Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Характеристика влияния миграстатических ингибиторов на 3D-вторжение опухолевых сфероидов с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения

6.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60273

⸱

16 сентября 2019 г.

 ,  , 
1School of Applied Sciences, University of Huddersfield, 2Laboratory of Radiotherapy and Experimental Radiation Oncology, Humbertus Wald Tumorzentrum, University Cancer Center Hamburg, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

В этой статье

Краткое содержание

Влияние миграстатических ингибиторов на миграцию клеток рака глиомы в трехмерных (3D) инватифицированных анализах с использованием ингибитора гистона деацетилазы (HDAC) характеризуется конфокальной микроскопией высокого разрешения.

Аннотация

Обнаружение и разработка лекарственных средств в исследованиях рака все чаще основывается на экранах лекарств в 3D-формате. Новые ингибиторы, нацеленные на мигрирующие и инвазивные потенциал раковых клеток, и, следовательно, метастатическое распространение болезни, в настоящее время обнаружены и рассматриваются в качестве дополнительного лечения в высокоинвазивных раковых заболеваний, таких как глиомы. Таким образом, требуется создание данных, позволяющих провести детальный анализ клеток в 3D-среде после добавления препарата. Описанная здесь методология, сочетающая анализ ысфероидов с высоким разрешением захвата изображений и анализа данных с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM), позволила детально охарактеризовать последствия потенциального антимиграционного ингибитора МИ-192 на клетках глиомы. Сфероиды были созданы из клеточных линий для анализа вторжения в низких адептов 96-колодцев, а затем подготовлены для анализа CLSM. Описанный рабочий процесс был предпочтительнее по сравнению с другими широко используемыми методами генерации сферидов из-за легкости и воспроизводимости. Это, в сочетании с улучшенным разрешением изображения, достигнутым с помощью конфокальной микроскопии по сравнению с обычными широкоугольными подходами, позволило выявить и проанализировать различные морфологические изменения в мигрирующих клетках в 3D-среде после лечение миграстатическим препаратом Ми-192.

Введение

Трехмерные сфероидные технологии для доклинического открытия лекарственных средств и разработки потенциальных лекарств от рака все чаще отдают предпочтение по сравнению с обычными экранами лекарств; таким образом, наблюдается более развитие мигратического - миграции и предотвращения вторжения - наркотиков. Обоснование этих событий в лечении рака ясно: 3D сфероидных анализов представляют собой более реалистичный подход для скрининга потенциальных противораковых препаратов, поскольку они имитируют 3D архитектуры опухоли более точно, чем монослой культур клеток, более точно подытоживая лекарственное взаимодействие (кинетику) и позволяющий охарактеризовать активность препарата в условиях, связанных с опухолью. Кроме того, рост устойчивости к химиотоксическим препаратам во многих типах рака и высокие показатели смертности среди онкологических больных из-за метастазов, потенцяющихся благодаря способности раковых клеток мигрировать в отдаленные места опухоли, поддерживает включение химиотерапевтических агентов ориентации миграционный потенциал раковых клеток в качестве адъювантного лечения в будущих клинических испытаний рака1. Это особенно верно при высокоинвазивных раковых заболеваниях, таких как высококачественные глиобластомы (ГБМ). GBM управление включает в себя хирургию, лучевую терапию и химиотерапию. Однако, даже при комбинированном лечении, большинство пациентов рецидива в течение 1 года с начала диагностики со средней выживаемости 11-15 месяцев2,3. Огромные достижения в области 3D-технологий были сделаны за последние несколько лет: вращающиеся системы, микрофабрикаты структур и 3D эшафот, и другие индивидуальные анализы постоянно совершенствуются, чтобы позволить рутинное тестирование в больших масштабах4, 5,6,7. Однако результаты, полученные в результате этих анализов, должны быть проанализированы значимым образом, поскольку интерпретация данных часто затрудняется попытками анализа 3D-данных с помощью 2D-систем анализа изображений.

Несмотря на предпочтительность с точки зрения скорости приобретения изображения и снижения фототоксичности, большинство широкоугольных систем остаются ограниченными резолюцией8. Таким образом, помимо данных считывание из-за эффективности препарата, подробное воздействие действия препарата на 3D клеточные структуры мигрирующих клеток неизбежно теряется, если наснимки с помощью широкоугольной системы. И наоборот, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) захватывает высококачественные оптически секционные изображения, которые могут быть реконструированы и представлены в 3D пост-приобретении с помощью компьютерного программного обеспечения. Таким образом, CLSM легко применим к сложным 3D-клеточным структурам, что позволяет проводить анализ воздействия антимиграстатических ингибиторов на 3D-структуры и проводить углубленный анализ механизмов миграции клеток. Это, несомненно, будет определять будущую разработку миграстатических препаратов. Здесь описан комбинированный рабочий процесс генерации сфероидов, медикаментозного лечения, протокола окрашивания и характеристики с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Поколение сотовых сфероидов

День 1

  1. Подготовьте стандартную среду культуры, как того требует исследуемая линия ячейки.
  2. Провести все ткани культуры связанных шагов в ткани культуры капот с использованием стерильных методов обработки.
  3. Трипсинизуйте и подсчитайте раковые клетки. Используйте 20 мл клеточной подвески на тарелку. Держите клеточные суспензии в четко обозначенных стерильных универсальных трубках.
  4. Добавьте в каждый колодец предопределенное количество ячеек. Как первоначальное количество клеток, так и максимальный размер сфероида, зависят от скорости пролиферации исследуемой клеточной линии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для установленных линий клеток глиомы, таких как U251 и KNS429,10, 5 х 103 клетки / мл будет производить микроскопически видимых сфероидов (200 или 800 мкм) после 4 дней инкубации.
  5. Resuspend клетки в универсальных трубах нежной инверсии, чтобы избежать слипания клеток. Пипетка 200 л клеточной подвески в каждую скважину из 96-колодца пластины. Если все скважины не требуются, желательно добавить 200 л 1x PBS к каждой пустой скважине, чтобы избежать испарения.
  6. Инкубировать клетки в инкубаторе в обычном режиме при 37 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные линии, такие как линии клеток рака глиомы, образуют сфероиды в пределах 24 ч. Разрешить 3D клеточной архитектуры, чтобы сформировать путем инкубации сфероида для 72 ч.

День 2

  1. Проверка клеток с помощью ярко-поляной микроскопии после 24 ч. В зависимости от клеточной линии клетки могут образоваться в сфероиде, обнаруживаемом в нижней части скважины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установленные линии клеток рака глиомы легко образуют сфероиды в течение 24 ч. Пациент производные линии рака глиомы может занять до 1-2 недель.

2. Коллаген вторжения Асса

День 3

  1. Поместите коллаген, 5x культуры среды, 1 М НаОГ, и один 20 мл трубки на льду.
  2. Тщательно и медленно добавить 10,4 мл холодного коллагена в охлажденной трубки культуры. Избегайте пузырьков. Это количество коллагена достаточно для одной пластины 96-наилучшим образом. Подъемвозможен, но рекомендуется, чтобы одна трубка 20 мл на тарелку готовилась одновременно.
  3. Аккуратно добавьте 1,52 мл холодной стерильной 5x культуры среды. Избегайте пузырьков.
  4. Непосредственно перед использованием, аккуратно добавьте 72 л холодного стерильного 1 M NaOH. Храните раствор на льду.
  5. Смешайте осторожно путем пипетки. Избегайте пузырьков. Эффективное смешивание приводит к изменению цвета (от красного до оранжево-красного (pH 7.4) в среде. Оставьте смесь на льду до использования.
  6. Решающий шаг: Удалите 190 л супернатанта с 96-хорошо подготовленной пластины на 1-й день. Будьте очень осторожны, чтобы не беспокоить сфероидов, которые образуются в нижней части колодца. Используйте пипетку под углом к стороне, а не к центру, колодца.
  7. Аккуратно добавьте 100 кл/л коллагеновой смеси к каждому колодцу. Для предотвращения любых сфероидных нарушений, pipette смесь вниз стороне скважины. Избегайте пузырьков. Держите все оставшиеся коллагеновы смеси в 20 мл трубки при комнатной температуре для оценки полимеризации.
  8. Инкубировать пластину в инкубаторе, по крайней мере 10 минут, чтобы коллаген полимеризации. В качестве ориентира, если оставшийся коллаген установил, став полутвердым и губчатым, сфероиды готовы к лечению с помощью ингибитора.
  9. Добавьте препараты или ингибиторы с концентрацией 2x в культурную среду. Добавьте среду мягко к каждому колодцу (100 л на колодец). Опять же, pipette среды вниз стороне хорошо, чтобы избежать сфероидов нарушения.
  10. Наблюдайте и образуйте каждый сфероид с помощью ярко-поляной микроскопии, иногда T q 0 h, 24 h, 48 h и 72 h для оценки активности препарата. Затем верните тарелку в инкубатор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от инвазивного поведения клеточной линии, миграция от исходного сфероидного ядра может наблюдаться с 24 ч.

3. Подготовка коллагеновых встроенных сфероидов и мигрирующих клеток для конфокальной микроскопии

  1. Поместите тарелку в капюшон культуры ткани и аккуратно удалите супернатант (200 л). Опять же, позаботьтесь, чтобы не беспокоить сфероид и не прикасаться к коллагену, так как это может помешать коллагеновой вилке.
  2. Замените супернатант 100 зл 1x PBS. Повторите этот шаг мытья 3x.
  3. Снимите окончательную стирку и замените 4% формальдегида в 1x PBS (100 л на скважину).
    ПРЕДЕКТО: Формальдегид является потенциальным канцерогеном. Обработка с осторожностью в соответствии с рекомендациями по охране здоровья и безопасности.
  4. Поместите 96-хорошую тарелку на лабораторную скамейку, накройте фольгой и оставьте на 24 ч при комнатной температуре.
  5. Аккуратно удалите формальдегид и замените 1x PBS. Повторите это 1x PBS мыть 3x.
  6. Подготовка 0,1% Тритон X-100 в 1x PBS. Удалите 1x PBS мыть и заменить 100 зл и l раствора Triton X-100. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. В то же время, подготовить блокирующий раствор с 1x PBS и 0,05% обезжиренное сухое молоко и тщательно перемешать.
  7. Удалить Triton X-100 и мыть 3x с 1x PBS. Добавьте 100 зл блокирующего раствора к каждой скважине и инкубируйте в течение 15 минут.
  8. Разбавить необходимые первичные антитела в блокировании буфера при заранее определенной концентрации. Здесь используйте анти-мышь IgG ацетилированных тубулина антитела (1:100).
  9. Центрифуге первичной антитела блокирования буфера смесь в течение 5 мин на 15,682 х г. Тщательно удалите блокирующий раствор и добавьте супернатант (25–50 л) к каждому колодцу. Инкубировать в темноте при комнатной температуре 1 ч.
  10. Удалите раствор антитела и промойте 3x с 1x PBS (100 л на хорошо).
  11. Разбавить вторичное антитело в блокирующем буфере при рекомендуемой или предопределенной концентрации в дополнение к любым дополнительным флуоресцентным пятнам. Здесь используйте 1:500 анти-мышонок фторофор-488 конъюгированных антител, фаллоидин-594 (1:500) для актимного окрашивания и пятна ДНК (DAPI).
  12. Опять же, центрифуга вторичного раствора антитела в течение 5 минут при 13000 об/мин.
  13. Удалите блокирующий раствор из каждой скважины и добавьте 25-50 л вторичного антитела/фаллоидина/DAPI смеси. Инкубировать в темноте 1,5 ч при комнатной температуре.
  14. Удалить вторичный антитела-краситель раствор и мыть 3x с 1x PBS (100 л на хорошо).
  15. Тщательно поднимите отдельные коллагеновые пробки путем всасывания с помощью пластиковой пипетки (200 л) на центр высококачественной простой стеклянной горки.
  16. Добавьте одну каплю подходящего крепления к разъему коллагена, гарантируя, что вилка полностью покрыта. Избегайте пузырьков.
  17. Применить coverslip оптимальной толщины для микроскопа цели, которые будут использоваться для визуализации и позволяют установить на ночь. Храните горки при комнатной температуре в темноте.

4. Флуоресценция Микроскопия

  1. Захват флуоресцентных изображений с помощью подходящего конфокального микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Трехмерная сфероидная технология продвигает понимание лекарственно-опухолевых взаимодействий, поскольку она более репрезентативной для специфической для рака среды. Поколение сфероидов может быть достигнуто несколькими способами; в этом протоколе использовались пластины с низким содержанием 96 колодцев. После тестирования нескольких продуктов от разных производителей, пластины, используемые здесь были выбраны потому, что они последовательно выполняется лучше всего с точки зрения успешного...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описан новый способ создания сфероидов раковых клеток для выявления мигратической активности препарата с помощью конфокальной микроскопии с высоким разрешением. Использование низких адепт пластин над другими методами, такими как висит капель15, способствовало средства генерации воспроизводимых и однородных сфероидов для использования в миграции коллагена и вторжения анализов. Критическими моментами в этом протоколе являются удаление среды роста из 96-хорошо пластины до клеточной сфероидвирования в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить профессора Криса Джонса за содействие линии клеток KNS42. Конфокальный микроскоп «Зейсс» с AiryScan, используемым в этой работе, является частью проекта по инновациям и инкубации Хаддерсфилда (HIIP), финансируемого за счет партнерства по развитию предпринимательства в Лидсе (LEP). Кредит для микроскопа изображение Рисунок 3: Карл Зейсс Микроскопия GmbH, microscopy@zeiss.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коллаген I, крысиный хвост, 100 мгCorning354236для анализа на инвазию глиомы; это предлагается многими дистрибьюторами/производителями, и его необходимо определить как для типа предполагаемого анализа, так и для используемых клеточных линий. Для клеточных линий рака глиомы предпочтительным выбором является коллагеновый крысиный хвост типа 1 (например, Corning). Коллаген должен сохраняться при 4°С; C, в темноте, пока не потребуется. Не рекомендуется смешивать коллаген из разных партий, так как это может повлиять на консистенцию полимеризованного коллагена.    
Покровные стекларазличныеразличные для микроскопической визуализации
DMEM порошокSigmaD5648необходим в 5-кратной концентрации для коллагенового раствора для анализа инвазии глиомы;   Она может быть приобретена в порошкообразной форме, приготовлена в воде двойной дистилляции и, в зависимости от конечного состава питательной среды, дополнена любыми необходимыми добавками. Полный 5-кратный раствор должен быть отфильтрован через шприцевую фильтрующую систему (0,22 мкм; н) перед использованием.
Эмбриональная сыворотка теленкаSigmaF7524-500MLнеобходима для культивирования клеток глиомы клеточных линий
Стеклянные стекларазличныеразличныедля микроскопической визуализации
DMEMGibco41965062необходимы для культивирования клеток клеточных линий глиомы
ИнгибиторTocrisразличныеразличные – по экспериментальному дизайну; ингибиторы можно приобрести у таких производителей, как Selleckchem и Tocris. Эти производители предлагают подробное описание характеристик ингибитора, ссылки на соответствующие ссылки и рекомендации по рабочим концентрациям. Как и все ингибиторы, они могут быть потенциально токсичными, и с ними следует обращаться в соответствии с рекомендациями по охране здоровья и безопасности. Ингибиторы готовятся в виде стоковых растворов в соответствии с рекомендациями производителя. В качестве примера мы использовали ингибитор миграстатики МИ-192, чтобы продемонстрировать использование таких ингибиторов. Таким образом, мы протестировали ряд ингибиторов миграстатики с сопоставимыми результатами.
Монтантыразличныеразличные для микроскопической визуализации
NaOH (1 M)различные различныеNaOH могут быть как приобретены с необходимой молярностью, так и приготовлены из твердой формы. Приготовленный раствор следует стерилизовать фильтром с помощью шприцевой фильтрующей системы. One M NaOH вызывает коррозию, поэтому при приготовлении раствора следует соблюдать осторожность.
Параформальдегид различныеразличныедля фиксации сфероидов и клеток; составлять на 4%, предостерегать от опасности для здоровья, следить за соблюдением норм охраны здоровья и техники безопасности для коллагенового раствора для инвазионного анализа
Pastettes (градуированная пипетка, 3 мл)различныедля инвазионного анализа, удаления раствора
PBS, стерильные для тканевой культурыSigmaD1408-500ML   Нужен для культивирования клеток глиомы клеточных линий и смывок для окрашивания
Pen/strepping (антибиотики)SigmaP4333необходим для культивирования клеток глиомы клеточных линий
Первичное антитело, вторичное антитело, DAPI, фаллоидинразличныеразличныесуществует множество производителей этих реагентов, для вторично меченых антител мы рекомендуем Alexa Fluor (Molecular Probes). В качестве первичных антител мы использовали мышиное антитело к ацетилированному тубулину (1/100, Abcam). Для вторичных антител мы использовали конъюгированное антитело Alexa Fluor 488 против мышей в масштабе 1/500, молекулярные зонды. Для ядерного окрашивания мы использовали DAPI (многие производители) и актиновый краситель Phalloidin (многие производители), оба использовались при рекомендуемом разведении 1/500.
Бикарбонат натрияSigmaS5761необходим для коллагенового раствора для анализа на инвазию глиомы в 5-кратной концентрации
Пируват натрияSigmaP5280необходим для коллагенового раствора для анализа на инвазию глиомы в 5-кратной концентрации
ТрипсинSigmaT4049для трипсинизации
Сверхнизкие прикрепляющие пластиныSigma/NuncCLS7007-24EAдля анализа на инвазию глиомы; Требуется планшет с низкой адгезией, при этом предпочтительны 96-луночные планшеты, чтобы обеспечить крупномасштабный скрининг исследуемых соединений. В продаже имеется несколько пластин с низкой адгезией; Рекомендуется протестировать различные пластины для оптимального создания сфероида. По нашему опыту, Costar Ultra Low Cluster с крышкой и круглым дном лучше всего подходит для генерации сфероидов из клеток рака глиомы с точки зрения 100% образования сфероидов и воспроизводимости. Эти планшеты также были успешно использованы для получения сфероидов глиомы из материала, полученного от пациента, клеток рака мочевого пузыря и яичников в нашей лаборатории. Кроме того, стволовые или прогениторные нейросферы могут быть использованы в этих планшетах для облегчения генерации стандартизированных нейросфер-сфероидов
Stripettes (серологические пипетки, стерильные, 5 мл и 10 мл),различные, например, CostarCLS4488-50; CLS4487-50для культивирования тканей и получения коллагена
различных многоканальных (50 - 250 мкм; L) и одноканальные пипетки (10 мкм; L, 50 μ L, 200 μ L 1 мл)различныеразличныедля работы с клетками и сфероидами
Широкопольная микроскопияразличная Здесь широкопольные флуоресцентные изображения были получены с помощью системы визуализации клеток EVOS FL (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM, оснащенной масляным объективом Plan Apochromat 63x 1.4 NA. Диодные лазеры с длиной волны 405 нм, аргоном 458/488/514 нм и HeNe 594 нм использовались для возбуждения Phalloidin 594, Alexa Fluor 488 и DAPI соответственно. Для каждого изображения был получен один репрезентативный оптический срез, при этом все настройки, как до, так и после съемки, были сохранены для сравнения. Все изображения были впоследствии обработаны с помощью соответствующего программного обеспечения для обработки изображений Zen и Adobe Photoshop.
различные

Ссылки

  1. Gandalovičová, A., et al. Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges. Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).
  2. Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clinical and Translational Oncology. 18, 1062(2016).
  3. Foreman, P. M., et al. Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma. Neurotherapeutics. 14, 333(2017).
  4. Rodrigues, T., et al. Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling. Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).
  5. Sirenko, O., et al. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).
  6. Wu, Q., et al. Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening. Biomedical Microdevices. 20, 82(2018).
  7. Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform. Scientific Reports. 8, 253(2018).
  8. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
  9. Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. Human Tumor Cells in Vitro. , Springer US. Boston. 175-206 (1975).
  10. Takeshita, I., et al. Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42. Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).
  11. Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration. Journal of Cell Science. 132, (2019).
  12. Bacon, T., et al. Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation. Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).
  13. Jackman, L., et al. Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach. Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).
  14. Bhandal, K., et al. Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192. Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).
  15. Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).
  16. Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays. Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).
  17. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29(2012).
  18. Härmä, V., et al. Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis. PLOS ONE. 9 (5), e96426(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3D
Характеристика влияния миграстатических ингибиторов на 3D-вторжение опухолевых сфероидов с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.