним из основных методов, используемых для изучения возможной функции, является анализ транскриптома. Этот мощный метод обеспечивает снимок экспрессии гена в клетке, чтобы выявить активные процессы и пути. Однако, этот тип анализа часто трудн для редких населенностей клетки которые необходимо очистить от далеко более-обидеть соседних клеток. Например, мужская вспомогательная железа Дрозофилы является органом, состоящим в основном из двух типов секреторных клеток. Поскольку редкие из двух типов клеток составляют лишь 4% клеток этой железы, использование специфического анализа транскриптома клеточного типа не было использовано для определения функции этих клеток.

Аксессуарные железы (АГ) являются органами мужского репродуктивного тракта у насекомых. Они отвечают за производство большинства белков семенной жидкости (семенной жидкости (SFPs) и вспомогательных железных белков (ACPs)). Некоторые из этих SFPs, как известно, вызывают физиологические и поведенческие реакции у спаренных женщин, обычно называют после спаривания ответ (PMR). Некоторые из PMRs включают в себя: увеличение овуляции и яйцекладки скорость, хранение и высвобождение спермы, изменение в женской диете, и снижение женской восприимчивости к вторичной ухаживания мужчин1,2. Поскольку насекомые влияют на многие основные социальные проблемы от здоровья человека (как переносчиков смертельных заболеваний) до сельского хозяйства (насекомые могут быть вредителями, но имеют решающее значение для опыления и качества почвы), понимание воспроизводства насекомых является важной областью исследований. Изучение AGs и ACPs было выдвинуто значительно с модельным организмом Drosophila melanogaster. Эти исследования подчеркнули роль AGs и некоторые из отдельных белков, которые они производят в создании ПМР, влияющих на работу в других видах, как болезнь вектор Aedes aegypti3,4, и другие насекомые1 ,5. Кроме того, как AGs выделяют составляющие семенной жидкости1,6 они часто рассматриваются как функциональный аналог железы простаты млекопитающих и семенной везикулы. Эта функция сходство в сочетании с молекулярным сходством между двумя типами тканей, сделали AGs моделью для предстательной железы у мух7.

В Drosophila мужчины, Есть две доли аксессуаров желез. Каждая доли можно рассматривать как мешок, как структура, состоящая из монослой секреторных клеток, окружающих центральный просвет, и обернутые гладкими мышцами. Как уже упоминалось выше, Есть два морфологически, развития и функционально различных секретных типов клеток, составляющих эту железу: полигональной формы основных клеток (составляют 96% клеток), и больше, круглые вторичные клетки (SC) (составление оставшиеся 4% клеток, или около 40 клеток на одну долбу). Было показано, что оба типа клеток производят различные наборы ACPs для индуцирования и поддержания PMR. Большинство данных, полученных на сегодняшний день, подчеркивают роль одного белка в инициировании большинства характерных моделей поведения ПМР. Этот белок, половой пептид, представляет собой небольшой, 36 аминокислотный пептид, который выделяется основными клетками8,9,10. Хотя половой пептид, кажется, играет важную роль в ПМР, другие ACPs, производимые как основными, так и вторичными клетками, также были показаны, чтобы повлиять на различные аспекты PMR11,12,13,14 ,15,16,17. Например, на основе наших текущих знаний, SCs, через белки, которые они производят, как представляется, требуется для увековечения SP сигнализации после первого дня18.

Учитывая редкость SCs (только 80 клеток на мужчину), все наши знания об этих клетках и белках, которые они производят, приходят от генетики и кандидат подходов. До сих пор было доказано, что лишь относительно небольшой список генов специфичен для SC. Этот список включает в себя гомеодомен белка Дефектные proventriculus (Dve)19, lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 и 1921, CG1656 и CG1757511, 15,21 и фактор транскрипции гомеобокса Abdominal-B (Abd-B)18. Ранее мы показали, что мутант дефицит как для выражения Абд-B и lncRNA MSA во вторичных клетках(iab-6cocuD1 мутант) сокращает длину PMR от 10 дней до только один день12 , 18 лет , 20. Этот фенотип, кажется, вызвано ненадлежащим хранением SP в женском репродуктивном тракте12,18,20. На клеточном уровне вторичные клетки этого мутанта показывают аномальную морфологию, теряя свои характерные вакуолоподобные структуры18,20,21. Используя эту линию мутантов, мы ранее пытались определить гены, участвующие в функции SC, сравнивая транскрипционные профили целых AGs либо из дикого типа или мутант аксессуар желез12. Кроме того, другие лаборатории показали, что номер SC, морфология и содержание вакуолярного зависит от мужской диеты, статус спаривания и возраст21,25,26.

Хотя с использованием этих подходов был достигнут позитивный прогресс, полный транскриптом SC был далек от достижения. Редкость этих клеток в этом органе затрудняет дальнейшее продвижение даже от клеток дикого типа. Для тестирования экспрессии генов, изменения в этих клетках после конкретных экологических стимулов будет еще труднее. Таким образом, метод изоляции и очистки SC РНК, который был достаточно быстрым и простым, чтобы работать в различных генетических фонов и условий окружающей среды было необходимо.

Оба гена Abd-B и MSA требуют специфического усилитель 1.1 кБ от комплекса Drosophila Bithorax (так называемый усилитель D1) для их выражения в SCs18,20. Этот усилитель ранее был использован для создания драйвера GAL4, который, когда связан с UAS-GFP, способен управлять сильным выражением GFP специально в SCs. Таким образом, мы использовали эту линию в качестве основы для протокола FACS, чтобы изолировать эти клетки от дикого типа и iab-6cocuD1 AGs). Как iab-6cocuD1 мутант SCs дисплей различных клеточных морфологии, мы показываем, что этот протокол может быть использован для изоляции клеток для определения их транскриптома от этого редкого типа клеток в совершенно разных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Drosophila Линии, используемые и сбор мужчин

  1. Для этого протокола используйте самцов, выражающих GFP в SCs, а не в основных ячейках. Здесь используется водитель AbdB-GAL4 (описанный в справке18),рекомбинирован с UAS-GFP (на хромосоме 2). Другие подходящие драйверы также могут быть использованы. Для изоляции SCs в различных условиях мутантов, пересекать мутации в линии, содержащие SC-специфической линии GFP.
  2. Соберите две партии около 25 здоровых, девственных самцов для каждого генотипа и стареете их при 25 градусах По Цельсия в течение 3-4 дней во флаконах со свежеприготовленной пищей Дрозофилы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По возрасту, статусу спаривания, питанию и социальной среде, каждой из которых влияет на репродуктивную биологию, необходимо соблюдать строгие протоколы для контроля этих параметров. Девственницы выдерживаются в течение 3-4 дней после pupal eclosion при 25-C с светлым/темным циклом 12 ч/12 ч, на стандартной кукурузной муке-агар-дрожжевой пище, в группах по 20-25 самцов на флакон.

2. Решения и подготовка материалов

  1. Подготовьте следующие решения.
    1. Подготовка сыворотки Дополненный средний (SSM): Дрозофила среды Шнайдера дополняется 10% тепла инактивированных сыворотки крупного рогатого скота плода и 1% пенициллина-стрептомицина.
    2. Приготовьте аликвоты 1x трипсина (например, фермент TrypLE Express) и храните при комнатной температуре.
    3. Приготовьте аликвоты папаина (50 U/mL) (хранится при -20 градусов по Цельсию и размораживаются только один раз).
    4. Подготовка 1x фосфат буфера сольник (PBS, хранится при комнатной температуре).
  2. Подготовьте несколько огненно-округлых наконечников труба для физической диссоциации вспомогательных желез.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Используйте низкие советы удержания для обработки аксессуаров желез, как они, как правило, придерживаются необработанных пластика. Процесс огнеупорства уменьшает открывание кончика и сглаживает края кончика. Это обеспечивает эффективную диссоциацию после пищеварения пептидаза без стрижки клеточных мембран.
    1. Вырежьте один кончик 200 л с острым лезвием и аккуратно передайте его через пламя, чтобы закруглить его кончик так, чтобы отверстие шире, но гладкой для обработки во время шага 3.7.
    2. Сужай отверстие нескольких 1000 наконечников, проходя наконечник открытия возле пламени менее чем за одну секунду. Поверните кончик немного, чтобы избежать чрезмерного плавления или засорения. Сортировать советы, сделанные от более узкой к более широкой. Это может быть сделано путем синхронизации скорость аспирации. Попробуйте разобщить небольшой образец АГ, чтобы проверить эффективность самых узких советов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти советы имеют решающее значение для механического возбуждения (шаги 5.2 и 5.3). Качественные огненно-округлые наконечники трубач обеспечивают полную диссоциацию при сохранении жизнеспособности клеток. Таким образом, эти советы тщательно промывают водой в конце процедуры повторного использования. Это позволяет изо дня в день воспроизводимой диссоциации.

3. Рассечение аксессуаров Glands

  1. Положите от 20 до 25 самцов дрозофилы в стеклянную тарелку на льду.
  2. Вскрыть 1 мужчину в SSM. Снимите его репродуктивного тракта и очистить пара аксессуаров железы от всех других тканей, кроме эякуляторного протока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удалить яички, потому что освобожденная сперма может создать сгустки и нарушить процесс диссоциации. Удалите эякуляционную лампу, что затрудняет обработку при плавании.
  3. С щипками, передача аксессуаров желез в стеклянную пластину заполнены SSM при комнатной температуре. Повторите шаги 3,2-3,3 раза, чтобы получить партию из 20 пар желез в SSM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги будут достигнуты в 15 до 20 мин. АГ должны выглядеть здоровыми, и перистальтические движения мышечного слоя вокруг желез должны быть видны. GFP можно контролировать с помощью флуоресцентного микроскопа.
  4. Передача вспомогательных желез в 1x PBS для 1-2 мин мыть при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшей диссоциации необходимо промыть железы с помощью PBS. Продолжительность этого шага, однако, должна быть ограничена, поскольку клетки проявляют признаки стресса в PBS; разъединенные вторичные клетки в PBS быстро набухают и умирают.
  5. Разбавить 20 юаней папаин в 180 л фермента 1x трипсина, чтобы получить диссоциационный раствор (для масштабирования или снижения 9 л фермента трипсина и 1 л папаина для каждого самца). С щиптеми, передача аксессуаров желез к этому решению.
  6. Изолировать кончик вспомогательных желез (содержащих вторичные клетки) от проксимальной части. Используйте мелкие щипцы, чтобы твердо щипать середину железистой доли и вырезать с острым кончиком второй щипцы. Удалите проксимальную часть вспомогательных желез и эякуляционный проток, чтобы улучшить диссоциацию и уменьшить время сортировки клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вскрытие дистальной части от 20 пар желез займет от 15 до 20 мин, а пищеварение пептидазами, таким образом, начнется с комнатной температуры.
  7. После того, как все наконечники железбыли были вскрыты, перенесите их в трубку 1,5 мл с помощью специального наконечника трубы 200 л, подготовленного на шаг 2.2.1. Она должна быть широкой, округлой и влажной до обработки желез.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для pipet аксессуар ткани железы, советы всегда должны быть предварительно мокрые с соответствующим раствором (трипсин фермента или SSM, держать одну трубку каждого для этой цели). Тщательно промыть советы между образцами, чтобы избежать загрязнения.

4. Пищеварение тканей

  1. Поместите микротрубку в шейкер 37 градусов по Цельсию в течение 60 минут, раскачиваясь при 1000 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как время возбуждения, так и время пищеварения имеют решающее значение для успешной диссоциации. Более короткое или неподвижное пищеварение даст плохую диссоциацию, вероятно, потому, что внешний мышечный слой и внутренняя вязкая семенная жидкость защищают клетки вспомогательных желез от пептидазы.
  2. Добавьте 1 мл SSM при комнатной температуре, чтобы остановить пищеварение и немедленно приступить к шагу 5.

5. Механическая диссоциация клеток

  1. Используя широкий округлый наконечник 1000 л, предварительно мокрый с SSM, перенесите образец на 24-хорошую пластину. Монитор GFP флуоресценции под микроскопом: большинство железы советы должны выглядеть нетронутыми и несколько SC должны быть отделены.
  2. Используя закругленный узкий наконечник pipet, генерируемый на шаг 2.2.2, пайпет вверх и вниз от 3 до 5 раз, чтобы нарушить ткани вспомогательного железа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Монитор флуоресценции, чтобы убедиться, что большие патчи ткани были разбиты. Повторите шаг 5.2, если это не так.
  3. Используя очень узкий округлый наконечник трубы (генерируется на шаг 2.2.2), pipet вверх и вниз 1-2 раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только отдельные ячейки должны быть видны после шага 5.3. Рекомендуется использовать 24-колодные пластины, поскольку они обеспечивают легкий мониторинг процесса. Когда несколько образцов были обработаны и дали удовлетворительный результат (здоровый вид вторичных клеток прекрасно разъединяется), трубопроводные шаги будут выполнены в микротрубке.
  4. Подождите, по крайней мере 15 минут, чтобы клетки оседают в нижней части скважины и удалить избыток SSM, чтобы уменьшить время сортировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сдача клетки поселиться оказалось выше альтернативных методов, таких как центрифугирование, и позволяет последний визуальный осмотр клеток непосредственно перед FACS.
  5. Труба клетки в чистую трубку 1,5 мл и бассейн идентичных образцов (две партии по 20 мужчин для каждого условия). Промыть скважины с SSM для восстановления последних клеток, и пипетка их в трубку (использовать небольшой объем).
  6. В микротрубках мощностью 1,5 мл добавьте 300 л раствора клеточного лиза и 1 л протеиназа K (решения, представленные в комплекте очистки РНК, см. Шаг 7). Подготовьте две трубки для каждого образца (одна для МС и одна для SCs).

6. FACS (Флуоресцентно-активированная сортировка клеток)

  1. Добавьте маркер жизнеспособности к каждому образцу, который будет отсортирован за несколько минут до сортировки (0,3 мм Draq7).
    ПРЕДЕКТО: К Драк7 следует обращаться с осторожностью.
  2. Сортировать однородную популяцию живых вторичных клеток (GFP-положительные, Draq7-отрицательные клетки). В другой микротрубке сортируйте популяцию основных клеток (меньшие, GFP-отрицательные, Draq7-отрицательные клетки). Используйте следующую стратегию FACS gating:
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Установите давление сортировки ячейки на 25 PSI и пройдите клетки через сопло 100 мкм. Скорость сортировки составляет около 2000 ячеек/с.
    1. Исключить мусор и выбрать общие ячейки на основе FSC-SSC(рисунок 2E) для того, чтобы исключить мусор.
    2. Исключить мертвые клетки. Возбуждайте Draq7 лазером 640 нм и собирайте испускаемую флуоресценцию с помощью фильтра диапазона 795/70. Ворота Draq7-положительные клетки из(Рисунок 2F).
    3. Удалить дублеты с помощью двойного gating на SSC-H против SSC-W и FSC-A против FSC-H(Рисунок 2H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исключите дублеты клетки строго используя двойной gating, для уменьшения основного загрязнения клетки.
    4. Сортируйте 550 GFP-позитивных клеток в микротрубку 1,5 мл с буфером Lysis и Proteinase K. Эта популяция считается вторичными ячейками (SC, Рисунок 2G). Excite GFP на 488 нм и собирать излучаемые флуоресценции с 526/52 диапазон-проход фильтр.
    5. Сортируйте 1000 GFP-отрицательных клеток, однородных и малых по размеру, в микротрубку объемом 1,5 мл с буфером Lysis и Proteinase K. Эта популяция считается основными ячейками (MC, Рисунок 2G).
    6. Вихрь все образцы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из 40 мужчин (40 х 80 SC и 3200 вторичных клеток), 600 до 800 живых одноместных вторичных клеток получаются (около 20-25% поиска). Прекратите сортировку около 550 SC и 1000 MC для нормализации образцов.

7. Добыча РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали Epicentre MasterPure РНК очистки Kit для извлечения РНК, со следующими адаптации. Другие наборы могут быть использованы до тех пор, пока выход достаточно высок, чтобы подготовить библиотеку для секвенирования из 500 ячеек (2 нг РНК был использован здесь).

  1. Нагрейте образцы при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 15 мин и вихря каждые 5 минут для завершения лиза клетки.
  2. Поместите образцы на лед на 5 мин. Следуйте рекомендациям производителя по осадкам нуклеиновой кислоты (части "Осадки общих нуклеиновой кислоты" и "Удаление загрязняющей ДНК из препаратов общей нуклеиновой кислоты").
  3. Приостановить РНК гранулы в 10 Зл из RNase-свободного TE буфера.
  4. Добавьте ингибитор RNase (по желанию).
  5. Храните образцы при -80 градусах по Цельсию.

8. Контроль качества количества, качества и специфичности РНК

  1. Оценить качество РНК и концентрацию. Из-за небольшого объема и концентрации, используйте чипсы РНК 6000 Пико здесь. Хорошее качество РНК определяется как недеградированный, видимый как низкий базовый уровень с резкими пиками, соответствующими РНК.
  2. RT-qPCR для контроля идентичности отсортированных ячеек
    1. Выполните обратную транскрипцию с 2 нг всего РНК с использованием случайных hexamers в качестве грунтовки. Выполните RT на вторичной клеточной РНК и основной клеточной РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: cDNAs могут быть разбавлены, aliquoted, и храниться замороженные для последующего использования.
    2. Выполните в режиме реального времени количественные ПЦР с использованием соответствующих пар грунтовки для количественной оценки генов домашнего хозяйства(альфа-Тубулин, 18S rRNA), вторичные специфические гены клеток(MSA, Rab19, Abd-B) и основной специфический ген клетки (Секс пептид).

9. Секвенирование (подготовка библиотеки кДНК, секвенирование и анализ данных)

  1. Используйте 2 нг всего РНК для синтеза cDNA с политТ-праймерами. Используйте технологию SMARTer для их усиления для усиления.
  2. Используйте комплект Nextera XT для подготовки библиотеки.
  3. Последовательность с использованием мультиплексных, 100 нуклеотидов одного считывает секвенирование (хотя 50 нуклеотидов читает подходят для большинства целей), чтобы дать около 30 миллионов считывает для каждого образца.

10. Анализ данных

  1. Выполнить Fast'C.
  2. Используйте выравниватель STAR для картирования считывателей на справочном геноме UCSC dm6 Drosophila и генерации файлов .bam. Используйте Integrative Genomics Viewer (IGV) для визуализации считывателей на браузере генома.
  3. Используйте HTSeq для выполнения генов.
  4. Используйте метод Trimmed Mean of M-values (TMM) для нормализации количества генов22. Используйте edgeR для выполнения статистического анализа дифференциального выражения, участков MA и PCA.
  5. Для анализа экспрессии генов и статистики используйте General Linear Model, квази-вероятностный F-тест с false Detection Rate (FDR) и коррекцию Бенджамини и Хохберга (BH).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представленный здесь протокол позволяет одному экспериментатору изолировать вторичные клетки из самцов вспомогательных желез Дрозофилы и извлекать их РНК в течение одного дня(рисунок 1).

Мы используем Abd-B-GAL4 построить18 для обозначения вторичных клеток (SC), но не основные клетки (MC) с GFP (Рисунок 2A). Одн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Методы клеточной диссоциации от ткани Дрозофилы, такие как воображаемые диски, уже описаны23. Наши попытки просто использовать эти процедуры на вспомогательных желез ахну, не увенчались успехом, поощряя нас к разработке этого нового протокола. Протеазы пищеварения и механической трикуляции были критические шаги мы неприятности для успеха процедуры, и мы, таким образом, размещены многие заметки в разделах 2 до 5, чтобы помочь экспериментаторам получить удовлетворительные результаты. Для то...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не разглашаем информацию.

Благодарности

Мы признательны членам лаборатории Karch, форме геномики iGE3, основному объекту цитометрии Flow Cytometry в Йеневском университете, а также д-ру Мы благодарим Луку Стикли за помощь в визуализации читает на IGV. Мы благодарим себя за мягкое разрешение на повторное использование цифр, и редакторы для побудило нас быть творческими с письменной форме.

Это исследование финансировалось государством (CI, RKM, FK), Швейцарским национальным фондом исследований (www.snf.ch) (FK и RKM) и пожертвованиями от Фонда Клараза (FK).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24-луночный планшет для культуры тканейVWR734-2325
Бинокулярный микроскоп для диссекции
Бинокуляр с источником света для GFP
Bunsen
Draq7 0,3 мМBioStatusDR71000
Пластиковые микропробирки 1,5 млEppendorf
FACSBeckman CoulterMoFlo Astrios
Тонкая диссекционная щипцы
Фетальная бычья сывороткаGibco10270-106термоинактивированная перед использованием
Стеклянная посуда для препарирования
Ведро
ImProm-II Система обратной транскрипцииPromegaA3800
Набор для очистки РНКMasterPureEpicenter MCR85102
набор Nextera XTilluminahttps://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html
P1000Gilson
P20Gilson
P200Gilson
Papain50 ед/мл сток
PBSдомашнего производства
Пенициллин-стрептомицинGibco15070-063
Праймеры
Случайные гексамерные
РНК 6000 Pico kitКомпания Agilent
Schneider' s Drosophila mediumGibco21720-001
SMARTer набор для синтеза кДНКTakarahttps://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits
SYBR select Master mix for CFXapplied биосистемы4472942
ТермошейкерHangzhou Allsheng приспособленияMS-100
Tipone 1250 μ L градуированный наконечникStarlabS1161-1820
Tipone 200 μ L скошенный наконечникStarlabS1161-1800
TrypLE Express EnzymeGibco12604013
Vortex
для льдаPolydTпраймеры

Ссылки

  1. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
  2. Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
  3. League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
  4. Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
  5. Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
  6. Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
  7. Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
  8. Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
  9. Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
  10. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
  11. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238(2007).
  12. Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).
  13. Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
  14. Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
  15. Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
  16. Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
  17. Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
  18. Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395(2013).
  19. Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302(2012).
  20. Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519(2018).
  21. Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
  22. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25(2010).
  23. Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
  24. Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
  25. Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
  26. Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
  27. Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

DrosophilaFACSGFPRT qPCR
Протокол на основе FACS для изоляции РНК из вторичных клеток Дрозофилы Мужской Аксессуар Glands
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.