Здесь мы представляем протокол для разъединения и сортировки определенной популяции клеток из самцов вспомогательных желез Дрозофилы (вторичных клеток) для секвенирования РНК и RT-qPCR. Изоляция клеток осуществляется путем очистки FACS вторичных клеток GFP-выражения после многоступенчатого процесса диссоциации, требующего вскрытия, пищеварения протеаз и механической дисперсии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Протокол на основе FACS для изоляции РНК из вторичных клеток Дрозофилы Мужской Аксессуар Glands
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Чтобы понять функцию органа, часто полезно понять роль его составных популяций клеток. К сожалению, редкость отдельных популяций клеток часто затрудняет получение достаточного количества материала для молекулярных исследований. Например, вспомогательная железа мужской репродуктивной системы Дрозофилы содержит два различных типа секреторных клеток. Основные клетки составляют 96% секреторных клеток железы, в то время как вторичные клетки (SC) составляют оставшиеся 4% клеток (около 80 клеток на мужчину). Хотя оба типа клеток производят важные компоненты семенной жидкости, только несколько генов, как известно, специфичны для SCs. Редкость SCs, до сих пор, препятствует транскриптомического анализа исследования этого важного типа клеток. Здесь представлен метод, позволяющий очищать SCs для извлечения РНК и секвенирования. Протокол состоит в первом рассекать железы от мух, выражающих SC-специфический репортер GFP, а затем подвергая эти железы протеазы пищеварения и механической диссоциации для получения отдельных клеток. После этих шагов, индивидуальные, живые, GFP-отмеченные клетки сортируются с помощью флуоресцентного активированного сортировки клеток (FACS) для очистки РНК. Эта процедура дает SC-специфические РНК от 40 мужчин в состоянии вниз по течению RT-qPCR и / или РНК секвенирования в течение одного дня. Быстрота и простота процедуры позволяет в короткий период времени определить транскриптомы различных мух из разных генотипов или условий окружающей среды.
Введение
Органы состоят из нескольких типов клеток, каждый из которых имеет дискретные функции, а иногда и выражающие совершенно разные наборы генов. Чтобы получить точное понимание того, как функционирует орган, часто важно изучить каждый отдельный тип клеток, который составляет этот орган. Одним из основных методов, используемых для изучения возможной функции, является анализ транскриптома. Этот мощный метод обеспечивает снимок экспрессии гена в клетке, чтобы выявить активные процессы и пути. Однако, этот тип анализа часто трудн для редких населенностей клетки которые необходимо очистить от далеко более-обидеть соседних клеток. Например, мужская вспомогательная железа Др....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Drosophila Линии, используемые и сбор мужчин
- Для этого протокола используйте самцов, выражающих GFP в SCs, а не в основных ячейках. Здесь используется водитель AbdB-GAL4 (описанный в справке18),рекомбинирован с UAS-GFP (на хромосоме 2). Другие подходящие драйверы также могут быть использованы. Для изоляции SCs в различных условиях мутантов, пересекать мутации в линии, содержащие SC-специфической линии GFP.
- Соберите две партии около 25 здоровых, девственных самцов для каждого генотипа и стареете их при 25 градусах По Цельсия в течение 3-4 дней во флаконах со свежеприготовленной пищей Дрозофил....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Представленный здесь протокол позволяет одному экспериментатору изолировать вторичные клетки из самцов вспомогательных желез Дрозофилы и извлекать их РНК в течение одного дня(рисунок 1).
Мы используем Abd-B-GAL4 построить18 для обозначения вторичных клеток (SC), но не основные клетки (MC) с GFP (Рисунок 2A). Одн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Методы клеточной диссоциации от ткани Дрозофилы, такие как воображаемые диски, уже описаны23. Наши попытки просто использовать эти процедуры на вспомогательных желез ахну, не увенчались успехом, поощряя нас к разработке этого нового протокола. Протеазы пищеварения и механической трикуляции были критические шаги мы неприятности для успеха процедуры, и мы, таким образом, размещены многие заметки в разделах 2 до 5, чтобы помочь экспериментаторам получить удовлетворительные результаты. Для то.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не разглашаем информацию.
Благодарности
Мы признательны членам лаборатории Karch, форме геномики iGE3, основному объекту цитометрии Flow Cytometry в Йеневском университете, а также д-ру Мы благодарим Луку Стикли за помощь в визуализации читает на IGV. Мы благодарим себя за мягкое разрешение на повторное использование цифр, и редакторы для побудило нас быть творческими с письменной форме.
Это исследование финансировалось государством (CI, RKM, FK), Швейцарским национальным фондом исследований (www.snf.ch) (FK и RKM) и пожертвованиями от Фонда Клараза (FK).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 24-луночный планшет для культуры тканей | VWR | 734-2325 | |
| Бинокулярный микроскоп для диссекции | |||
| Бинокуляр с источником света для GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0,3 мМ | BioStatus | DR71000 | |
| Пластиковые микропробирки 1,5 мл | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Тонкая диссекционная щипцы | |||
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 10270-106 | термоинактивированная перед использованием |
| Стеклянная посуда для препарирования | |||
| Ведро | |||
| ImProm-II Система обратной транскрипции | Promega | A3800 | |
| Набор для очистки РНК | MasterPure | Epicenter MCR85102 | |
| набор Nextera XT | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50 ед/мл сток | ||
| PBS | домашнего производства | ||
| Пенициллин-стрептомицин | Gibco | 15070-063 | |
| Праймеры | |||
| Случайные гексамерные | |||
| РНК 6000 Pico kit | Компания Agilent | ||
| Schneider' s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer набор для синтеза кДНК | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied биосистемы | 4472942 | |
| Термошейкер | Hangzhou Allsheng приспособления | MS-100 | |
| Tipone 1250 μ L градуированный наконечник | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μ L скошенный наконечник | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
Ссылки
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
- Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmen....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
