Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мониторинг внеклеточного рН в кросс-Королевства Biofilms с помощью конфокальной микроскопии

5.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60270

⸱

30 января 2020 г.

 , 
1Department of Dentistry and Oral Health, Aarhus University

В этой статье

Краткое содержание

Протокол описывает выращивание кросс-царства биопленок, состоящий из Candida Albicans и Streptococcus mutans и представляет конфокальную микроскопию на основе метода для мониторинга внеклеточного рН внутри этих биопленок.

Аннотация

Кросс-царство биопленки, состоящие из грибковых и бактериальных клеток участвуют в различных заболеваний полости рта, таких как эндодонтические инфекции, пародонтит, слизистой инфекции и, прежде всего, раннего детства кариеса. Во всех этих условиях рН в матрице биопленки воздействует на взаимодействие микробов-хозяина и, таким образом, прогрессирование болезни. Настоящий протокол описывает конфокальный метод на основе микроскопии для мониторинга динамики рН внутри кросс-царства биопленок, включая Candida Albicans и Streptococcus mutans. РН-зависимый спектр двойного излучения и окрашивающие свойства социеметрического зонда C-SNARF-4 используются для определения капель рН во внеклеточных областях биопленок. Использование коэффициента рН с зондом требует тщательного выбора параметров изображения, тщательной калибровки красителя и осторожной, пороговой постобработки данных изображения. При правильном использовании метод позволяет быстро оценивать внеклеточный рН в различных областях биопленки и, таким образом, мониторинг как горизонтальных, так и вертикальных градиентов рН с течением времени. В то время как использование конфокальной микроскопии ограничивает профилирование до тонких биопленок размером 75 мкм или менее, использование коэффициента рН идеально подходит для неинвазивного изучения важного фактора вирулентности в биопленках кросс-царства.

Введение

Кросс-царство биопленки, состоящие как грибковых и бактериальных видов участвуют в нескольких патологических условиях в полости рта. Candida spp. часто были изолированы от эндодонтических инфекций1 и от пародонта поражений2,3. В слизистых инфекций, стрептококковых видов из группы мит, были показаны для повышения грибковой биопленки формирования, ткани вторжения, и распространение в обоих в пробирке и морин модели4,5,6,7. Самое интересное, устные перевозки Candida spp. было доказано, что связано с распространенностью кариеса у детей8. Как показано в моделях грызунов, симбиотические отношения между Streptococcus mutans и Candidas albicans увеличивают выработку внеклеточных полисахаридов и приводят к образованию более толстых и кариогенных биопленок9,10.

Во всех вышеупомянутых условиях, раннего детства кариеса, в частности, биопленка рН имеет важное значение для прогрессирования заболевания, и выдающаяся роль биопленки матрицы для развития ацидогенной микросреды11 требует методологии, которые позволяют изучать изменения рН внутри кросс-царства биопленки. Были разработаны простые и точные подходы на основе конфокальной микроскопии для мониторинга рН внутри бактериальных12 и грибковых13 биопленок. С соотношением метрического красителя C-SNARF-4 и пороговым изображением после обработки, внеклеточный рН может быть определен в режиме реального времени во всех трех измерениях биопленки14. По сравнению с другими опубликованными методами для микроскопии на основе рН-мониторинга в биопленках, рН коэффициентеметрия с C-SNARF-4 проста и дешева, потому что она не требует синтеза частиц или соединений, которые включают эталонный краситель15 или использование двухфотонных возбуждения16. Использование только одного красителя предотвращает проблемы с разобщенностью зонда, флуоресцентным кровотечениемчерез,и селективное отбеливание 16,17,18 в то же время позволяет надежной дифференциации между внутри- и внеклеточного рН. Наконец, инкубация красителя осуществляется после роста биопленки, что позволяет изучать как лабораторные, так и на месте выращенные биопленки.

Целью настоящей работы является расширение использования коэффициента рН и предоставление метода изучения изменений рН в биопленках кросс-царства. В качестве доказательства концепции, метод используется для мониторинга рН в биопленки двойного вида, состоящий из S. mutans и C. albicans подвергаются воздействию глюкозы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол по сбору слюны был рассмотрен и одобрен Комитетом по этике округа Орхус (M-20100032).

1. Культивирование кросс-царства Biofilms

  1. Выращивайте S. mutans DSM 20523 и C. albicans NCPF 3179 на табличек агара крови при 37 градусах Цельсия в аэробных условиях.
  2. Перенос отдельных колоний каждого организма в пробирки, наполненные 5 мл инфузии сердца головного мозга (BHI). Расти 18 ч при аэробных условиях при 37 градусах Цельсия.
  3. Центрифуга ночных культур на 1200 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант, resuspend клетки в физиологическом сольнце и настроить OD550 нм до 0,5 для C. albicans (107 клеток /мл) и S. mutans (108 клеток / мл). Разбавить подвеску S. mutans 1:10 стерильным физиологическим сольней (107 клеток/мл).
  4. Пипетка 50 л стерильного раствора слюны, подготовленного по методу де Джонг и др.19,в колодцы оптической нижней 96-хорошей пластины для микроскопии. Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия. Вымойте скважины 3x с 100 зл и л стерильного физиологического солей. Пустые колодцы.
  5. Добавьте 100 кЛ подвески C. albicans к каждому колодцу. Инкубировать при 37 градусах По области в течение 90 мин. Промойте 3x со стерильным физиологическим физиологическим сольем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не опорожнить колодцы полностью во время стирки. Оставьте резервуар в 20 л, чтобы избежать чрезмерных сил сдвига.
  6. Добавьте к каждой скважине 100 л тепло-инактивированной сыворотки крупного рогатого скота (инактивированного при температуре 56 градусов по Цельсию в течение 30 минут). Инкубировать при 37 градусах Цельсия на 2 ч. Вымойте 3x со стерильным физиологическим физиологическим сольем. Очистите скважины, оставив водохранилище в 20 л.
  7. Добавьте 100 кЛ суспензии S. mutans (подготовлено в шаге 1.3) к каждой скважине. Добавьте 150 л бГ, содержащую 5% сахарозы. Инкубировать при 37 градусах По цельсию в течение 24 ч или дольше. При выращивании старых биопленок, изменить среду ежедневно на свежий BHI. В конце фазы роста биопленки кросс-царства, мыть 5x со стерильным физиологическим физиологическим сольнием.

2. Коэффициентеметрическая рН-изображение

ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициентеметрическая рН-изображения должна быть выполнена сразу же после завершения роста биопленки.

  1. Для получения коэффициента метрической визуализации рН используйте перевернутый лазерный сканирующий микроскоп с 63-x маслом или объективом погружения в воду, лазерной линией мощностью 543 нм и системой спектральной визуализации (т.е. детектором META), чтобы обеспечить визуализацию перекрывающихся флуоресцентных сигналов. Используйте инкубатор, чтобы согреть стадию микроскопа до 35 градусов по Цельсию.
  2. Установите детектор для обеспечения обнаружения зеленой флуоресценции от 576-608 нм и одновременного обнаружения красной флуоресценции с 629-661 нм. Выберите соответствующую мощность лазера и получить, чтобы избежать чрезмерного и недостаточного воздействия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспозиция изображений лучше всего видно в палитре изображения с ложной окраски.
  3. Установите размер пинхола до 1 Airy Unit или оптического среза в 0,8 мкм. Установите размер изображения до 512 х 512 пикселей и скорость сканирования до 2. Выберите линию в среднем 2, используя средний вариант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В начале серии экспериментов, убедитесь, что выбранные настройки микроскопа обеспечивает четкий контраст между бактериальными клетками, грибковых клеточных стенок, биопленки матрицы, и грибковой цитоплазмы.
  4. Подготовка 100 л стерильного физиологического солевая, содержащая 0,4% (w/v) глюкозы, тисненок до рН 7. Подготовьте стоковый раствор C-SNARF-4 (1 мМ в диметилсулькидном сульфодоксиде). Добавьте краситель к конечной концентрации в 30 км.
    ВНИМАНИЕ: Носите нитриловые перчатки при обращении с коэффициентеметрическим краситель.
  5. Опустошить одну из скважин с помощью биопленки кросс-царства, оставив резервуар в 20 л. Добавить стерильный солен, содержащий глюкозу и коэффициентеметрический краситель. Поместите 96-колодую пластину на сцену микроскопа и начните визуализацию биопленки.
  6. Приобретайте одиночные изображения или стеки в разных местах биопленки. Отметьте положение X-Y в программном обеспечении микроскопа, чтобы следить за изменениями рН в определенных областях зрения с течением времени. Через регулярные промежутки времени, принимать изображения с лазером выключен, чтобы исправить для детектора смещения.
  7. Повторите шаги 2.4-2.6 для анализа каждой биопленки, выращенной в другой скважине.

3. Калибровка теотриметрического красителя

ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка красителя и установка кривой калибровки могут быть выполнены в другой день, чем коэффициентметрическая рН-изображения.

  1. Подготовьте серию из 50 мМ 2-морфолиноэтефолоновой кислоты (MES) буфертизируется до pH 4.0'7.8 в шагах 0,2 рН единиц при 35 градусах Цельсия. Пипетка 150 л каждого буферного раствора в скважины оптическо-нижней 96-луковой пластины для микроскопии.
  2. Добавьте краситель в заполненные буфером колодцы 96-ну колодца до конечной концентрации в 30 км. Пусть уравновешивать в течение 5 мин.
  3. Разогрейте сцену микроскопа до 35 градусов по Цельсию. Выберите те же настройки микроскопа, что и для социеметрической визуализации рН. Поместите 96-колодую пластину на сцену микроскопа. Сосредоточьтесь на дне колодцев. Приобретите два изображения (зеленый и красный канал) для всех буферных решений, на 5 мкм над нижней частью скважины. Через регулярные промежутки времени, принимать изображения с лазером выключен, чтобы исправить для детектора смещения.
  4. Выполните калибровочный эксперимент в тройном.
  5. Экспортировать все изображения в файлы TIF. Импортировать их в специальное программное обеспечение анализа изображений (т.е. ImageJ20). Вычтите изображения, сделанные с помощью лазера, выключаемого из соответствующих изображений буферных решений, нажав на процесс Калькулятор изображений Вычитание).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости обрезать изображения для устранения артефактов на границах изображения, выполняя прямоугольный отбор с помощью изображения Урожай.
  6. Разделите изображения зеленого канала через изображения красного канала и вычислите среднюю интенсивность флуоресценции в полученных изображениях, нажав на анализ Гистограмма.
  7. Из тройных экспериментов, график средних зеленых / красных соотношений против рН. Используйте специальное программное обеспечение, чтобы соответствовать функции к данным калибровки (т.е. MyCurveFit).

4. Анализ цифровых изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Цифровой анализ изображений может быть выполнен в любой момент после калибровки красителя и коэффициента метрической визуализации рН.

  1. Храните изображения биопленки зеленого и красного каналов в отдельных папках и переименуем обе серии файлов с последовательными числами (например, GREEN_0001). Импортируйте изображения в специальное программное обеспечение для анализа изображений (т.е. ImageJ). Нажмите Анализ (ru) Гистограмма для определения средней интенсивности флуоресценции на снимках, сделанных с помощью лазера, и вычитания значения из изображений биопленки, нажав на процесс Математика Вычитание.
  2. Импорт 2 серии изображений в специальное программное обеспечение анализа изображений (т.е. daime21). Выполните сегментацию изображений красного канала на основе порога(сегмент Автоматическая сегментация Пользовательский порог). Установите «низкий» порог выше интенсивности флуоресценции грибковой цитоплазмы и «высокий» порог ниже интенсивности грибковых клеточных стенок и бактерий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе соответствующих пороговых значений объекты признаются только внеклеточными областями.
  3. Перенесите слой объекта сегментированной серии изображений в серию изображений зеленого канала. Для этого нажмите На сегмент Передача слоя объекта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если контраст между внеклеточными областями и грибковой цитоплазмой слишком слаб в отдельных цветовых каналах, добавьте серию изображений зеленого канала в серию красных каналов до сегментации, нажав на Edit Калькулятор изображений Добавление. Выполните сегментацию, описанную под 4.2, и перенесите слой объекта сегментированной серии изображений как в серию изображений зеленого цвета, так и в красный канал.
  4. Используйте редактор объектов для удаления необъектных пикселей в серии изображений красного и зеленого каналов(Визуализатор Редактор объектов Во всех изображениях Удаление необъектных пикселей). Теперь изображения биопленки очищаются как от бактериальных, так и от грибковых клеток. Экспорт обработанных серий изображений в файлы TIF.
  5. Импортируйте обе серии изображений в ImageJ. ImageJ присваивает интенсивность 0 всем необъектным пикселям. Удалите эти пиксели, разделив серию красных изображений (R1) сама по себе(Процесс Калькулятор изображений Изображение 1: R1; Операция: Разделить; Изображение 2: R1) и умножение результирующей серии изображений (R2) с оригинальной серией красных изображений(Процесс Калькулятор изображений Изображение 1: R1; Операция: Умножьте; Изображение 2: R2). Создается третья серия изображений (R3), идентичная R1, за исключением того факта, что NaN присваивается всем пикселям с интенсивностью 0 в R1. Продолжить таким же образом с зеленым изображением серии.
  6. Используйте фильтр 'Средний'(Процесс Фильтры Среднее (среднее) Радиус (а) 1 пиксель) на красном и зеленом канале серии изображений, чтобы компенсировать шум детектора. Разделите серию изображений зеленого канала на красный канал серии изображений (Процесс Калькулятор изображений Изображение 1: G3; Операция: Разделить; Изображение 2: R3). Полученная серия изображений (G3/R3) показывает зеленое/красное соотношение для всех пикселей объекта.
  7. Рассчитайте среднее соотношение для каждого изображения(Анализ Гистограмма). Применить ложные окраски для лучшего визуального представления соотношений в изображениях (Изображение Таблицы поиска). Преобразуйте зеленые/красные соотношения в значения pH, использующие функцию, установленную под 3.6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После 24 ч и 48 ч, надежные кросс-царства биопленки разработаны в колодце пластин. C. albicans показал различную степень нитевидного роста, а S. mutans образуют плотные скопления высотой до 35 мкм. Одиночные клетки и цепи S. mutans сгруппированы вокруг грибковых гиф, и большие межклеточные пространства показали наличие объемной матрицы(Рисунок S1).

Калибровка коэффициентаметрического красителя дает асимметричную сигмоидальной кривой...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Различные протоколы для выращивания кросс-царства биопленок с участием C. Albicans и Streptococcus spp. были описаны ранее9,22,23,24,25. Тем не менее, нынешняя установка фокусируется на простых условиях роста, графике, совместимом с обычными рабочими днями, сбалансированном видовом составе и развитии объемной матрицы биопленки. Кроме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Анетт Акьяр Томсен и Хавьер Э. Гарсия признаны за отличную техническую поддержку. Авторы благодарят Рубенса Спин-Нето за плодотворные дискуссии по анализу изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Кровяные агаровые пластиныStatens Serum Institut677
Мозговая инфузия сердцаOxoidCM1135
Мозговая инфузия сердца + 5 % сахарозыBDH лабораторные принадлежности10274
Candida albicansНациональная коллекция патогенных грибовNCPF 3179
D-(+)-глюкозаSigma-AldrichG8270
daime: анализ цифровых изображений в микробной экологииUniversitä t WienN/AFreeware; Версия 2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
ДиметилсульфоксидLife TechnologiesD12345
Фетальная бычья сывороткаGibco Life technologies10270
GS-6R рефрижераторная центрифугаBeckmanN/A
ImageJНациональные институты здравоохраненияН/Дбесплатное программное обеспечение; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
JavaOracleN/aFreeware, необходимый для запуска ImageJ; Версия 8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well BlackIbidi89626
MyCurveFitMyAssays Ltd.Н/Д
2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота (MES) буферBioworld700728
PHM210 pH-метрРадиометр Аналитический
план-Апохромат 63x масляный иммерсионный объективZeissN/ANA=1,4
SNARF®-4F 5-(и-6)-карбоновая кислота LifeTechnologiesS23920
Стерильный физиологический растворVWR6404
Streptococcus mutansDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenDSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PCVWRN/A
XL ИнкубаторPeCONN/A
ZEISS LSM 510 METAZeissN/A

Ссылки

  1. Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
  2. Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527(2019).
  3. De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
  4. Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
  5. Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
  6. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967(2009).
  7. Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
  8. Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
  9. Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
  10. Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407(2017).
  11. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  12. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622(2016).
  13. Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
  14. Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
  15. Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
  16. Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
  17. Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
  18. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
  19. de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
  20. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  21. Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
  22. Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457(2016).
  23. Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
  24. Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242(2017).
  25. Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920(2017).
  26. Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
  27. Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
  28. Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
  29. Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299(2011).
  30. Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).
  31. Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
  32. Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Мониторинг внеклеточного pHpH-ратиометриязонд C-SNARF-4Candida albicansStreptococcus mutansрост биопленкисегментация изображенийфлуоресцентная визуализация
Мониторинг внеклеточного рН в кросс-Королевства Biofilms с помощью конфокальной микроскопии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.