Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Миграция, химиотерапия, и совместно-культурные анализы для стволовых клеток человека, полученных эндотелиальных клеток и ГАМК нейронов

6.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60295

⸱

23 января 2020 г.

 , 
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Angiogenesis and Brain Development Laboratory, Division of Basic Neuroscience, McLean Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем три простых in vitro-анализы миграции на расстоянии, анализ миграции совместной культуры и анализ химиотерапии-притяжения, которые коллективно оценивают функции стволовых клеток человека, полученных перивентрикулярных эндотелиальных клеток и их взаимодействия с ГАМК-интернейронов.

Аннотация

Роль сосудистой системы головного мозга в развитии нервной системы и этиологии нарушений головного мозга все больше привлекает внимание. Наши недавние исследования выявили особую популяцию сосудистых клеток, перивентрикулярных эндотелиальных клеток, которые играют важную роль в миграции и распределении передних ГАМК-интернейронов во время эмбрионального развития. Это, в сочетании с их клеточной автономной функции, намекает на новые роли перивентрикулярных эндотелиальных клеток в патологии нейропсихиатрических расстройств, как шизофрения, эпилепсия, и аутизм. Здесь мы описали три различных in vitro анализы, которые коллективно оценить функции перивентрикулярных эндотелиальных клеток и их взаимодействие с ГАМК-интернейронов. Использование этих анализов, особенно в человеческом контексте, позволит нам определить связь между перивентрикулярными эндотелиальными клетками и нарушениями мозга. Эти анализы являются простыми, низкой стоимости, и воспроизводимые, и могут быть легко адаптированы к любому типу адепта клеток.

Введение

Эндотелиальные клетки образуют слизистую оболочку кровеносных сосудов и посредничают в важных функциях, которые включают поддержание проницаемости стенки сосудов, регуляцию кровотока, агрегацию тромбоцитов и образование новых кровеносных сосудов. В головном мозге эндотелиальные клетки являются частью критического гематоэнцефалического барьера, который жестко контролирует обмен материалами между мозгом и кровотоком1. Наши исследования в последнее десятилетие определили новые нейрогенные роли эндотелиальных клеток мозга, которые имеют значительные последствия для развития мозга и поведения2,3,4,5. Мы показали, что мышь эмбрионального переднего мозга васкуляризовано двумя различными подтипами сосудов, pial сосудов и перивентрикулярных сосудов, которые отличаются по анатомии, происхождению и развития профиля2. Эндотелиальные клетки, выстилающие эти два подтипа сосуда, показывают явные различия в профилях экспрессии генов. В то время как pial эндотелиальные клетки в основном выражают гены, связанные с воспалением и иммунным ответом, перивентрикулярные эндотелиальные клетки однозначно обогащены экспрессией генов, обычно связанных с нейрогенезом, нейрональной миграцией, хемотаксисом и аксоном3. Перивентрикулярные эндотелиальные клетки также дом роман ГАМК сигнальный путь, который отличается от традиционных нейрональных ГАМК сигнализации пути5. Сопутствуя экспрессии гена, перивентрикулярные эндотелиальные клетки были найдены для регулирования миграции и распределения ГАМК-интернейронов в развивающихся неокортекс. Во время эмбрионального развития, перивентрикулярные эндотелиальные клетки проходят междугородную миграцию вдоль брюшно-дорсального градиента для установления перивентрикулярной сосудистой сети2,3. Этот миграционный маршрут отражается на следующий день interneurons. Мигрирующие интернейроны физически взаимодействуют с заранее сформированной перивентрикулярной сосудистой сетью и используют ее в качестве путеводителя для достижения конечного пункта назначения в неокортексе. В дополнение к действуя в качестве физического субстрата, перивентрикулярные эндотелиальные клетки служат источником навигационных сигналов для мигрирующих нейронов. Перивентрикулярный эндотелиальной клеточной секретной ГАМК направляет интернерон миграции и регулирует их окончательное распределение моделей4. Дефекты в интернеронной миграции и распределении связаны с нейропсихиатрическими расстройствами, такими как аутизм, эпилепсия, шизофрения и депрессия6,7,8,9,10. Таким образом, изучение перивентрикулярных эндотелиальных клеточных функций и их влияние на межжелудочковую миграцию в человеческом контексте становится критическиважным для решения патогенеза этих расстройств.

Мы создали человека перивентрикулярных, как эндотелиальные клетки из человеческих эмбриональных стволовых клеток в нашей лаборатории11, используя индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) технология12,13. Чтобы проверить, имитируют ли человеческие перивентрикулярные эндотелиальные клетки, верно имитируют мышиные перивентрикулярные эндотелиальные клетки, и количественно оценить их влияние на миграцию интернеров, мы разработали три анализы in vitro: анализ миграции на расстоянии, анализ миграции между культурой и анализ хемо-притяжения. Здесь мы подробно описываем протоколы этих анализов. Все три анализы основаны на использовании силиконовой культуры вставки для создания небольшой прямоугольный участок клеток (фиксированных размеров) в окружении клеточного пространства. Расстояние миграции оценивается путем измерения расстояния между конечными позициями ячеек от границы прямоугольного пятна, которое было изложено в день 0. В ходе дальнего анализа миграции человеческие перивентрикулярные эндотелиальные клетки засеиваются в виде пластыря в центре 35-мм тарелки, и рассчитываются расстояния, пройденные клетками в течение длительного времени. В исследовании миграции сокультуры, человеческие перивентрикулярные эндотелиальные клетки со-сеяные с человеческими интернейронами, как один патч в 35-мм блюдо. Эта установка позволяет изучить влияние прямых физических взаимодействий этих двух типов клеток на скорость миграции интернейронов. Химио-притяжения асссеизмерия измеряет миграцию интернейронов в ответ на химио-привлекательные сигналы, выделяемые перивентрикулярными эндотелиальными клетками человека. Interneurons посеяны как прямоугольный патч, с человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток и контроля не-перивентрикулярных эндотелиальных клеток, посеянных как аналогичные размеры патчи с обеих сторон. Каждый из ячеек патчи разделены клеточной свободной разрыв 500 мкм. Реакция межнейронов оценивается путем количественной оценки числа клеток, которые мигрировали в перивентрикулярных эндотелиальных клеток по сравнению с контролем неперивентрикулярных эндотелиальных клеток.

Эти анализы обеспечивают надежную оценку человеческих перивентрикулярных эндотелиальных клеточных функций и их влияния на интернеронную миграцию. Новая установка дальнего анализа и совместной культуры миграции анализ обеспечивает ячейки свободного пространства в диапазоне сантиметров (1-1,5 см), чтобы позволить обнаружение междугородной миграции. Краткое изложение особенностей наших анализов по сравнению с другими популярными анализами представлено в таблице 1. В совокупности, анализы, описанные здесь будет служить в качестве платформы для оценки "болезненных" перивентрикулярных эндотелиальных клеток и интернейронов, порожденных iPSCs расстройств головного мозга, как шизофрения, аутизм или эпилепсия. Эти анализы также могут быть использованы для определения того, как различные условия (например, ингибиторы, лиганды, РНК) влияют на миграцию клеток. Наконец, эти анализы могут быть оптимизированы для других типов клеток для измерения междугородной миграции, химиотерапии-притяжения или опосредоченной миграции клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культура и хранение перивентрикулярных эндотелиальных клеток человека

  1. Поддержание человеческого перивентрикулярного эндотелиальных клеток на подвале мембраны матричной покрытой (см. Таблица материалов) 6-ну хорошо пластин в перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среде (E6 среды, содержащей 50 нг/мл VEGF-A, 100 нг/мл FGF2 и 5 мКМ ГАМА) на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. Изменение среды каждый альтернативный день.
  2. Оттепель подвал мембраны матрицы в 4 кВ, и сделать 1:100 решение, разбавляя его в холодной DMEM / F12 среды. Пальто каждый колодец из 6-колодец пластины с 1 мл матричного раствора. Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию, по крайней мере 1 ч перед использованием.
  3. Разрешить человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток, чтобы достичь выпуклости 80%-90%. Аспирная среда из колодца. Вымойте скважины один раз с 1 мл стерильных 1x PBS на скважину.
  4. Отсоедините клетки, добавив 1 мл раствора диссоциации клеток (см. Таблицу Материалов)на скважину. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Через 5 минут добавьте 1 мл перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среды. Перенесите клеточный раствор в коническую трубку 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем Accutase для диссоциации клеток здесь, в отличие от TrypLE в разделах 3 и 4.
  5. Центрифуги клетки на 500 х г в течение 5 минут при комнатной температуре, аспирации супернатант и resuspend клетки гранулы в 1 мл перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среде.
  6. Подсчитайте живые клетки, используя метод исключения trypan blue. Семенные клетки в свежих матричных пластинах при плотности 1,2 х 105 клеток/см2. Инкубировать при 37 градусах По кв. м и 5% CO2.
  7. Храните перивентрикулярные эндотелиальные клетки путем криоконсервирования в замораживающей среде (90% перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среды и 10% ДМСО).
    1. Диссоциатив и соберите ячейки следующие шаги 1.3 и 1.4 выше. Подсчитайте клетки в растворе методом исключения trypan blue.
    2. Центрифуги клетки при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант и resuspend клетки гранулы на 5 х 106 клеток / мл замораживания среды.
    3. Распределите 1 мл замораживания средних плюс клетки на криовые. Поместите флаконы в заполненную изопропанолой камеру и охладите на ночь в -80 градусов по Цельсию при 1 кв/мин. Перенесите флаконы в резервуар с жидким азотом на следующий день для длительного хранения.

2. Подготовка перивентрикулярных эндотелиальных клеток человека для ассея

  1. Разрешить человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток, чтобы достичь 70%-80% confluency.
  2. Диссоциативные ячейки следующие шаги от 1,3 до 1,5, как описано выше. Подсчитайте ячейки, используя метод исключения trypan blue.

3. Подготовка человека ГАМК-интернейронов для ассе

ПРИМЕЧАНИЕ: Человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) полученных ГАМК-интернейронов и нейронной среды были коммерчески приобретены (см. Таблица материалов). Нейроны генерируются путем дифференциирования линии iPSC, полученной из фибробластов человека, следуя протоколу, разработанному производителем. Клетки были разморожены и культивированы в соответствии с протоколом производителя.

  1. Оттепель человека ГАМК interneurons и культуры их в 12-хорошо пластины в течение двух недель до флюенции 70%-80%.
  2. В день проведения асссея, теплый раствор диссоциации клеток (см. Таблица материалов)и аликвот нейрональной среды при 37 градусах По Цельсию в течение 10 минут перед использованием.
  3. Аспирная среда из каждого колодца, содержащего клетки. Вымойте клетки с 1 мл стерильных 1x PBS на скважину.
  4. Отсоедините клетки, добавив 0,5 мл предварительно разогретого раствора диссоциации на скважину и инкубируют при 37 градусах По Цельсию в течение 5 мин. Добавить 1 мл нейрональной среды на скважину. Перенесите раствор ячейки в коническую трубку 15 мл. Аккуратно triturate диссоциировать ячейки скопления.
  5. Центрифуги клетки на 380 х г в течение 5 минут при комнатной температуре, аспирации супернатант и resuspend клеточной гранулы в 1 мл нейрональной среды. Подсчитайте живые клетки, используя метод исключения trypan blue.

4. Подготовка контроля человека эндотелиальных клеток для ассе

ПРИМЕЧАНИЕ: Управление человека iPSC полученных эндотелиальных клеток и эндотелиальной клеточной среды были коммерчески приобретены (Таблица материалов). Эти эндотелиальные клетки генерируются путем дифференциирования линии iPSC, полученной от фибробластов, на эндотелиальную судьбу в соответствии с протоколом, разработанным производителем. Клетки были разморожены и культивированы на субстрате Фибронектина в соответствии с протоколом производителя. Пластины с покрытием фибронектина были подготовлены по протоколу производителя.

  1. Оттепель контролировать человека эндотелиальных клеток и культуры их в 6-хорошо пластины с течением 80%-90%.
  2. В день проведения асссея, теплый раствор диссоциации клеток (см. Таблица материалов)и аликвот эндотелиальной среды при 37 градусах По Цельсию в течение 10 минут перед использованием.
  3. Аспирируй среду от каждого колодца, содержащего клетки. Вымойте клетки с 1 мл стерильных 1x PBS на скважину.
  4. Отсоедините клетки, добавив 0,5 мл предварительно разогретого раствора диссоциации на скважину. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавить 1 мл эндотелиальной клеточной среды на скважину, чтобы нейтрализовать раствор диссоциации. Перенесите раствор ячейки в коническую трубку 15 мл.
  5. Центрифуги клетки при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант и resuspend клеточные гранулы в 1 мл эндотелиальной клеточной среды. Подсчитайте живые клетки, используя метод исключения trypan blue.

5. Подготовка одно-хорошего культуры вставки

  1. Оттепель 1 мг/мл раствор ламинина при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию.
  2. Пальто соответствующее количество 35 мм блюд с 0,01% поли-L-орнитинового раствора (1 мл на блюдо). Инкубировать блюда при комнатной температуре не менее 1 ч.
  3. Разбавить 1 мг/мл растворла ламинина 1:300 в стерильной воде до конечной концентрации 3,3 мкг/мл непосредственно перед использованием.
  4. Полностью аспирировать поли-L-орнитин с каждого блюда. Промыть каждое блюдо тщательно 3x с стерильной водой и аспирировать полностью, чтобы избежать поли-L-орнитин индуцированной токсичности клеток.
  5. Добавить 1 мл 3,3 мкг/мл ламинина раствор каждой тарелке и инкубировать при 37 градусов по Цельсию на ночь или по крайней мере 1 ч. Удалить раствор ламинина из блюда непосредственно перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, хранить ламинин содержащие блюда в 4 кв. C. Перед использованием уравновешивать блюда в инкубаторе культуры клеток 37 градусов Цельсия.
  6. Вырезать три стороны одной скважины из двух колодцев силиконовой культуры вставки (Рисунок 1А) с помощью стерильного лезвия для создания одной хорошо вставки (Рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите двухстороннюю вставку, прочно прикрепленную к поверхности оригинальной упаковки, чтобы обеспечить плавный разрез и защитить клей вставки.
  7. Аспирный раствор ламинина из посуды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не мыть посуду стерильными PBS или водой после инкубации ламинина. Влажные поверхности предотвратят плотную приливку вставки культуры.
  8. Удалите одну хорошую вставку с стерильными пинцетом и поместите его в центрполи-L-орнитин / ламинин покрытием блюдо. Пресс по краям вставки, чтобы зафиксировать его на поверхность блюда.
  9. Аккуратно переверните блюдо вверх дном, чтобы убедиться, что вставка твердо придерживается.
  10. Держите блюдо вверх дном и пометить границу вставки отсека с помощью постоянного черного маркера с ультра-тонкий наконечник(Рисунок 1C).

6. Миграционный анализ междугородной

  1. Приостановить человека ГАМК-интернейронов в концентрации 3 х 104 клетки /70 Л нейронной среды. Семя 70 злител яточного раствора внутри каждой одной хорошо культуры вставки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность посева интернейронов в зависимости от рекомендации производителя.
  2. Приостановить человеческие перивентрикулярные эндотелиальные клетки в концентрации 3 х 104 клетки/70 л перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среды. Семя 70 злител яточного раствора внутри каждой одной хорошо культуры вставки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество человеческих перивентрикулярных эндотелиальных клеток, посеянных в соотношении 1:1 с количеством семенных нейронов.
  3. Добавьте 1 мл нейрональной среды в нейронную тарелку, чтобы заполнить область вокруг вставки и предотвратить покрытие от сушки. Аналогичным образом, добавить 1 мл перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среды в перивентрикулярной эндотелиальной клеточной тарелке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить среду медленно вдоль края блюда, так что вставка не нарушается.
  4. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки не протекают из вставки отсека.
  5. Инкубировать клетки для 24 ч при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2. После 24 ч инкубации, проверить под микроскопом, чтобы проверить, что клетки прикрепили должным образом и нет ночной утечки.
  6. После 48 ч посева, осторожно удалить вставку с помощью стерильного пинцета. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что слой клетки остается нетронутым (день 0).
  7. Удалить среду из нейрона блюдо и добавить 1 мл свежей нейронной среды. Аналогичным образом, удалить средний из перивентрикулярной эндотелиальной клеточной тарелке и добавить 1 мл свежей перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отложите необходимое количество блюд и исправить с 4% PFA за день 0 изображений.
  8. Инкубировать клетки в течение 5 дней при 37 градусах По цельсии и 5% CO2. Через 5 дней, удалить средний, исправить клетки с 4% PFA в течение 10 мин, и мыть 3x с 1x PBS.
  9. Нейроны пятен с античеловеческими антителами MAP2 или античеловеческими антителами MAP2, а также эндотелиальные клетки с антителами CD31 античеловека. В конце иммуностоинга, добавить 1 мл антифадеймонтаж среды для каждого блюда.

7. Миграционный ассс

  1. Со-приостановить 3 х 104 ГАМК-интернейронов и 3 х 104 человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток в 70 Зл со-культуры среды (50% перивентрикулярного обслуживания среды без ГАМК и 50% нейрональной среды). Семя этого клеточного раствора внутри односкважинного отсека вставки. Приготовьте соответствующее количество таких assay блюд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ГАМК не был добавлен в среде совместной культуры, чтобы исключить влияние экзогенных ГАМК на миграцию.
  2. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки не протекают из вставки отсека.
  3. Медленно добавьте 1 мл среды совместной культуры вдоль стороны блюда, чтобы предотвратить сушки покрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить среду медленно вдоль края блюда, так что вставка не нарушается.
  4. В качестве первого контроля, семена 3 х 104 человека ГАМК-интернейронов только в 70 Зл со-культуры среды на один хорошо вставки. Приготовьте соответствующее количество таких блюд.
  5. В качестве второго контроля, совместное семя 3 х 104 ГАМК-оргических человеческих интернейронов с 3 х 104 управления человека эндотелиальных клеток в 70 Зл со-культуры среды на один хорошо вставки. Приготовьте соответствующее количество блюд.
  6. Инкубировать блюда для 24 ч при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2. После 24 ч инкубации, проверить под микроскопом, чтобы проверить, что клетки прикрепили должным образом и нет утечки.
  7. После 48 ч посева, осторожно удалить вставку с помощью стерильного пинцета. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что слой клетки не нарушается (день 0).
  8. Удалить средний и добавить 1 мл свежей среды ко-культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отложите в сторону соответствующее количество блюд для приобретения изображения день 0.
  9. Инкубировать клетки в течение 5 дней при 37 градусах По цельсии и 5% CO2.
  10. Через 5 дней, удалить средний, исправить клетки с 4% PFA в течение 10 мин, и мыть 3x с 1x PBS.
  11. Пятно с анти-человеческим к-тубулин или анти-человеческих антител MAP2 для обозначения нейронов. В конце иммуностоинга, добавить 1 мл антифадеймонтаж среды для каждого блюда.

8. Химио-аттракцион Ассай

  1. Поместите трехскважинную культурную вставку в центр поли-L-орнитина/ламинина с покрытием 35 мм с помощью стерильных пинцетов.
  2. Переверните блюдо вверх дном. Отметьте границу вокруг среднего отсека вставки, используя постоянный черный маркер с ультра-тонким наконечником.
  3. Семена 3 х 104 человека ГАМК-интернейронов в среднем отсеке в 70 Зл нейронной среды(рисунок 3A).
  4. Семя 104 человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток в 70 Зл перивентрикулярной эндотелиальной клеточной среды и 104 контроль эндотелиальных клеток в 70 Зл управления эндотелиальной клеточной среды в двух внешних отсеков соответственно(Рисунок 3A).
  5. Добавить 1 мл со-культуры среды (50% перивентрикулярного обслуживания среды без ГАМК и 50% нейрональной среды) вдоль стороны блюда, чтобы предотвратить покрытие на блюдо от сушки.
  6. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки не протекают из вставки отсека.
  7. Инкубировать клетки для 24 ч при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2. После 24 ч инкубации, проверить под микроскопом, чтобы проверить, что клетки прикрепили должным образом и нет утечки.
  8. После 48 ч посева, осторожно удалить вставку с помощью стерильного пинцета. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что слой клетки не нарушается (день 0).
  9. Удалить средний и добавить 1 мл свежей среды ко-культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отложите необходимое количество блюд для изображения дня 0.
  10. Инкубировать клетки для 36 ч при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2. После 36 ч, аспир среднего, исправить клетки с 4% PFA в течение 10 мин, и мыть 3x с 1x PBS.
  11. Пятно человека ГАМК-интернейронов с анти-человека-тубулин или анти-человеческих антител MAP2. В конце процедуры окрашивания, добавить 1 мл антифадемонтаж монтажа среды в каждом блюде.

9. Визуализация и анализ данных

  1. Поместите блюдо с иммунозапятнанными анализами под микроскопом при 4X увеличении.
  2. Держите один длинный край прямоугольной границы (сделанный в шаге 5.10 выше) в поле зрения. Сфотографировать клетки в свободном от клеток пространстве, прилегающем к этой границе. Приобретайте изображения вдоль правого длинного края и левого длинного края прямоугольной границы(рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, расположенные по диагонали по отношению к прямоугольнику, не рассматриваются из-за двусмысленности при выборе короткого или длинного края в качестве стартовой отметки. Кроме того, число клеток, мигрирующих через короткий край, часто значительно меньше (возможно, из-за меньшего числа начальных ячеек вдоль короткого края) и не учитываются.
  3. Откройте изображения в ImageJ. Рассчитайте расстояние между каждой ячейкой и пограничной отметкой(рисунок 2D)с помощью ImageJ.
  4. Для оценки миграции с точки зрения числа клеток установите определенное расстояние от границы на полученном изображении в ImageJ. Подсчитайте количество ячеек, присутствующих на этом расстоянии. Рассчитать среднее число, стандартное отклонение и статистическую значимость с помощью соответствующего программного обеспечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Шаги по настройке одной хорошо культуры вставки внутри 35 мм блюдо показано на рисунке 1. Анализ миграции на расстоянии и анализ миграции сокультуры использовали одну хорошую вставку, чтобы сеять нужное количество клеток в центре поли-L-орнитина/ламинина с покрытием 35 мм. На день 0, клетки присутствовали как прямоугольный заплата(Рисунок 2A,C). В день 0 изображений, день 0 линия может быть легко идентифицирована...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описали три in vitro анализы, которые вместе обеспечивают количественную оценку человека перивентрикулярных эндотелиальных клеточных свойств. Эти анализы будут полезны в получении механистических понимание взаимодействия человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток с человеческими интернейронами. Эксперименты с использованием лигандов, ингибиторов или клеток с генно-специфическим нокдауном или переэкспрессией будут определять или проверять молекулярные плееры, которые посредничают эндотелиальную клеточную и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана наградами От Национального института психического здоровья (R01MH10438) и Национального института неврологических расстройств и инсульта (R01NS100808) а.В.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Раствор для диссоциации аккутазыMillipore SigmaSCR005Раствор для диссоциации клеток (для перивентрикулярных эндотелиальных клеток, шаг 1.4)
Античеловеческое &бета;-тубулиновое антителоBiolegend802001
Античеловеческое антитело CD31Millipore SigmaCBL468
Anti-MAP2 антителоNeuromicsCH22103
Антиактивное антитело к каспазе 3Millipore SigmaAB3623
Контроль эндотелиальных клеток человекаКлеточная динамикаR1022
Контроль эндотелиальных клеток Средняя добавкаКлеточная динамикаM1019
Криогенные флаконыFisherScientific 03-337-7Y
DMEMF/12 среднийThermofisher Scientific11320033
DMSOSigma-AldrichD2650
E6 среднийThermofisher ScientificA1516401
FGF2Thermofisher ScientificPHG0261
фибронектинThermofisher Scientific33016-015
Морозильный контейнерThermofisher Scientific5100
GABASigma-AldrichA2129
ГемацитометрSigma-AldrichZ359629
ГАМКергические нейроны человекаКлеточная динамикаR1013
ГАМКергические нейроны человека база средаКлеточная динамикаM1010
ГАМКергические нейроны человека Нейронная добавкаКлеточная динамикаM1032
ЛамининSigmaL2020
MatrigelCorning356230Матрица базальной мембраны
Монтаж MediumVector laboratoriesH-1200
поли-L-орнитинSigmap4957
PBSThermofisher Scientific14190
Трипан синийThermofisher Scientific15250061
TrypLEThermofisher Научно-12563011Решение для диссоциации клеток (для ГАМКергических интернейронов и эндотелиальных клеток, секции 3 и 4)
VEGF-APeprotech100-20
VascuLife VEGF Medium Complete KitLifeline Cell TechnologiesLL-0003Компонент контроля среды эндотелиальных клеток человека
2-х луночная силиконовая культура-Вставкаibidi80209
3-луночный силикон культура-вкладышibidi80369
чашка 35 ммCorning430165
15 мл коническая трубкаFisher Scientific07-200-886
4% раствор PFAFisher ScientificAAJ19943K2
6-луночный планшет для культуры тканейFisher Scientific14-832-11
Инвертированный фазово-контрастный микроскопZeissZeiss Axiovert 40C
OlympusFSX-100
Флуоресцентный микроскоп

Ссылки

  1. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
  2. Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).
  3. Won, C., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nature Communications. 4, 2149(2013).
  4. Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture. The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).
  5. Li, S., et al. Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior. Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).
  6. Lewis, D. A., Levitt, P. Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment. Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).
  7. Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).
  8. Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
  9. Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders. Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).
  10. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).
  11. Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders. Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , Nara, Japan. (2018).
  12. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
  13. Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).
  14. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).
  15. Vissapragada, R., et al. Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit. Brain Research. 1565, 8-17 (2014).
  16. JoVE Science Education Database. Cell Biology. The Transwell Migration Assay. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
  17. Renaud, J., Martinovic, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. 113, e54356(2016).
  18. Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  19. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).
  20. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).
  21. Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber. Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).
  22. Kim, B. J., Wu, M. Microfluidics for mammalian cell chemotaxis. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Миграция, химиотерапия, и совместно-культурные анализы для стволовых клеток человека, полученных эндотелиальных клеток и ГАМК нейронов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.