Гематопоиэтисические стволовые клетки-прародители (HSPCs) переходят от состояния покоя к состоянию дифференциации из-за их метаболической пластичности во время формирования крови. Здесь мы представляем оптимизированный метод измерения митохондриального дыхания и гликолиза ГСПК.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ гематопоиетического метаболизма стволовых прародителей клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Гематопоиэтисические стволовые клетки-прародители (HSPCs) имеют различные метаболические пластичности, что позволяет им перейти от их тихих состояние дифференциации государства для поддержания требований формирования крови. Тем не менее, было трудно проанализировать метаболический статус (митохондриальное дыхание и гликолиз) HSPCs из-за их ограниченного числа и отсутствие оптимизированных протоколов для неприсоединения, хрупкие HSPCs. Здесь мы предоставляем набор четких, пошаговых инструкций по измерению метаболического дыхания (коэффициент потребления кислорода; OCR) и гликолиз (внеклеточный уровень подкисления; ECAR) из морин костного мозга-ЛинияnegSca1иc-Kit (LSK) HSPCs. Этот протокол обеспечивает большее количество LSK HSPCs из морин костного мозга, улучшает жизнеспособность HSPCs во время инкубации, облегчает внеклеточный анализ потока неприсоединения HSPCs, и обеспечивает оптимизированные протоколы инъекций (концентрация и время) для препаратов, направленных на окислительный фосфорилирование и гликолитические пути. Этот метод позволяет прогнозировать метаболическое состояние и здоровье ГСпК при развитии крови и заболеваниях.
Введение
Так как продолжительность жизни большинства зрелых кровяных клеток коротка, гомеостаз крови опирается на самообновление и дифференциацию долгоживущей, но редкой популяции гематопоиетических стволовых клеток (HSPCs)1. HSPCs тихие, но они быстро размножаются и проходят дифференциацию при стимуляции для поддержания требований системы крови. Поскольку каждое клеточное состояние HSPC требует уникального биоэнергетического спроса, метаболические изменения являются ключевыми факторами решений судьбы HSPC. Таким образом, потеря метаболической пластичности, изменяя равновесие между quiescence, самообновления, и дифференциации HSPCs, часто приводит к мие....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол был одобрен Общенациональным комитетом по уходу за животными и использованию детей (IACUC).
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол описан в хронологическом порядке, который охватывает в течение двух дней. Используйте свежие реагенты, как описано в протоколе ниже.
1. Подготовка реагентов в день до асссея
-
Гидратация датчика картриджа.
- Инкубировать 5 мл калибранта(Таблица материалов) в инкубаторе без CO2 37 градусов по Цельсию на ночь.
- Откройте набор ассеа требет(Таблица материалов)и отделите картридж датчика (....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Наш метод извлечения позволил нам собрать до 80 000 LSK HSPCs на мышь. Жизнеспособность и количество lSK клеток были улучшены с нашим методом, потому что мы: (1) комбинированный костный мозг из верхних и нижних конечностей, тазобедренных костей, грудины, грудной клетки и позвоночника, (2) избежать использования красноклеточного лизиса буфера, что бы увеличить клеточной смерти и слипание, (3) использовали градиентплотное среднее разделение мононуклеадных клеток и (4) избегали использования предварительно охлажденного буфе.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы демонстрируем изоляцию максимального количества чистого и жизнеспособного мурина популяции LSK HSPCs, а также измерение их гликолиза и митохондриального дыхания с помощью внеклеточного анализатора потока. В частности, протокол преодолевает следующие технические вопросы для использования LSK HSPCs : i) низкая частота LSK HSPCs в murine костного мозга14,ii) низкая базальная метаболическая активность LSK HSPCs26, iii) хрупкость LSK HSPCs27,и iv.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа частично поддерживается при финансовой поддержке Национальных институтов здравоохранения (HL131645, CA016058), Фонда Святого Болдрика и Фонда Пелотонии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,01% (w/v) раствор поли-L-лизина | Sigma | P8920 | Используется для насадки LSK |
| 40 и микро; m клеточное ситечко | Fisher Scientific | 22-363-547 | Используется для фильтрации клеток после дробления костей |
| Антибиотиновые микрогранулы | Miltenyi | 130-090-485 | Используется для лин- разделения |
| биотина крысы против мыши CD45R/B220 клон RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | используется для лин- разделения |
| биотина крысы против мыши CD5 клон 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | используется для лин- сепарация |
| биотина крысы антимышиный клон CD8a 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | используется для лин- разделения |
| биотина крысы антимышиный клон Ly-6G и Ly-6C RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | используется для лин- разделения |
| биотина крысы антимышиный TER-119/эритроидные клетки клон TER-119 | BD Biosciences | 553672 | используется для лин- разделения |
| CD117 (c-kit) моноклональное антитело (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Используется для сортировки LSK |
| Falcon 15 мл Конические центрифужные пробирки | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Используются в клеточной изоляции |
| Falcon 50 мл Конические центрифужные пробирки | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Используются в изоляции клеток |
| Falcon Круглодонные полипропиленовые пробирки | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Используются для Сортировка LSK |
| Фетальная бычья сыворотка | Neuromics | FBS001-HI | Используется в буфере FACS |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Используется для разделения градиента фиколла |
| L-глутамин 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Используется для пробирной среды |
| LS Колонка | Miltenyi | 130-042-401 | Используется для лин- разделения |
| Ly-6A/E (Sca-1) Моноклональный Антитело (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Используется для сортировки LSK |
| Фактор стволовых клеток мыши (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Используется для среды для анализа |
| Мышиный тромбопоэтин (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Используется для среды для анализа |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Используется для буфера FACS |
| Пенициллин-стрептомицин ( 10 000 Ед/мл) | Fisher Scientific | 15140122 | Используется для анализа пробирных сред |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Используется для сортировки LSK |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Используется для посева LSK |
| пируват натрия (100 мМ) | ThermoFisher | 11360070 | Используется для анализа среды |
| для анализа стрептавидина eFluor 450 Конъюгат | eBioscience | 48-4317-82 | Используется для сортировки LSK |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Используется для балансировки картриджей |
| XF Медиа Agilent | Technologies | 103575-100 | Используется для анализа сред |
| XFp Гликолиз Набор для стресс-тестов | Agilent Technologies | 103017100 | Препараты для гликолиза Стресс-тест |
| XFp Mitochondrial Набор для стресс-тестов | Agilent Technologies | 103010100 | Препараты для митохондриального стресс-теста |
| Картридж датчика XFp | Agilent Technologies | 103022-100 | Используется для гликолиза и митохондриального стресс-теста |
Ссылки
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. Internationa....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
