Крио-распыления Протокол для обработки мышь лапы для оценки молекулярных путей воспаления тканей в коллагениндовой модели артрита

Summary

Криогенный метод распыления для обработки мурин лап с помощью жидкого азота морозильной мельницы был разработан для улучшения урожайности и качества РНК или белка, извлеченного из тканей и позволяют анализ молекулярных профилей, связанных с воспалительными Ответы.

Abstract

Профилирование молекулярных изменений в местных тканях имеет решающее значение для понимания механизма (ы) действия терапевтических кандидатов in vivo. В области исследований артрита, многие исследования сосредоточены на воспаление суставов, которые состоят из сложной смеси костей, хряща, мышц, стромальных клеток и иммунных клеток. Здесь мы создали надежный и надежный механический метод для разрушения воспаленных мышей лап в однородные распыленные образцы в криогенно контролируемой среде. Белки и РНК-лизаты были обработаны для обеспечения протеомных и транскрипционных конечных точек и молекулярной характеристики соответствующих путей заболевания в местной ткани.

Introduction

Ревматоидный артрит (РА) является хроническим системным воспалительным заболеванием с стойким симметричным синовитом в суставах и дополнительным суставным участием органов, таких как кожа, сердце, легкие и глаза^1. Хотя системные проявления иммунного ответа очевидны у пациентов, одной из отличительных черт патологии РА является проникновение иммунных клеток в синовиальную ткань и пролиферация синовиальных фибробластных клеток².

Как и в человеческой РА, мышь коллагена индуцированных артрита (ЦРУ) модель вызывает сильное воспаление тканей с активными иммунными реакциями в синовиальных тканей и системных отсеков. Восприимчивость различных штаммов мыши к модели ЦРУ ссылки на основные гистосовместимости комплекса (MHC) гаплотип и антиген конкретных Т-клеток и B-клеточных взаимодействий^3,4. Кроме того, многие патогенные пути в организме человека, в том числе производство аутоантител, иммунный комплекс осаждения, активация миелоидных клеток, полиартикулярные проявления и формирование паннуса с синовиальной иммунной инфильтрацией, также проявляются в этой модели ^5,6. Следователи использовали эту устоявшуюся модель ЦРУ для расследования последствий противовоспалительных цитокинов лечения⁷. Многие биопрепараты, одобренные для аутоиммунных или воспалительных заболеваний, таких как анти-ТНФЗ и анти-IL-6, оказались эффективными в модели ЦРУ^8,9.

Профилирование взаимодействий иммунной системы в синовиальной ткани имеет решающее значение для выяснения молекулярных механизмов, связанных с патогенезом РА. В клинических условиях человека, распространенная практика заключается в выполнении иглы синовиальной биопсии под руководством ультразвуковой визуализации. В доклинических условиях меньшая архитектура муринских суставов делает процедуры биопсии гораздо более сложными, если не невозможными. Недавно мы продемонстрировали использование модели murine ЦРУ для оценки комбинаций препаратов для воздействия разрозненных конечных точек и разрешения болезни в комбинаторном подходе¹⁰. Для обработки воспаленные муринные лапы в однородные мелкие порошки был использован криогенный морозильный метод мельницы на основе мельницы. Этот метод защищает РНК и белок от ферментативных и химических дегративных процессов и позволяет нам применять несколько аналитических методов к одному гомогенизированному источнику образца.

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с политикой Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) компании «Янссен» НИОКР.

1. Криогенный морозильник мельница основе пульверизации Метод

1. При прекращении исследования ЦРУ, жертвоприношение мышей с 1,5% изолюран с последующим вывихом шейки матки.
2. В день обработки тканей, предварительно охладить все инструменты (шпатулы, шлифовальные флаконы и т.д.) на сухом льду в течение как минимум 10 мин. Носите тепловые перчатки, чтобы избежать замораживания повреждения.
3. Вырезать задние лапы с ножницами на линии меха, как показано на рисунке 1А.
4. Перенесите каждую лапу в одну микроцентрифуговую трубку мощностью 1,5 мл, немедленно заморозьте жидкий азот и храните замороженные лапы при -80 градусов по Цельсию. Не держите образцы замороженными в течение более одной недели.
5. Заполните морозильную мельницу жидким азотом, как показано на рисунке 1B, и дайте ей уравновесить, по крайней мере 10 мин.
6. Храните необработанный образец на сухом льду и избегайте циклов замораживания оттепели.
7. Перенесите одну заднюю лапу в предварительно охлажденный большой поликарбонат шлифовальный флакон с нижней стальной штепсельной вилкой, вставьте предварительно охлажденный стальной ударитель и закройте поликарбонатный шлифовальный флакон с предварительно охлажденной верхней стальной вилкой(рисунок 1C).
8. Перенесите большие флаконы из поликарбоната с образцами в морозильную мельницу, предварительно заполненную жидкостью, и закройте крышку резиновой застежкой, найденной в передней части инструмента.
9. Дайте образцам остыть в жидком азоте в течение 1 минуты.
10. Установите морозильную мельницу на 1-минутную программу с 10 циклами в секунду и нажмите кнопку «Пуск». Подождите, пока морозильник мельницы, чтобы завершить свой цикл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Машина издает звук, издав ударный звук, когда стальной ударный перемещается вперед и назад. Используйте затычки для ушей, чтобы избежать потери слуха.
11. Откройте крышку морозильной мельницы, выньте большой поликарбонатшливый флакон и поместите его в экстрактор, как показано на рисунке 1D. Удалите верхнюю стальную вилку, разместив понижательное давление на черную ручку до тех пор, пока стальная вилка не выкатится из поликарбонатной трубки.
12. Перенесите открытый большой поликарбонатный пробирки на сухой лед. Удалите стальной ударсудар с предварительно охлажденным щиптом.
13. Перенесите замороженный порошок в предварительно охлажденный коническую трубку 50 мл.
14. Вес 30-50 мг замороженного порошка в tared замороженные 1,5 мл микроцентрифуг трубки для экстракции РНК и 100-200 мг замороженного порошка для извлечения белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженный порошок должен выглядеть как белый или светло-розовый мелкий песок, как показано на рисунке 1E.
15. Храните распыленные образцы при -80 градусах Цельсия и переходите к РНК и белковой изоляции в течение 24 ч.

2. Добыча РНК

1. Добавьте 10 л из й-меркаптоэтанола (к-МЭ) на 1 мл буфера RLT.
2. Рассчитайте объем RLT Buffer, соответствующий соотношению 23,3 мл/мг ткани, и добавьте соответствующий объем RLT Buffer с помощью q-ME в трубку с замороженным порошком. Это соотношение было эмпирически определено, чтобы быть идеальным для мыши лапы.
3. Вихрь образец при 3000 об/мин на 10 с.
4. Хорошо перемешать, пипетки вверх-вниз 10 раз энергично с 1 мл пипетатора.
5. Vortex образец снова на 3000 об/мин на 20 с.
6. Центрифуга трубки на 13000 х г в течение 2 мин.
7. Перенесите 700 л супернатантов в свежую трубку и добавьте 700 л 70% этанола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если в трубке находится lt;700 л, то можно продолжить, по-прежнему добавляя эквивалентный объем в 70% этанола.
8. Загрузите 700 л образца на столбец очистки РНК.
9. Центрифуга трубки на 10000 х г на 30 с.
10. Отбросьте поток и загрузите оставшуюся часть образца в столбец RNeasy.
11. Центрифуга трубки на 10000 х г на 30 с.
12. Отбросьте поток и промойте столбец, добавив 700 л буфера RW1 с центрифугированием 10 000 х г на 30 сс. При выполнении опции dnaSE пищеварения, 350 Л RW1 добавляется до лечения ДНКСЭ.  И еще 350 л RW1 добавляется после лечения ДНКСЭ.
13. Дополнительно) Выполните шаг dNase пищеварения следовать инструкциям производителя.
14. Вымойте трубку дважды, добавив 500 кЛ буфера RPE с последующим центругированием на уровне 10 000 х г в течение 30 с. Отбросьте поток через каждый раз.
15. Высушите столбец центрифугированием при 10 000 х г в течение 2 мин.
16. Elute РНК, добавляя 50 л воды с центрифугированием на 10000 х г в течение 2 мин. Соберите поток через и передать в новую трубку 1,5 мл.
17. Определите количество РНК с помощью метода исследователя выбора и хранения при -80 градусов по Цельсию до дальнейшего анализа.

3. Экстракция белка

1. Разбавить 10x клеточного лиза цисисого штучного раствора в 1x-клеточном растворе лиза с использованием воды класса клеточной культуры.
2. Восстановите ингибитор протеазы Коктейль Набор I с 1 мл воды, чтобы сделать 100x протеазы ингибитор фонда.
3. Добавьте 100 л ингибитора протеазы к 9,9 мл из 1x Lysis, чтобы сделать 1x окончательный запас решения.
4. Добавьте 4 злиц ледяного холода 1x Cell Lysis Buffer на мг порошка ткани (например, 800 л люл буфера лисиса до 200 мг порошка ткани).
5. Добавьте в трубку одну 5-мм капотом из нержавеющей стали.
6. Вихрь трубки при 3000 об/мин на 60 с. Перенесите трубку на мокрый лед и продолжайте к следующему образцу.
7. Поместите все образцы трубок в коробку и встряхните коробку центрифуги на рокере при 1000 об/мин, 4 кв. м на 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователи могут обнаружить, что размещение коробки вертикальной может способствовать лучшему смешиванию с бисочницей.
8. Центрифуга труб на 10000 х г и 4 кв кв 15 мин.
9. Перенесите супернационты в свежую трубку и избегайте жирового слоя сверху.
10. Определите общую концентрацию белка. От 10 до 30 раз разбавления белка лизат идеально подходят для теста BCA.
11. Aliquot образца в 1,5 мл микроцентрифуговых труб и хранить при -80 градусах Цельсия до дальнейшего анализа.

Results

Здесь мы показываем репрезентативную визуализацию изображения геля РНК, извлеченную из передних лап мышей ЦРУ на рисунке 2A. 28S rRNA и диапазон 18S rRNA указывают на то, что все образцы имеют достаточное количество нетронутой РНК. Далее мы показываем репрезентативный участок рассеяния общих концентраций белка на основе анализа белка BCA на рисунке 2B. Общие концентрации протеина от наивных мышей...

Discussion

Хотя есть сильное научное обоснование для оценки молекулярных путей в синовиальных тканях, многие доклады об иммунном профилировании модели ЦРУ были сосредоточены на периферической крови, в то время как данные анализа белка и РНК воспаленных лап довольно ограничены. Есть несколько возможных причин для этого смещения: мурин лодыжки суставы не больше, чем 2 см; пораженные участки состоят из кожи, костной и соединительной ткани, которые часто трудно гомогенизировали с помощью традиционных методов, таких как тканевые шлифова...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Бусина из нержавеющей стали 5 мм	Qiagen	69989
бета-меркаптоэтанол	Sigma	M6250	Восстановитель проб, ингибирующий ферменты РНКАЗ
Набор биоанализатора	Agilent	5067-1511	Квалификационный набор РНК
b-меркаптоэтанол	Sigma	M6250
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CI	Водный
раствор для лизиса клеток	Cell Signaling	9803
Трубка Eppendorf Пробирка	Eppendorf	22363204	пробирки Microfuge
Коробка центрифуги для пробирок Eppendorf	Nalgene	5055	Коробка для хранения пробирок Eppendorf в горизонтальном расположении труб
Everlast 247 Качалка с регулируемой скоростью	Benchmark Scientific	BR5000
Морозильная мельница	Spex Sample Prep	6875	Морозильная камера/мельница для переработки лап в измельченный порошок
Измельченный флакон	Spex Sample Prep	6801	Поликарбонатный флакон для переработки лап в измельченный порошок
Набор для пирса BCA Pierce		23225	Набор для количественного определения общего белка
Набор для коктейлей с ингибиторами протеазы 1	Calbiochem	539131	Ингибиторы
протеазыProtein BCA Kit	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	bDNA Analysis Kit
Охлаждаемая микроцентрифуга	Eppendorf	5417R	Центрифугирование
RLT Buffer	Qiagen	79216	Буфер для экстракции
РНК RNeasy mini Kit	Qiagen	74104	включая колонку RNeasy, RLT Buffer и RW1 Buffer
Шейкер	Benchmark Scientific	BR5000	Качалка/шейкер
Шпатель	VWR	10806-412	Шпатель для переноса порошка
Бусина из нержавеющей стали	Qiagen	69989	Бусина для смешивания во время экстракции белка
Трубка Экстрактор	Spex Подготовка образцов	6884	Экстрактор для снятия верхней части измельчающего флакона
Vortexer	VWR	10153-838	Смешивание образцов