Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Надежная изоляция микрососудов центральной нервной системы в пяти группах позвоночных

8.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60291

⸱

12 января 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, University of California Davis, 2University of Veterinary Medicine Hannover Foundation

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Целью данного протокола является изоляция микрососудов из нескольких областей центральной нервной системы лиссенцефалических и гиренцефалических позвоночных.

Аннотация

Изоляция микрососудов из центральной нервной системы (ЦНС) обычно осуществляется путем объединения корковых тканей от нескольких животных, чаще всего грызунов. Такой подход ограничивает анализ свойств гематоэнцефалического барьера (BBB) коре и не позволяет проводить индивидуальное сравнение. Этот проект фокусируется на разработке метода изоляции, который позволяет сравнивать нервно-сосудистую единицу (НВУ) из нескольких областей ЦНС: коры головного мозга, мозжечка, зрительного толка, гипоталамуса, гипофиза, ствола головного мозга и спинного мозга. Кроме того, этот протокол, первоначально разработанный для образцов мурин, был успешно адаптирован для использования в тканях ЦНС от малых и крупных позвоночных видов, из которых мы также можем изолировать микрососуды из белого вещества полушария мозга. Этот метод, в паре с иммуномаркировкой, позволяет количественно определить экспрессию белка и статистическое сравнение между людьми, типом ткани или лечением. Мы доказали эту применимость, оценив изменения экспрессии белка во время экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE), моринмодели нейровоспалительных заболеваний, рассеянного склероза. Кроме того, микрососуды, изолированные этим методом, могут быть использованы, в частности, для таких приложений, как qPCR, RNA-seq и Western blot. Несмотря на то, что это не первая попытка изолировать микрососуды ЦНС без использования ультрацентрифюгации или ферментативной диссоциации, она уникальна по своей искусности для сравнения отдельных лиц и нескольких регионов ЦНС. Таким образом, это позволяет исследует целый ряд различий, которые в противном случае могут оставаться неясными: части ЦНС (кора, мозжечок, оптическая доля, ствол мозга, гипоталамус, гипофиза и спинного мозга), тип ткани ЦНС (серое или белое вещество), лица, экспериментальных групп лечения и видов.

Введение

Наш мозг является самым важным органом в нашем теле. По этой причине, сохраняя гомеостаз мозга, несмотря на внешние факторы, которые могут вызвать отклонение от нормальной жизни является приоритетом. По мнению некоторых ученых, около 400-500 миллионов лет назад1, позвоночных животных разработали то, что мы теперь знаем, как гематоэнцефалический барьер (BBB)2,3. Этот защитный "забор" оказывает наибольшее влияние на центральную нервную систему (ЦНС) гомеостаза и функции, плотно регулируя транспорт ионов, молекул и клеток между кровью и ЦНС parenchyma. Когда BBB нарушается, мозг становится восприимчивым к токсическим воздействием, инфекции и воспаления. Таким образом, дисфункция BBB связана со многими, если не со всеми, неврологическими и нейроразвития расстройств4,5,6.

Сложная функция BBB приписывается уникальной микроваскулярной ЦНС, соответствующей нервно-сосудистому блоку (НВУ)2,3. Высокоспециализированные эндотелиальные клетки, перициты и астроцитарные конечные ноги являются клеточными компонентами NVU2,3. Внеклеточная матрица, генерируемая этими клетками, также имеет важное значение для физиологии NVU и BBB2,3. Хотя основные клеточные и молекулярные компоненты НВУ сохраняются среди позвоночных, неоднородность сообщается среди заказов и видов7,8. Тем не менее, технические ограничения препятствуют нашей способности в полной мере рассмотреть эти различия в нейробиологии, биомедицинских или трансляционных исследований.

Из-за этого мы расширили метод микрососуд-изоляцию цНС, чтобы сделать его применимым к многочисленным видам из всех пяти позвоночных групп: рыбам, земноводным, рептилиям, птицам и млекопитающим. Протокол описан для использования на мелко-лиссенцефалических и крупногирецефалических позвоночных, в том числе видов с переводной релевантности9. Кроме того, мы включаем другие регионы ЦНС, ранее не исследованные в этом контексте, но имеющие отношение к нейрофизиологии и с огромными клиническими последствиями: гипоталамус, гипофиз и белое вещество. Наконец, мы проверили способность этого метода изоляции в качестве надежного инструмента для выявления изменений в экспрессии белка вдоль NVU и / или BBB9,10,11. В качестве доказательства концепции мы показали, как определить изменения в экспрессии VCAM-1 и JAM-B во время EAE с помощью метода изоляции с последующей иммунофлуоресценцией.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры настоящего исследования соответствуют руководящим принципам, установленным Калифорнийским университетом (UC), Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Дэвиса (IACUC). Уход за животными в UC Davis регулируется несколькими независимыми ресурсами и с 1966 года полностью аккредитован Ассоциацией по оценке и аккредитации Организации По уходу за животными (AAALAC). Ткани свиной ЦНС были получены в отделе наук о животных UCD, в лаборатории мясных наук. Ткани ЦНС от макаки-изреусов были получены из Калифорнийского национального научно-исследовательского центра патологии (NIH P51OD011107). Никакой анестезии, эвтаназии или некропсии сотрудники лаборатории не проводили на свиньях и макаках. Поэтому никаких конкретных рекомендаций по этим вопросам не существует.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был проверен для нескольких видов, но предоставленный протокол более непосредственно соответствует мышечной и свиной ткани. Детали, относящиеся к оптической доле, не применяются при использовании образцов млекопитающих. Все биоопасные материалы должны обрабатываться на соответствующем объекте уровня биобезопасности (BSL). Все остро токсичные материалы должны быть обработаны под дымом капот. Все биоопасные медицинские отходы и остро токсичные отходы должны быть утилизированы должным образом.

1. Подготовка

  1. Подготовьте решения(таблица 1)по крайней мере на один день вперед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень трудно растворить 70 kDa молекулярного веса (MW) dextran. Это более эффективно, чтобы раствор перемешивать на ночь покрыты либо парафина пленки или фольги. Протокол требует использования двух различных решений MV-2 в зависимости от исследуемого образца. 18% дексенов эффективно отделяет миелин от гранул микрососуд при выполнении протокола о малых лиссенцефалических образцов. Тем не менее, он развивается мазок миелина в интерфейсе тканей ЦНС из крупных гиренцефалических образцов, а также гипоталамуса и гипофиза из мелких образцов. Этот мазок предотвращается с помощью 20% dextran.
  2. Подготовка хорошо слайдов, загрузив 50 л на скважину поли-D-лизин и дайте высохнуть в течение 2 ч при комнатной температуре (RT), предпочтительно в биологической безопасности шкаф-класса 2 (BSC-2). Не переутомитесь. Промыть дважды фосфат-буфером сольников (PBS) и держать в холодильнике до готовности к использованию.

2. Рассечение тканей ЦНС от малых лиссенцефических позвоночных Specimen

ПРИМЕЧАНИЕ: В статье показано применение протокола на C57BL6/J, 10 недель, 25 г, мужская мышь.

  1. Подготовьте две конические трубки мощностью 15 мл и микроцентрифуговую трубку мощностью 1,7 мл с 5 мл и 1 мл, соответственно, раствором MV-1 на один образец. Держите трубки на льду.
  2. Анестезия
    1. Анестезия мышей путем интраперитонеальной инъекции кетамина, ксилазина и ацепромазина анестезирует коктейль на 100/10/3 мг на кг веса тела и спрей с 70% этанола. Подтвердите анестезию, оценив отсутствие пальпебраальных и педалей рефлексов, касаясь глаза и щипать ногу, соответственно.
    2. Обезболивайте голубей путем вдыхания 5% изофларанса с помощью индукционной анестезии.
    3. Обезболилизировать рыбу и лягушек в 1% трикаин в любой рыбы, держащей резервуар для воды или раствор амфибии Ringer(Таблица материалов), соответственно.
    4. Анестезируйте ящериц путем охлаждения при 4 градусах Цельсия до эвтаназии.
  3. Обезглавить животное хирургическими ножницами, очистить кожу щипками, чтобы разоблачить череп, и вырезать ножницами LaGrange через передний магнум (Рисунок 1A).
  4. Вскрыть мозг с помощью шпателя и переложить на коническую трубку 15 мл с раствором MV-1. Держите трубку на льду.
  5. Извлеките гипофиз из черепа sella turcica с щипками и перенесите в микроцентрифугную трубку 1,7 мл с раствором MV-1. Держите трубку на льду.
  6. Удалите кожу и мышцы, чтобы разоблачить позвоночный столб. Вырежьте конечности, грудную клетку и внутренние органы(рисунок 1B).
  7. Вскрыть спинной мозг одним из двух методов, описанных ниже. Затем перенесите на коническую трубку 5 мл с раствором MV-1. Держите трубку на льду.
    1. Выполните ламинэктомии, разрезая в рострале к каудальное направление с ножницами LaGrange, начиная через шейные позвоночные форамены,до достижения поясничного шнура.
    2. Выполните промывку в каудальском к ростральное направление по всему поясничному позвоночному фораму с 18 G иглой и шприцем 10 мл, загруженным раствором MV-1(рисунок 1C,D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод работает только с очень мелкими особями, в основном с грызунами (lt;100 g).
  8. Используя рассекающий прицел, вырежьте дурацком из спинного мозга с помощью пружинных ножниц и удалите оставшиеся оранжеры с двусторонним выбором(рисунок 2).
  9. Перенесите мозг в чашку Петри и, используя рассекающий прицел, удалите оболёны с двусторонним выбором(рисунок 2A-C).
  10. Акциз обонятельные луковицы и таламус с щипками, ножницами радужной оболочки глаза, и весной ножницы. Используя двусторонний выбор, удалите сосплетение со всех желудочков головного мозга. Убедитесь в том, чтобы удалить все сосудистого сплетения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: сосудистое сплетение и обонятельные луковицы являются массивным источником загрязнения. В отличие от BBB, эти капилляры сильно фенестированы и результаты последующих экспериментов будут скомпрометированы, если они не будут удалены.
  11. Используя щипцы, отделяйте различные области ЦНС: кора, мозжечок, ствол мозга, оптика (не на образцах млекопитающих) и гипоталамус.

3. Рассечение тканей ЦНС от большого гирецефалического позвоночных образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует свиные ткани ЦНС, полученные из скотобойни. Поэтому здесь не описана ни анестезия, ни эвтаназия, ни некропсия.

  1. Транспорт свиной ткани ЦНС в 0,946 л (32 унции) гистологии контейнер загружен с MV-1 раствор внутри льда груди / ведро.
  2. Используя рассекающий прицел, удалите оболочки с двусторонним подбором, щипцами, ножницами радужной оболочки глаза и пружинными ножницами из каждой ткани ЦНС. Убедитесь в том, чтобы удалить любые кусочки сосудистого сплетения из желудочков головного мозга.

4. Гомогенизация тканей ЦНС

ПРИМЕЧАНИЕ: Это более эффективно, когда два следователя участвуют в процессе гомогенизации: один вскрытия оплодотворения под стереоскопом, а другой гомогенизации рубленых тканей. Таким образом, ткани быстро возвращаются в ведро со льдом и сохраняются в холоде.

  1. Поместите каждый регион ЦНС на чашку Петри с раствором MV-1 в размере 1 мл. Используя одногранное лезвие, фарш ткани для получения 1-2 мм штук.
    1. Для небольшого образца позвоночных используйте тарелку 100 мм x 20 мм Петри.
    2. Для большого образца позвоночных используйте 150 мм х 15 мм чашку Петри.
  2. Гомогенизация мелкого позвоночным образца(Таблица 2 и Таблица 3)
    1. Передача коры, мозжечка, ствола мозга, оптической доли и спинного мозга до 1 мл раствора MV-1 в индивидуальном 10 мл Поттер-Elvehjem стеклянной ткани шлифовальный станок с пестиком PTFE с помощью передачи пипетки. Добавьте 5 мл раствора MV-1 и гомогенизируют каждую ткань (10 ударов). Передача на отдельные 15 мл конических труб. Держите трубки на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для маленьких позвоночных, 5 или 4, с или без оптической доли, соответственно, 10 мл Поттер-Elvehjem шлифовальные машины и 15 мл конических трубок необходимы.
    2. Перенесите гипоталамус и гипофиз с щипками в раствор MV-1 в индивидуальной трубке мощностью 1,7 мл и тщательно гомогенизируйте стеклянным микропестом. Промыть каждый микропест с помощью 1 мл раствора MV-1. Держите трубку на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для маленьких позвоночных, 2 стеклянных микропеша и 1,7 мл трубок необходимы.
  3. Гомогенизация большого образца позвоночных(Таблица 4 и Таблица 5)
    1. Используя передачу пипетки, передача измельченных тканей в 55 мл Поттер-Elvehjem стеклянной ткани шлифовальный станок с пестиком PTFE и прикрепить к накладным мешалку. Добавьте половину рекомендуемого объема раствора MV-1, в соответствии с конкретной частью ЦНС, будучи однородной(таблица 5).
    2. Включите накладной мешалку на очень низкой скорости (150 об/мин) и осторожно перемещать стеклянную трубку вверх и вниз в течение примерно 30 с.
    3. Выключите накладные мешалки, добавьте больше раствора MV-1 и повторите шаг 4.3.2 до получения однородной суспензии.
    4. Перенесите на коническую трубку 50 мл. Держите трубку на льду.
    5. Вымойте мясорубку деионизированной водой между каждой гомогенизации тканей ЦНС.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для большого позвоночного 5 или 4, с или без белого вещества, соответственно, 50 мл конических труб необходимы. Кроме того, для гипоталамуса и гипофиза необходимы две (2) 15 мл конических трубки.

5. Очистка микросудов

  1. Центрифуги ткани гомогенаты в результате шага 4.2.1, 4.2.2, или 4.3.4 на 2000 х г в течение 10 мин при 4 градусах По Цельсию. Большой белый интерфейс миелина образуется на верхней части гранул ыхщетов красноватых микрососудов. Откажитесь от супернационтов.
    1. Малый образец позвоночных(Таблица 2 и Таблица 3)
      1. Отрептуйте кору, мозжечок, ствол мозга, оптику и гранулы спинного мозга в 5 мл ледяного раствора MV-2 с серологической пипеткой 5 мл (10 смывов). Добавьте 5 мл ледяного раствора MV-2 к каждой подвеске и тщательно перемешайте, перевернув трубки.
      2. Отрежь гипоталамус и гранулы гипофиза с 1 мл раствора MV-2.
    2. Большой образец позвоночных(Таблица 4 и таблица 5)
      1. Добавьте 20 мл ледяного раствора MV-2 в коре головного мозга, мозжечок, ствол мозга и микрососуд спинного мозга. Resuspend гранулы, смешивая на трубе револьвер шейкер, помешивая при 40 об/мин в течение 5 мин. Баланс конических труб объемов коры, мозжечка, ствола мозга и спинного мозга суспензий, добавив больше MV-2 решение.
      2. Отдохните гипоталамус и гранулы микрососуди для гипофиза в 5 мл раствора MV-2 с серологическим пипеткой мощностью 5 мл (10 смывов). Добавьте 5 мл ледяного раствора MV-2 в подвески и тщательно перемешайте, перевернув трубку.
  2. Центрифуга при 4400 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия.
  3. Тщательно отсоедините толстый и плотный слой миелина на жидком интерфейсе от стен каждой трубки, медленно вращая трубки и позволяя супернатанту проходить вдоль стен.
  4. Откажитесь от миелина и жидкого интерфейса и промойте внутреннюю стенку каждой трубки шпателем, завернутым с низкой салфеткой бумаги. Для небольших образцов позвоночных, удалить слой миелина из каждого гипоталамуса и гипофиз трубки путем всасывания тщательно с передачей пипетки.
  5. Протрите лишнюю жидкость с витой низкой ворсовой бумаги протрите. Отдохните каждую гранулу 1 мл раствора MV-3 с помощью низкосвязывающих наконечников. Держите трубки на льду.

6. Микрососуд Элюцион и фильтрация

  1. Налейте ледяной раствор MV-3 в отдельные клювы для каждого региона ЦНС. Хранить при 4 градусах по Цельсию.
    1. Для небольших образцов позвоночных используйте 10 мл раствора MV-3 на 50 мл стакана. В общей сложности 6-7 клювов необходимо в зависимости от того, включена оптическая доли.
    2. Для крупных образцов позвоночных используйте 30 мл раствора MV-3 на 100 мл стакана. В общей сложности 6-7 клювов необходимо в зависимости от того, включено ли белое вещество.
  2. Поместите ситечко на 50 мл конической трубки. Используйте один в регионе ЦНС. Используйте 100 мкм ситечко для коры головного мозга, оптической доли, спинного мозга и гипофиза. Используйте 70 мкм ситечко для мозжечка и гипоталамуса.
  3. Влажный каждый ситечко с 1 мл ледяного раствора MV-3.
  4. Добавьте больше раствора MV-3 к подвескам подготовленным в шаге 5.5 с серологическим пипеткой пока смешиваюя для того чтобы во избежание агрегаты. Тщательно загрузите микрососуды поверх ситечко. Промыть раствором гололедица MV-3.
    1. Для мелких образцов позвоночных(таблица 2 и таблица 3)добавьте 10-15 мл раствора MV-3 с серологической пипеткой и промойте 5 мл раствора MV-3.
    2. Для крупных образцов позвоночных добавьте 20 мл раствора MV-3 с серологической пипеткой и промыть 10 мл раствора MV-3.
  5. Соберите единицу фильтрации, поместив 20 мкм нейлоновый сетчатый фильтр на измененном держателе фильтра(рисунок 2D),по одному на область ЦНС.
    1. Для небольших образцов позвоночных(таблица 2 и таблица 3)используйте 25-мм модифицированные держатели фильтров для коры головного мозга, мозжечка, ствола мозга, оптовика и спинного мозга. Используйте 13 мм модифицированные держатели фильтров для гипоталамуса и гипофиза.
    2. Для крупных образцов позвоночных(Таблица 4 и Таблица 5)используйте 47-мм модифицированные держатели фильтров для коры головного мозга, мозжечка, ствола головного мозга и спинного мозга. Используйте 25 мм для гипоталамуса и гипофиза.
  6. Поместите фильтр поверх конической трубки 50 мл и влажный фильтр с 5 мл ледяного раствора MV-3, чтобы буфер вылил держатель фильтра в коническую трубку.
  7. Перенесите элютированные микрососуды (от шага 6.4) поверх 20 мл нейлонового сетального фильтра и промыть микрососуды раствором 5-10 мл ледяного MV-3.
  8. Восстановите фильтр с помощью чистых щипц и погрузите его в стакан, содержащий ледяной раствор MV-3, подготовленный в шаге 6.1.
  9. Отсоедините микрососуды от фильтра, встряхивая его осторожно около 30 с. Для небольших образцов позвоночных, залить содержание стакана в 15 мл конической трубки. Для крупных образцов позвоночных, залить содержание стакана в 50 мл конической трубки.
  10. Центрифуга при 2000 х г в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию и повторно йен гранулы в 1 мл ледяного раствора MV-3 с помощью низкосвязывающего наконечника пипетки.
    1. Для небольших образцов позвоночных перенесите суспензию (от шага 6.10) в микроцентрифуговую трубку 1,7 мл и центрифугу при 20 000 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот спин выполняется на скамейке центрифуги на максимальной скорости (20000 х г),чтобы обеспечить уверенный выход.
    2. Для крупных образцов позвоночных перенесите подвеску со ступени 6.10 в микроцентрифугную трубку 5,0 мл, добавьте 4 мл раствора MV-3 и центрифугу при 2000 х г на 5 мин при 4 градусах Цельсия.

7. Иммуностоина

ПРИМЕЧАНИЕ: Гематоксилин и эозин (Н И Е) окрашивание было выполнено на рептилий, земноводных и рыб образцов в качестве доказательства концепции протокола осуществимости. Таким образом, нет рекомендации для иммуномаркировки для этих образцов.

  1. Удалите супернатант из микроцентрифуговых труб.
  2. Resuspend гранулы в 1x стерильных PBS с помощью низкосвязывающих пипетка отзыв (Таблица материалов). Держите микрососуды от формирования агрегатов путем pipetting несколько раз. Для мелких образцов позвоночных(Таблица 3),используйте 100 qL-2,000 qL в зависимости от размера гранул. Для крупных образцов позвоночных(Таблица 5),используйте 1000 л-л-4000 л в зависимости от размера гранул.
  3. Используя низкосвязный наконечник пипетки, перенесите микрососуды на хорошо слайды, стараясь добавить их в центр каждого колодца, избегая боковальок.
  4. Установите хорошо слайды, обнаружили, внутри BSC-2, и дайте высохнуть в течение 20 до 30 минут на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Относительно большой объем 1x PBS используется, чтобы избежать совокупного образования. Из-за этого необходимо, чтобы горки высохли до фиксации, чтобы убедиться, что микрососуды удерживаются поли-D-лизинпокрытие покрытие.
  5. Удалите остаточный 1x PBS путем пипетки с передачей пипетки, добавить 200 зл/ 4% параформальдегида (PFA) и инкубировать в течение 30 мин на RT.
  6. Pipette из фиксаторного решения и мыть 3x с 200 Л Л 1x PBS в течение 5 минут на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Н И E окрашивания на рыбу, земноводных и рептилий CNS микросудов была выполнена в этой точке.
  7. Добавьте 200 qL блокирующего буфера к слайду скважины и инкубируйте в течение 60 минут при 37 градусах Цельсия.
  8. Удалите блокирующий буфер с помощью пересадочных пипетки и добавьте 200 злицита первичного антитела в разбавитель антител(Таблица материалов). Инкубировать при 4 градусах Цельсия на ночь.
  9. Pipette из первичного антитела коктейль и мыть 3x с 200 Злт 1x PBS в течение 5 минут на RT.
  10. Загрузите вторичный коктейль из антител(Таблица материалов),разбавленное в 1x PBS и инкубировать по 2 ч при РТ, защищенном от света.
  11. Pipette из вторичного коктейля антитела и мыть 3x с 200 Злт 1x PBS в течение 5 минут на RT, защищены от света. После последней стирки отсоединить хорошо слайд кадр и пятно сухой любой избыток 1x PBS с низкой салфеткой бумаги ворса.
  12. Добавьте coverslip, жидкий antifade монтант среды, и 4 ",6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) для ядерного окрашивания. Дайте высохнуть на ночь на RT защищены от света.
  13. После высыхания, держать защищены от света на слайд-бокс на 4 кв До тех пор, пока готовы к конфокальной микроскопии и сбора данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Микрососуды, изолированные от минины ЦНС, показали все внутренние клеточные компоненты нервно-сосудистого блока2,3. Использование либо тромбоцитов эндотелиальной клетки адгезионной молекулы-1 (PECAM, также известный как CD31) или изолектин IB4 (гликопротеин, который связывает эндотелиальной клетки гликоколикс) для эндотелиальных клеток, тромбоциты, полученные факторроста -- (PDGFR) или нейрон-глиальный антиген 2 (NG2) для перицито...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

BBB включает в себя уникальные свойства микроваскулярных эндотелиальных клеток мозга в сочетании с сложной архитектурой плотных, придерживающихся, "пег-розетки" - узлов, и адгезионные бляшки, критически важные для ЦНС гомеостаза2,3,19. Свойства эндотелиальных клеток индуцируются и поддерживаются перицитами и окружающими астроглией процессами конца фута2,3,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Д-р Круз-Оренго был поддержан Калифорнийским университетом, Дэвис, Школа ветеринарной медицины Запуска средств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10X PBSThermoFisherBP39920Используется для блокировки и разбавления антител.
20% PFAЭлектронная микроскопия Sciences15713-SИспользуется в качестве фиксатора (4% PFA)
70 000 МВт ДекстранМиллипор Sigma9004-54-0Используется для раствора MV-2
Щипцы АдсонаFine Science Tools (FST)11006-12Используется для удаления мышц и кожи
Щипцы Адсона, студенческое качествоFST91106-12То же, что выше, но дешевле
бычья сыворотка альбумин (БСА)Millipore SigmaA7906-100GИспользуется для раствора MV-3, блокирующего и разбавителя антител
Corning 100 μ m Сетчатый фильтрMillipore SigmaCLS431752-50EA
Corning 70 μ m Клеточное ситечкоMillipore SigmaCLS431751-50EA
Corning Deskwork низко связывающие наконечникиMillipore SigmaCLS4151То же, что ниже, но дешевле.
Cultrex Poly-D-лизинR& D3439-100-01Используется для покрытия горки
Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555ThermoA21432Используется в качестве вторичного антитела. Рекомендуемое разведение 1:200.
Donkey Anti-Mouse IgG-ALEXA 488ThermoA21202Используется в качестве вторичного антитела. Рекомендуемое разведение 1:200.
Donkey Anti-Rabbit IgG-ALEXA 488ThermoA21206Используется в качестве вторичного антитела. Рекомендуемое разведение 1:200.
Donkey Anti-Rabbit IgG-ALEXA 647ThermoA31573Используется в качестве вторичного антитела. Рекомендуемое разведение 1:200.
Donkey Anti-Rat IgG-DyLight 650ThermoSA5-10029Используется в качестве вторичного антитела. Рекомендуемое разведение 1:200.
Двухконтактный тканевый медиаторFST18067-11Используется для удаления мозговых оболочек и сосудистого сплетения
Щипцы Dumont #3cFST11231-20Используются для более деликатных и/или небольших тканей ЦНС (например, гипофиза)
Dumont #7 ЩипцыFST11274-20Используются для рассечения и обработки тиссу ЦНС
Щипцы Dumont #7, студентFST91197-00То же, что выше, но дешевле
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention TipsEppendorf22493008Лучшее качество, чем у насадок выше (дороже).
Щипцы Extra Fine Graefe, зубчатыеFST11151-10Используются для удаления костей
Тонкие ножницы, острыеFST14060-09Используются для удаления мешка свиньи и макак Стеклянный
пестик 1,5 мл Микроцентрифуга Трубка Измельчитель тканей Гомогенизатор, упаковка 10шт. Chang Bioscience Inc. (eBay)GP1.5_10Используется для небольших ветебратных гипоталусов и гипофиза.
Козий анти-CXCL12, биотинилированныйPeproTech500-P87BGBTИспользуется в качестве первичного антитела на микрососудах ЦНС из всех образцов. Рекомендуемое разведение: 1:20.
Козий анти-JAM-BR& DAF1074Используется в качестве первичного антитела для оценки нейровоспаления. Рекомендуемая концентрация: 5 мкм; г/мл.
Козий антимышиный препарат IgG-ALEXA 488ThermoA11001Используется в качестве вторичного антитела. Рекомендуемое разведение 1:200.
Козий антимышиный препарат IgG-ALEXA 555ThermoA21424Используется в качестве вторичного антитела. Рекомендуемое разведение 1:200.
Козий анти-PDGFR&бета;НИР DAF1042Используется в качестве первичного антитела на микрососудах ЦНС из всех образцов. Рекомендуемая концентрация: 5 мкм; г/мл.
Козий антикролик IgG-ALEXA 555ThermoA21249Используется в качестве вторичного антитела. Рекомендуемое разведение 1:200.
Козий антикролик IgG-DyLight 488Thermo35552Используется в качестве вторичного антитела. Рекомендуемое разведение 1:200.
Козий антикрысиный IgG-DyLight 650ThermoSA5-10021Используется в качестве вторичного антитела. Рекомендуемое разведение 1:200.
Щипцы Graefe, изогнутый наконечник, 1X2 зубцаFST11054-10Используется для удержания и встряхивания нейлоновой фильтрующей сетки
HBSS, 1X буфер с кальцием и магниемCorning21-022-CMИспользуется для раствора MV-1
HEPES, 1M жидкий буферCorning25-060-CIИспользуется для раствора MV-1
Изолектин GS-IB4-Biotin-XXThermoFisher Scientific (Thermo)I21414Гликопротеин, выделенный из бобовых Griffonia simplicifolia, связывает D-галактозильные остатки гликокализа эндотелиальных клеток. Используется для микрососудов ЦНС птиц и свиней. Рекомендуемая концентрация: 5 мкм; г/мл.
Ножницы Лагранжа, зубчатыеFST14173-12Используются для рассечения черепа и ламинэктомии (кроме свиньи и макаки)
Millicell EZ слайд 8-луночная единицаMillipore SigmaPEZGS0816
мыши анти-CLDN5Thermo35-2500Используется в качестве основного антитела на микрососудах ЦНС из всех образцов. Рекомендуемая концентрация: 5 мкм; г/мл.
Мышиный анти-GGT1Abcamab55138Используется в качестве первичного антитела к микрососудам ЦНС из всех образцов. Рекомендуемая концентрация: 5 мкм; г/мл.
Мышиный античеловеческий CD31R& DBBA7Используется в качестве первичного антитела на микрососудах ЦНС приматов. Рекомендуемая концентрация: 16,5 мкм; г/мл.
Мышиный анти-NFMThermoRMO-270Используется в качестве первичного антитела к микрососудам ЦНС из всех образцов. Рекомендуемая концентрация: 5 мкм; г/мл.
Мышиный анти-αSMAThermoMA5-11547Используется в качестве первичного антитела к микрососудам ЦНС из всех образцов. Рекомендуемое разведение 1:200.
Нейлоновая фильтрующая сетка, рулонMillipore SigmaNY6000010Лазерная резка на дисках фильтрующей сетки диаметром 13 мм. Используется при небольших ветебратах, гипоталусе и гипофизе.
Нейлоновые фильтрующие сетки, 25 ммMillipore SigmaNY2002500Используется на тканях ЦНС большинства мелких позвоночных, за исключением гипоталамуса и гипофиза. Используется для макак и свиньи, гипоталамуса и гипофиза.
Нейлоновые фильтрующие сетки, 47 ммMillipore SigmaNY2004700Используется для тканей ЦНС макак и свиней, за исключением гипоталамуса и гипофиза.
Реагент ProLong Gold antifade с DAPIThermoFisherP36935Используется для покрытия слайдов.
Rabbit anti-AQP4Millipore SigmaA5971Используется в качестве основного антитела к микрососудам ЦНС из всех образцов. Рекомендуемое разведение 1:200.
Rabbit anti-LSRMillipore SigmaSAB2107967Используется в качестве первичного антитела к микрососудам ЦНС из всех образцов. Рекомендуемая концентрация: 5 мкм; г/мл.
Rabbit anti-NG2Millipore SigmaAB5320Используется в качестве первичного антитела на микрососудах ЦНС из всех образцов. Рекомендуемое разведение 1:200.
Кролик против ОСПAbcamab53041Используется в качестве первичного антитела к микрососудам ЦНС из всех образцов. Рекомендуемая концентрация: 1 мкм; г/мл.
Кролик анти-VE-кадгеринAbcamab33168Используется в качестве первичного антитела к микрососудам ЦНС из всех образцов. Рекомендуемая концентрация: 5 мкм; г/мл.
Rabbit anti-ZO-1Thermo61-7300Используется в качестве первичного антитела к микрососудам ЦНС из всех образцов. Рекомендуемая концентрация: 5 мкм; г/мл.
Крысиный анти-CD31Becton DickinsonBD 550274Используется в качестве основного антитела к микрососудам ЦНС мышей. Рекомендуемая концентрация: 5 мкм; г/мл.
Крысиный анти-GFAPThermo13-0300Используется в качестве первичного антитела к микрососудам ЦНС из всех образцов. Рекомендуемое разведение 1:200.
Крысиный анти-VCAM-1Becton DickinsonBD 553329Используется в качестве первичного антитела для оценки нейровоспаления. Рекомендуемая концентрация: 5 мкм; г/мл.
Стерильный раствор Рингера, лягушкаAldon CorporationIS5066Используется для амфибийной анестезии
Streptavidin-ALEXA 555ThermoS32355Используется в качестве вторичного антитела для мечения биотинилированных первичных антител. Рекомендуемое разведение 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647ThermoS32357Используется в качестве вторичного антитела для мечения биотинилированных первичных антител. Рекомендуемое разведение 1:500.
Хирургические ножницы, острыеFST14002-12Используются для удаления мышц и кожи
Хирургические ножницы, острые тупыеFST14001-16Используются для обезглавливания (кроме свиньи и макаки)
Держатель фильтра Swinnex, 13 ммMillipore SigmaSX0001300Модифицирован лазерной резкой. Используется при небольших ветебратах, гипоталусе и гипофизе.
Держатель фильтра Swinnex, 25 ммMillipore SigmaSX0002500модифицирован лазерной резкой. Применяется на тканях ЦНС большинства мелких позвоночных, кроме гипоталамуса и гипофиза. Используется для макак и свиньи, гипоталамуса и гипофиза.
Держатель фильтра Swinex, 47 ммMillipore SigmaSX0004700модифицирован лазерной резкой. Используется для тканей ЦНС макак и свиньи, кроме гипоталамуса и гипофиза.
Triton X-100ThermoFisher50-165-7277Используется для блокирования и разбавления антител.
Wheaton 120 Vac Верхняя мешалкаVWR (поставщик DWK Life Sciences)62400-904 (DWK #903475)Используется для тканей ЦНС макак и свиней с помощью измельчителя тканей объемом 55 мл, за исключением гипоталамуса и гипофиза.
Тканевая мельница Wheaton Potter-Elvehjem с пестиком из ПТФЭ, 10 млVWR (поставщик DWK Life Sciences)14231-384 (DWK #357979)Используется на тканях ЦНС большинства мелких позвоночных, за исключением гипоталамуса и гипофиза. Используется для макак и свиньи, гипоталамуса и гипофиза.
Тканевая мельница Wheaton Potter-Elvehjem с пестиком из ПТФЭ, 55 млVWR (поставщик DWK Life Sciences)14231-372 (DWK #357994)Используется для тканей ЦНС макак и свиней, за исключением гипоталамуса и гипофиза.

Ссылки

  1. Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
  2. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).
  3. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  4. Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. , (2018).
  5. Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
  6. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
  7. Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544(2016).
  8. O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
  9. Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
  10. Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
  11. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  12. Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
  13. Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
  14. Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
  15. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
  16. Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
  17. Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
  18. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
  19. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  20. Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
  21. Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. , 53208(2015).
  22. Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. , (2012).
  23. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
  24. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  25. Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
  26. Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Свойства гематоэнцефалического барьерасравнение компонентов нейроваскулярного юнитаметод изоляции микрососудовпрепарирование тканей ЦНСгомогенизация в растворе MV-1протокол очистки микрососудовметоды иммуномеченияэкспериментальный аутоиммунный энцефаломиелитколичественное определение экспрессии белков
Надежная изоляция микрососудов центральной нервной системы в пяти группах позвоночных
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.