Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Time-Lapse 2D Изображение фагоцитарной активности в M1 Макрофаг-4T1 Мышь Mammary Карцином Клетки в ко-культур

8.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60281

⸱

14 декабря 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Faculty of Biotechnology and Biomolecular Sciences, Universiti Putra Malaysia, 2Institute of Tropical Forestry and Forestry Products (INTROP), Universiti Putra Malaysia, 3Department of Biomedical Science, Faculty of Medicine, University of Malaya, 4Agro-Biotechnology Institute (ABI), National Institute of Biotechnology Malaysia (NIBM)

В этой статье

Краткое содержание

Макрофаг фагоцитной активности против раковых клеток, в частности 4T1 мыши молочных клеток карциномы, был изображен в этом исследовании. Была создана и наблюдалась модель сокультуры живых клеток с использованием сочетания флуоресцентной и дифференциальной контрастной микроскопии помех. Эта оценка была изображена с помощью программного обеспечения для визуализации для разработки многоточечного видео.

Аннотация

Опухолевые макрофаги (TAMs) были определены в качестве важного компонента для роста опухоли, вторжения, метастази и устойчивости к терапии рака. Тем не менее, опухолевые макрофаги могут быть вредны для опухоли в зависимости от микроокружения опухоли и могут обратимо изменять свои фенотипические характеристики, либо антагонизировать цитотоксическую активность иммунных клеток или усиливая противоопухолевую реакцию. Молекулярные действия макрофагов и их взаимодействие с опухолевыми клетками (например, фагоцитоз) не были широко изучены. Таким образом, взаимодействие между иммунными клетками (M1/M2-подтип TAM) и раковыми клетками в микроокружении опухоли в настоящее время находится в центре внимания исследований иммунотерапии рака. В настоящем исследовании, модель живой клеточной кокультуры индуцированных макрофагов M1 и мыши ныхциномы 4T1 карциномы клетки была разработана для оценки фагоцитарной активности макрофагов с помощью замедленного видео функция с использованием фазового контраста, флуоресцентные, и дифференциальные помехи контраста (DIC) микроскопии. Настоящий метод может наблюдать и документировать многоточечную живую визуализацию фагоцитоза. Фагоцитоз 4T1 клеток макрофагов M1 можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии перед окрашиванием 4Т1 клеток с carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). В настоящее время издание описывает, как сокультуры макрофагов и опухолевых клеток в одной визуализации блюдо, поляризовать M1 макрофагов, а также записывать многоточечные события макрофагов, охватывающих 4T1 клеток в течение 13 ч культуры.

Введение

Макрофаги являются первой линией иммунной защиты и играют определенную роль в организации иммунных реакций против патогенных микроорганизмов и посторонних материалов, включая раковые клетки. Они являются специализированным фагоцитом, который разрушает и избавляется от нежелательных частиц в организме. Макрофаги способствуют защитные функции, такие как очистка апоптотические клетки и микроорганизмы и вербовка других иммунных клеток1. Макрофаги могут различаться на два различных типа, M1 и M2 макрофаги, в ответ на экологические сигналы2. M1-поляризованные макрофаги (т.е. классически активированные макрофаги) активируются цитокиновым интерфероном-Я (IFN-я) и липополисахаридами (LPS) и участвуют в воспалительной реакции, расчистке патогенов, эффективном фагоцитозе и опухолевом иммунитете3,4. Макрофаги M2 тесно связаны с опухолевыми макрофагами (TAMs) и обладают противовоспалительными и опухолевыми свойствами4.

Фагоцитоз, производный от древнегреческого (фагейн), что означает "пожирать", (kytos), что означает "клетка", и -osis, что означает "процесс"5. Фагоцитоз – это процесс, опосредованный рецепторами, в ходе чего фагоциты (включая макрофаги, моноциты и нейтрофилы) убивают и поглощают вторгающиеся патогены, очищают посторонние частицы и очищают апоптотический клеточный мусор. Опухолевые макрофаги (TAMs) находятся в строми в различных опухолях, включая рак молочной железы, и имеют про-опухолевые функции6,7, что приводит к резистентности к фагоцитозу. Детальный механизм фагоцитоза опухолевых клеток макрофагов пока не понятен.

Это исследование представляет собой двухступенчатый метод: 1) 4T1 мыши молочных клеток карциномы и M1-поляризованных макрофагов cocultured, и 2) фагоцитарной активности макрофагов оценивается с помощью живой-клеточной видеомикроскопии. CFSE флуоресцентный краситель был использован для испачкать 4T1 мыши молочных клеток карциномы. Пятна этикетки 4T1 клетки, чтобы отличить их от cocultured M1 макрофагов в рамках одной визуализации блюдо. RAW 264.7 макрофаги поляризуются с LPS и IFN-З в фенотип M1. Для обеспечения полной поляризации была проведена иммуностогирование анти-iNOS антителами, спряжение к FITC. Впоследствии, многоточечный ряд замедленного изображения был приобретен для наблюдения за несколькими событиями, в том числе фагоцитоз, в рамках кокультуры.

Более глубокое понимание взаимодействий между опухолевыми клетками и макрофагами может привести к потенциальной иммунотерапии рака. Визуализация в реальном времени предлагает детальное представление о клеточной динамике в обстановке в реальном времени и используется для изучения миграции клеток, фенотипического скрининга, апоптоза и цитотоксичности8,9 в неврологии, биологии развития и открытии наркотиков. Хотя предлагаемой опухолью в этом исследовании является рак молочной железы, метод также может быть применен к нескольким клеткам-мишеням и различным клеткам-эффекторам.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Разделы 1'6 описывают модель кокультуры клеток карциномы 4T1 мыши и макрофагов мыши RAW 264.7. В разделе 7 описывается замедленной оценки фарафахM M1, которые могут быть 4Т1.00.

1. Культирование 4T1 мыши молочных клеток карциномы и RAW 264.7 мышь макрофаги

  1. Оттепель флакон криогенно сохранившихся 4T1 и RAW 264.7 проход 6 клеток нежным возбуждением в водяной бане при температуре 37 градусов по Цельсию или нормальной температуре роста для клеточных линий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оттаивание должно быть сделано быстро, примерно в течение 2 минут. Чтобы избежать загрязнения, удалите флакон из водяной ванны и обеззараживайте его, распыляя 70% этанола. Чтобы избежать генетического дрейфа, особенно для макрофагов, используйте низкое количество проходов (т.е. менее 20).
  2. Разбавить оттаять клетки в 10 мл полной среде DMEM в 15 мл конической трубки и центрифуги клетки на 600 х г в течение 5 минут для получения клеточной гранулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полная среда DMEM дополнена 10% (v/v) сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS), 200 U/mL пенициллином/стрептомицином, и 2 мМ L-глютамина используется во всем протоколе.
  3. Тщательно аспирируйте носители, resuspend клетки в 8 мл полной среде и передачи в 25 см2 ткани культуры обработанных колбы. Культура как 4T1 и RAW 264.7 клетки в полной среде DMEM на 37 градусов по Цельсию с 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Resuspend клетки гранулы осторожно и добавить подвески клетки в культуре колба капля за каплей, чтобы избежать убийства клеток.
  4. После 1 недели культивирования, чтобы позволить клеточной прилипания, контролировать колбу ежедневно и добавить 8 мл полного DMEM среды по мере необходимости.

2. Иммуностоинг M1 поляризованных RAW 264.7 макрофагов

  1. По мере того как вслюхость RAW 264.7 клеток достигает 70-80%, откажитесь от культурных носителей и аккуратно промыть 2x с по крайней мере 2 мл PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед посевом RAW 264.7 клеток, убедитесь, что не было дифференциации клеток (т.е. дендрит-как фенотип и / или увеличение размера клетки). Если изменения клеточной морфологии видны, отбросьте культуру и оттаивните новую клеточную линию от более раннего флакона прохождения.
  2. Подготовьте макрофаги для сбора, аккуратно выбив аяде клеточного клеточного с помощью клеточного скребока и перенесите их в коническую трубку 15 мл.
  3. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и подготовить клеточной подвески 1 х 105 клеток / блюдо с помощью полного DMEM среды.
  4. Семя 2 мл макрофагов подвесной в два изображения блюд. Инкубировать клетки 2'3 ч при 37 градусах Цельсия с 5% CO2, чтобы позволить присоединение клеток.
  5. Подготовка M1 поляризации средств массовой информации, добавив 100 нг / мл LPS и 20 нг / мЛ IFN-я в полной DMEM среднего10,11.
  6. Откажитесь от культуры супернатанта от макрофагов и тщательно промыть монослой в блюде 2x, по крайней мере 1 мл PBS.
  7. Добавьте 2 мл средств поляризации M1 в одну из посуды, позволяют RAW 264.7 клеткам индуцировать фенотип макрофага M1, и инкубировать 2-3 ч при 37 C с 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Семена RAW 264.7 макрофагов в изображении блюдо с DMEM дополняется 10% FBS в качестве контроля для анти-iNOS антитела окрашивания. Этикетка изображений блюда RAW (контроль) и M1 макрофагов (LPS и IFN-я поляризованы), соответственно.
  8. Перед иммуноанализом исправьте клетки макрофагов RAW 264.7 и M1, используя 2 мл параформальдегида и инкубируя 15 мин при температуре 37 градусов по Цельсию (комнатная температура, RT).
  9. Удалить супернатант и мыть монослой ячейки с 1 мл PBS по крайней мере 3x.
  10. Утолить 2 мл 50 мм хлорида аммония в PBS и инкубировать в течение 15 минут на RT.
  11. Пермяки с использованием 2 мл 0,3% Тритон X-100 в PBS в течение 15 минут на RT.
  12. Удалить супернатант и мыть монослой ячейки с 1 мл PBS по крайней мере 3x.
  13. Блок с использованием 2 мл 10% FBS в PBS в течение 30 минут на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирующий шаг в иммуностоидинге заключается в том, чтобы свести к минимуму неспецифические связывания антител в клетке.
  14. Удалить супернатант и мыть монослой ячейки с 1 мл PBS по крайней мере 3x.
  15. Инкубировать с 2 мл анти-iNOS-FITC в PBS и 1% FBS ночь при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этикетка клетки с использованием соответствующего разбавления антител в соответствии с рекомендациями производителя. Защитите блюда от света, покрывая их алюминиевой фольгой с этого момента.
  16. Удалить супернатант и мыть монослой ячейки с 1 мл PBS по крайней мере 3x.
  17. Инкубировать 1 мл 300 нм 6-диамидино-2-фенилиндинол (DAPI) в визуализации блюда для изображений в течение 10 минут в 37 градусов по Цельсию, в темноте, покрывая алюминиевой фольгой.
  18. Вымойте клетки с 1 мл PBS по крайней мере 3x и добавить 1 мл полного DMEM среды в изображении блюд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки теперь готовы к флуоресценции изображений. Установка микроскопа потребует перевернутой стадии и возбуждания фильтров для выбранных пятен (в данном случае, FITC и DAPI).
  19. Включите микроскоп и загрузите программное обеспечение для визуализации. Установите изображение блюдо на микроскоп и настроить фокус для наблюдения RAW 264.7 и M1 макрофагов. Оптимизируйте внешний вид фазовых контрастных изображений FITC и DAPI, регулируя передаваемые свет и время экспозиции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начните визуализацию, когда все точки находятся в фокусе и каналы оптимизированы.
  20. Захват фазового контраста FITC и DAPI изображения(рисунок 1).

3. Посев 4T1 мыши молочных клеток карциномы

  1. По мере того как вслюхость 4T1 клеток достигает 70-80%, откажитесь от культурных носителей и аккуратно промыть 2x, по крайней мере, 2 мл PBS. Добавьте 1 мл претеплового трипсина, чтобы разъединить клетки и инкубировать до 20 мин при 37 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за клетками под микроскопом. Отдельные ячейки будут округлены.
  2. После того, как клетки отсоединяются, перенесите их в коническую трубку 15 мл и добавьте 2 мл предварительно разогретого полного DMEM-среды для активации трипсина. Аккуратно рассеять среду путем pipetting поверхности слоя клетки для восстановления клеток. Затем, центрифуга на 600 х г в течение 5 минут, чтобы получить клетку гранулы.
  3. Удалите супернатант и resuspend гранулы в 10 мл предварительно разогретой полной среды DMEM.
  4. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и семян 1 х 105 4T1 клеток в 2 мл полной среде DMEM в каждом из двух 35 мм стеклянного дна визуализации блюда, обработанные тканью культуры. Инкубировать клетки на ночь при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культура 4T1 клетки в одном из изображений блюда с M1 поляризации средств массовой информации и этикетки 4T1-индуктор (контроль). Это необходимо для обеспечения нормального роста 4T1 клеток при воздействии индукторов.

4. Маркировка жизни 4T1 мыши молочных клеток карциномы с использованием CFSE окрашивания

  1. Во-первых, удалить существующие средства массовой информации из 4T1 клеток изображений блюд. Вымойте монослой клетки по крайней мере 2x с 1 мл PBS.
  2. Приготовьте 5 КМ раствора окрашивания CFSE, разбавив CFSE в 1 мл PBS. Добавьте 1 мл из 5 мкм CFSE окрашивающий раствор в каждое блюдо для визуализации и инкубировать клетки в течение 20 минут при РТ или 37 градусов по Цельсию, в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этикетка клеток, используя соответствующую концентрацию CFSE рабочей в соответствии с рекомендациями производителя и предварительных экспериментов для получения оптимальной концентрации окрашивания CFSE. Эффективность маркировки будет выше, если CFSE разбавляется в PBS.
  3. Утолить окрашивание, добавив равный объем полной среды DMEM, содержащей 10% FBS и окрашивающий раствор для клеток и инкубировать в течение 5 мин на RT в темноте.
  4. Откажитесь от CFSE-содержащего раствора и промойте клетки 1x с равным объемом культурных носителей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 4T1 клетки в настоящее время флуоресцентно помечены.
  5. Верните ячейки 4T1-CFSE в стандартные условия культуры на RT с 5% CO2.

5. Посев RAW 264.7 мышь макрофаги и coculture с 4T1

  1. Как вольность RAW 264.7 достичь 70-80%, отказаться от культуры средств массовой информации и мягко промыть 2x, по крайней мере 2 мл PBS.
  2. Подготовьте макрофаги для сбора, аккуратно выбив аяде клеточного клеточного с помощью клеточного скребока и перенесите их в коническую трубку 15 мл.
  3. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и подготовьте клеточную суспензию 1 х 105 ячеек/мл, разбавив оставшийся раствор полной средой DMEM в соответствии с плотностью посева.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерно сливочные клетки в кокультурах могут серьезно уменьшить фагоцитоз. В этом исследовании, посев носоотношение макрофагов: раковые клетки были скорректированы в соотношении 1:1. Соотношение может быть скорректировано в зависимости от агрессивности опухолевых клеток и происхождения макрофагов.
  4. Перед сокультивом отбросьте культурный супернатант из 4Т1 клеток, посеянных за день до этого (шаг 4.5) и тщательно промойте монослои 2x с не менее 1 мл PBS.
  5. Семена 1 х 105 RAW 264,7 ячеек на 2 мл полной среды DMEM в один из 4T1 изображений блюд. Инкубировать клетки 2'3 ч при 37 градусах Цельсия с 5% CO2, чтобы позволить присоединение клеток. Этикетка изображения блюдо 4T1-M1 кокультуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 4T1 (контрольные) клетки не были cocultured с макрофагами.

6. M1 поляризация RAW 264.7 макрофагов

  1. Подготовка M1 поляризации средств массовой информации, добавив 100 нг / мл LPS и 20 нг / мЛ IFN-- в полной среде DMEM дополнены 10% (v/v) FBS10,11.
  2. Откажитесь от культуры супернатанта из макрофагов, инкубированных ранее (шаг 5.5) и тщательно мыть монослой в блюде 2x с по крайней мере 1 мл PBS.
  3. Затем добавьте 2 мл средств поляризации M1 в блюдо для визуализации и позвольте RAW 264.7 клеткам вводить фенотип макрофага M1, инкубируя при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: M1 макрофаг клетки могут занять 2'3 ч инкубации для достижения полной поляризации. Необходимо провести предварительные эксперименты для обеспечения подходящего инкубационного периода, чтобы обеспечить полную поляризацию макрофагов.

7. Видеомикроскопия фагоцитоза в живых клетках

ПРИМЕЧАНИЕ: Многие факторы должны быть рассмотрены при выполнении изображения в живых клетках, чтобы получить продуцируемое видео, включая оптимизацию экспозиции изображения, измерение времени и автоматическую коррекцию фокусировки.

  1. Перед экспериментом навештатите инкубатор клеточной культуры, включив термостат при 37 градусах Цельсия и поставив 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установка микроскопа требует перевернутой стадии, инкубатора верхней стадии, контроля влажности (95%) и системы инкубации газа. Эта установка имеет решающее значение для поддержания клеток для долгосрочной оценки видеомикроскопии в живых клетках.
  2. Включите микроскоп, включая стадию пьезо и загрузите программное обеспечение для визуализации микроскопа.
  3. Расположите семенные клетки кокультуры в 35-миллиметровой стеклянно-нижней части изображения блюдо в центре сцены и аккуратно винт на верхней камере. Используйте джойстик для моторизации сцены, выбрав положение для изображения.
  4. Для просмотра образца выберите фильтр фазового контраста на башне. После первоначального просмотра образца, найти соответствующие поля и привести образец в фокусе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Imaging программное обеспечение позволяет использовать полностью автоматизированный объективный выбор, Perfect Focus System, замедленной серии, многоканального приобретения изображений, а также многоточечного приобретения изображения.
  5. Чтобы настроить многоканальную флуоресценцию для маркировки CFSE и дифференциального взаимодействия контрастного приобретения, открыть изображение программного обеспечения приобретения диалогового ящика и выберите "Lambda" вкладка флаконт -Ruбию(рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для 13-часовой визуализации следует использовать фазово-контрастный канал.
  6. Выберите вкладку «Ламбда» «Оптическая конфигурация» и выберите «10X DIC» для контраста дифференциальных интерференций и «GFP-R» для зеленого флаоресцентного фильтра флабокса. Под «Ламбдой» Колонка «Фокус», выберите флажок «10X DIC», чтобы установить в качестве фокусировки.
  7. Откройте диалоговую коробку для приобретения программного обеспечения для визуализации и нажмите кнопку «XY» Time и выберите вкладку «XY».
  8. Перейдите к точке приобретения изображения с помощью джойстика на моторизованной стадии при проверке живого изображения или выберите другое положение через окуи. Затем нажмите на флажок под столбцом «Имя точки», чтобы установить каждую точку в каждом месте для захвата изображения (см. рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированная стадия позволяет многоточечному приобретению изображений различных координат XY захватывать несколько полей.
  9. Изобразить фокус для каждого просмотрели на экране. Используйте элементы управления при коррекции автофокусировки.
  10. Используйте программное обеспечение для настройки замедленного захвата изображения. В диалоговом окне приобретения программного обеспечения для визуализации проверьте вкладку «Время» (см. рисунок 4).
  11. Определите «Interval» (задержка между началом одного времени в другой момент времени) и «Длительность» (общая продолжительность времени эксперимента). Единицы времени различаются и могут быть выбраны в миллисекундах (мс), секундах (ы), минутах (м) или часах (ч) из меню выпадения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность периода изображения для замедленного изображения флуоресценции и DIC замедленного многоканального приобретения может варьироваться в зависимости от флуоресцентного красителя, используемого в этом анализе. Фотоотрахинг может произойти, если помеченные клетки подвергаются воздействию слишком долго.
  12. Проверить флажок «Сохранить файл», чтобы сохранить приобретенные изображения. В рамках вкладки «Расписание времени» нажмите кнопку «Беги сейчас», чтобы получить многоточечные изображения временных рядов (см. рисунок 5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В программном обеспечении для визуализации изображения сохраняются в формате файлов nd2. Каждый промежуток времени может быть индивидуально сохранен в формате файла MP4 позже.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

По времени двухмерные (2D) изображения модели кокультуры 4T1 мыши mammary карциномы клеточных линий показывают 4T1 клетки поглощается M1 макрофагов в течение 13 ч период. Важно обеспечить полную поляризацию макрофагов М1, выполняя иммуностоинг. Результаты(Рисунок 1) показывают, что концентрация 100 нг/мл липополисахаридов (LPS) и 20 нг/мЛ IFN-й поляризованных RAW 264.7 макрофагов в состояние M1. Маркировка целевых клеток с флуоресцентным красителем и оставляя эффектор ные клетки неокрашенные...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный протокол требует двух шагов: 1) кокультуры 4T1 мыши клеток карциномы и M1-поляризованных макрофагов, и 2) оценка макрофагов фагоцитной активности с использованием замедленной микроскопии. Сокультура живых клеток широко используется в фагоцитозных и миграционных анализах. Модель сокультуры живых клеток здесь является простой, адаптируемой процедурой in vitro(Рисунок 2),которая использует флуоресцентный краситель, CFSE, который используется для обозначения целевых клеток 4T1. Это исп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была финансово профинансирована Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. Мы хотели бы поблагодарить Агро-Биотехнологический институт, Малайзия (ABI) лаборатории, и микроскопии изображений объекта. Особая благодарность Мохду Даниэлю Хазиму за помощь в редактировании и записи экспериментального видео для этой работы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Конъюгированные антитела против INOS FITCMiltenyi BiotecREA982150 µ г в 1 мл
карбоксифлуоресцеина сукцинимидилового эфира (CFSE)ИнвитрогенC115725 мг
DAPI (4',6-Диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлоридИнвитрогенD130610 мг
DMEM/высокий уровень глюкозыHyCloneSH30003,04670,0 г
Фетальная бычья сывороткаTico EuropeFBSEU500500 мл
липополисахаридовSigmaL4516-1MG1 мг
мышиный рекомбинантный интерферон-гаммаТехнологии стволовых клеток78021100 &; g
Пенициллин-стрептомицин растворCellgro30-003-CI100 мл
фосфатного буферного раствораSigma-AldrichP5368-10PAK10 упаковок
Трипсин ЭДТАCellgro25-052-CI1X, 100 мл
1000 &; L наконечники для пипетокWhiteBoxWB-301-01-0525000 наконечников/футляр
2 мл серологический пипеткаJET BIOFILGSP012002Non-pryogenic
200 &; L наконечники для пипетокWhiteBoxWB-301-02-30220 000 tps/case
25 см2 колба для клеточных культурCorningCLS430639Обработка культурой тканей
Настольная центрифугаDynamicaFA15CМодель: Velocity 14R
Биологическая безопасность вытяжного шкафаNuaireNU-565-400Модель: Главная/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Вытяжной шкаф
CO2/воздушный смесительChamlide (инструмент для живых клеток)FC-R-20FC-5 (смеситель CO2/воздуха) с расходомером
Скребок клетокNEST710001220 мм
CO2 cell инкубаторPanasonicN/AМодель: MCO-19M(UV)
Конфокальный микроскопNikon Instruments Inc.Н/ДNikon Ti-Eclipse
Стеклянная нижняя тарелкаIbidi81218-20035 мм
элементы NIS программное обеспечениеNikon Instruments Inc.Доступно онлайн скачать
Контроллер пипеткиCappAidPA-100CappController контроллер пипетки, 0,1-100мл
ТермостатShinkoСнят с производстваJCS-33A 48 x 48 x 96,5мм
)

Ссылки

  1. Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
  2. Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
  3. Lee, K. Y. M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
  4. Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
  5. Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
  6. Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
  7. Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
  8. Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585(2012).
  9. Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152(2018).
  10. Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
  11. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
  12. Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
  13. Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).
  14. Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
  15. McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
  16. Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

M1imaging4T1CFSEM1
Time-Lapse 2D Изображение фагоцитарной активности в M1 Макрофаг-4T1 Мышь Mammary Карцином Клетки в ко-культур
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.