Быстрая изготовление пользовательских микрофлюидных устройств для научно-исследовательских и образовательных приложений

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для разработки и изготовления пользовательских микрофлюидных устройств с минимальными финансовыми и временные инвестиции. Цель заключается в содействии внедрению микрофлюидных технологий в биомедицинских исследовательских лабораториях и учебных заведениях.

Аннотация

Микрофлюидные устройства позволяют манипулировать жидкостями, частицами, клетками, микроразмерными органами или организмами в каналах от нано до субмиллиметровых чешуек. Быстрое расширение использования этой технологии в биологических науках обусловило необходимость в методах, доступных широкому кругу исследовательских групп. Современные стандарты изготовления, такие как связь PDMS, требуют дорогостоящих и трудоемких методов литографической связи и склеивания. Целесообразной альтернативой является использование оборудования и материалов, которые легко доступны по цене, требуют минимального опыта и позволяют быстро итерации конструкций. В этой работе мы описываем протокол для проектирования и производства ПЭТ-ламината (PETLs), микрофлюидных устройств, которые являются недорогими, легко изготовить, и потребляют значительно меньше времени для генерации, чем другие подходы к технологии микрофлюиды. Они состоят из термически связанных листов пленки, в которых каналы и другие характеристики определены используя резак корабля. ПЕТЛ решают технические проблемы, связанные с конкретными местами, в то же время значительно уменьшая препятствия на пути их принятия. Такой подход облегчает доступность микрофлюидных устройств как в исследовательских, так и в учебных заведениях, обеспечивая надежную платформу для новых методов исследования.

Введение

Микрофлюитика позволяет контролировать жидкость в небольших масштабах, с объемами от микролитров (1 х 10^-6 л) до пиколитеров (1 х 10^-12 л). Этот контроль стал возможным отчасти благодаря применению методов микрофабрикации, заимствованных из микропроцессорной промышленности^1. Использование микроразмерных сетей каналов и камер позволяет пользователю воспользоваться отдельными физическими явлениями, характерными для малых размеров. Например, в масштабе микрометра жидкостями можно манипулировать с помощью ламинарного потока, где вязкие силы доминируют в инерционных силах. В результате диффузный транспорт становится заметной особенностью микрофлюидики, и может быть изучен количественно и экспериментально. Эти системы могут быть правильно поняты с помощью законов Фика, теории броуновского движения, уравнения тепла, и / или уравнения Навье-Стокса, которые являются важными производными в области механики жидкости и транспортных явлений².

Потому что многие группы в биологических науках исследования сложных систем на микроскопическом уровне, первоначально считалось, что микрофлюидные устройства будут иметь немедленное и значительное влияние на научно-исследовательские приложения в биологии^2,3. Это связано с тем, что диффузия доминирует в переносе малых молекул через мембраны или внутри клетки, а размеры клеток и микроорганизмов идеально подходят для субмиллиметровых систем и устройств. Таким образом, существует значительный потенциал для повышения способа проведения клеточных и молекулярных экспериментов. Однако широкое внедрение биологами микрофлюидных технологий отстает от ожиданий^4. Простой причиной отсутствия передачи технологии могут быть дисциплинарные границы, разделяющие инженеров и биологов. Индивидуальные разработки и изготовление устройств остаются вне возможностей большинства групп биологических исследований, что делает их зависимыми от внешних знаний и возможностей. Отсутствие знакомства с потенциальными приложениями, затраты и время, необходимое для проектирования итерации, также являются значительными барьерами для новых пользователей. Вполне вероятно, что эти барьеры привели к подрыву инноваций и предотвращению широкого применения микрофлюиди для решения проблем в биологических науках.

В качестве примера можно привести: с конца 1990-х годов мягкая фотолитография является методом выбора для изготовления микрофлюидных устройств. PDMS (полидиметилсилоксан, органический полимер на силиконовой основе) является широко используемым материалом из-за его физических свойств, таких как прозрачность, деформируемость и биосовместимость^5. Техника пользуется большим успехом, с лабораторией-на-чип е и орган-на-чип устройств постоянно разрабатываются на этой платформе⁶. Большинство групп, работающих над этими технологиями, однако, находятся в инженерных отделов или имеют прочные связи с ними⁴. Литография обычно требует чистых комнат для изготовления форм и специализированного оборудования связи. Для многих групп это делает стандартные устройства PDMS менее идеальными из-за их капитальных затрат и времени, особенно когда возникает необходимость в повторных изменениях дизайна. Кроме того, технология в основном недоступна для среднего биолога и студентов, не имеющих доступа к специализированным инженерным лабораториям. Было предложено, чтобы микрофлюидные устройства были широко приняты, они должны имитировать некоторые качества материалов, обычно используемых биологами. Например, полистирол, используемый для клеточной культуры и биоассы, является недорогим, одноразовым и поддарен для массового производства. В отличие от этого, промышленное производство микрофлюиды на основе PDMS никогда не реализовывалось из-за его механической мягкости, нестабильности поверхностной обработки и проницаемости газа^5. Из-за этих ограничений, и с целью решения технических проблем с помощью индивидуальных устройств, построенных "в доме", мы описываем альтернативный метод, который использует ксурографию^7,8,9 протоколов и теплового ламинирования. Этот метод может быть принят с небольшим капиталом и время инвестиций.

ПЕТЛ изготавливаются с использованием полиэтиленовой терафталатной (ПЭТ) пленки, покрытой термоадхесивным этилен-виниловым ацетатом (EVA). Оба материала широко используются в потребительских продуктах, являются биосовместимыми и легко доступны при минимальных^{затратах 10}. Пленка PET/EVA может быть получена в виде ламинирующих сумок или рулонов. Используя управляемый компьютером резак, обычно встречающихся в любительских или ремесленных магазинах, каналы вырезаются из одного кинолиста для определения архитектуры устройства^11. Каналы затем герметится, применяя дополнительные пленки (или стеклянные) слои, которые связаны с помощью (офис) теплового ламинатора (Рисунок 1A). Перфорированные, самоклеящиеся виниловые бамперы добавляются для облегчения доступа к каналам. Время изготовления колеблется от 5 до 15 мин, что позволяет быстро итерацию конструкции. Все оборудование и материалы, используемые для изготовления PETL, являются коммерчески доступными и доступными (350 долларов США стартовая стоимость, по сравнению с тысячами USDs для литографии). Таким образом, ПЕТЛ обеспечивают новое решение двух основных проблем, связанных с обычными микрофлюиками: доступность и эффективность времени (см. сравнение PDMS/PETL в дополнительных таблицах 1, 2).

В дополнение к предоставлению исследователям возможность разрабатывать и изготавливать свои собственные устройства, PETLs могут быть легко приняты в классе, потому что они просты и интуитивно понятны в использовании. PETLs могут быть включены в средней школы и колледжа учебные программы⁸, где они используются, чтобы помочь студентам лучше понять физические, химические и биологические концепции, как диффузия, ламинарный поток, микромикс, синтез наночастиц, градиент образования и химиотаксиса.

В этой работе мы иллюстрируем общий рабочий процесс для изготовления чипов PETL модели с различными уровнями сложности. Первое устройство используется для облегчения визуализации клеток и микроорганов в небольшой камере. Второе, более сложное устройство состоит из нескольких слоев и материалов, и используется для исследований в механобиологии⁹. Наконец, мы создали устройство, которое отображает несколько концепций динамики жидкости (гидродинамическая фокусировка, ламинарный поток, диффузный транспорт и микромиксинг) для образовательных целей. Представленный здесь проект рабочего процесса и устройств может быть легко адаптирован для широкого спектра целей как в исследовательских, так и в классе.

Протокол

1. Дизайн

1. Определите приложение для устройств и перечислите компоненты канала/камеры, которые потребуются.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все устройства потребуют входных и выходных каналов. Устройства, используемые для микроскопии, потребуют камеры визуализации. Более сложные устройства потребуют каналов и камер, расположенных в нескольких слоях.
2. Начните с ручного рисования каждого слоя, учитывая, как функциональность устройства зависит от суперпозиции слоев.
3. Нарисуйте окончательные проекты на компьютере с помощью любого программного обеспечения, которое позволяет рисовать линии и формы.
   1. Нарисуйте каждый слой отдельно, используя черные, сплошные линии и формы, лишенные оттенков. Толщина линии 6 или более точек рекомендуется. На данном этапе размеры функций канала и камеры менее важны, чем общие пропорции.
   2. Используйте функцию копирования и вставки при создании функций и наложения слоев. На рисунке 1B можно ознакомиться с примерами рисунков слоя.
4. Импортировать каждый слой в программное обеспечение резак судов(Рисунок 1C). Сделайте это, сделав захват экрана нарисованного дизайна и используя подход перетаскивания и падения.
   1. Создайте новый документ в программном обеспечении для резец ремесла (бесплатно скачать). Бросьте файл изображения на отображаемом коврике. Программное обеспечение будет распознавать большинство файлов изображений.
   2. Увеличите изображение, чтобы облегчить обработку, потянув из угла. Теперь конструкция может быть распознана программным обеспечением с помощью функции трассировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи могут производить de novo конструкции непосредственно на этом программном обеспечении (использовать инструменты рисования в дизайне палитры).
5. Чтобы проследить дизайн, выберите значок Trace (форма бабочки) на правой стороне окна и полностью выберите импортируемые конструкции.
   1. Выберите опцию Trace Preview с меткой. Отрегулируйте (при необходимости) настройки порога и шкалы, чтобы настроить желтый след в соответствии с дизайном.
   2. Выберите Trace из меню Trace, как только желтый след соответствует дизайну. Каналы теперь отображаются как красный контур. Если красный контур соответствует дизайну, импортируемое изображение может быть выбрано и удалено. Конструкция теперь импортируется и готова для размеров.
6. Размер устройства, выбрав прослеживается дизайн и с помощью сетки, предоставляемой программным обеспечением. Потяните, чтобы изменить ширину и длину каналов и камер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение обеспечивает измерения, и небольшие линии могут быть нарисованы временно (использовать палитру дизайна на левой стороне окна) для измерения размеров внутри устройства. Функциональные размеры ширины канала колебллись от 100 мкм до 900 мкм. Размеры, возможно, придется корректировать после тестирования первоначальных прототипов. Важно, чтобы все слои были пропорционально, чтобы обеспечить правильное выравнивание во время сборки.
   1. После правильного размера конструкции выберите квадратный инструмент в меню рисования формы, чтобы нарисовать квадрат/прямоугольник вокруг каждого слоя устройства. Эта форма должна быть одинакового размера для всех слоев. Спример.
7. Создайте отдельный верхний слой, содержащий порты доступа к каналам. Простые конструкции будут состоять из основного (среднего) слоя канала, нижнего уплотнительного слоя (часто стекла) и верхнего слоя, который должен содержать круговые перфорации для доступа к каналам (входы/розетки).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкции, содержащие более трех слоев, потребуют перфорации ввыхода/выхода в несколько слоев (см. рисунок 1C, рисунок 5A). Эти перфорации могут быть уже включены в дизайн, или могут быть добавлены в это время.
   1. Выберите инструмент рисования на левой стороне экрана. Нарисуйте круги над впуском и выходом портов дизайна.
   2. Копировать и вставить как оригинальный дизайн и круги. Стереть каналы с базового устройства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это оставляет входе / выход портов в правильном положении, соответствующие первоначальному дизайну. Формы также могут быть добавлены к периферии каждого слоя, чтобы помочь с выравниванием.
8. Упорядочить все слои, которые будут сокращены на отображаемом коврике. Устройство теперь готово к резке.

2. Резка

1. Нанесите на клейкую режущий коврик (или другой материал) предпочтительной толщины (3 млн. Убедитесь, что клей (матовый) стороны лица вверх и пластиковые (блестящие) стороны лица вниз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте чистые перчатки, чтобы избежать введения масла и микрочастицы в слоях.
2. Сгладить пленку против коврика (Рисунок 1D), удаление всего воздуха, который, возможно, были в ловушке. Это можно сделать с помощью рук в перчатках или ролика.
3. Выровнять край режущего коврика к линии, указанной на резаке. Загрузите коврик, нажав на резак. Держите настройки на резке лезвия между 3 и 5, в зависимости от толщины пленки.
4. Подключите резак USB-кабель к компьютеру.
   1. Выберите вкладку SEND и выберите настройку резки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Множество настроек доступны в каскадном меню. The-Sticker Paper, Clear- это параметр, который хорошо работает с ПЭТ / EVA фильм, который имеет толщину 3-5 млн (75-125 мкм). Измените настройки для различных материалов и сохраните пользовательские настройки для использования в будущем.
5. Нажмите Отправить. Начнется резка(рисунок 1E). Убедитесь, что есть достаточно места в задней части резака для коврика, чтобы двигаться беспрепятственно. Когда резак закончен, выгрузите коврик, выбрав разгрузку на резак. Не вытягивайте коврик перед разгрузкой.

3. Выравнивание

1. Поместите режущий коврик рядом с чистой поверхностью. С перчатками руки, используйте пару пинцета, чтобы поднять каждый слой устройства microfluidics от разреза коврик(Рисунок 1F). Будьте особенно осторожны вокруг поворотов и поворотов в канале; они особенно деликатны и восприимчивы к разрыву и деформации.
2. Поместите слои устройства микрофлюики на чистую поверхность. Заказать их в соответствии с их сверху вниз позиции в устройстве(Рисунок 1G, Рисунок 2A, Рисунок 5А и Рисунок 7A).
3. Вырезать небольшие (3 мм х 10 мм) кусочки двусторонней ленты, которые будут использоваться для временного присоединения слоев вместе.
4. Накладывайте слои один за 1, начиная с нижнего слоя. Добавьте небольшой кусочек двусторонней ленты в угол между слоями, вдали от любых каналов или входов/выходов(рисунок 1G,стрелка). Лента, хотя и не требуется, обездвиживает слои и уверяет, что они не будут сдвиг во время ламинирования. Используйте проволочный джиг для облегчения выравнивания слоев в устройствах с более чем 4 слоями(Дополнительная диаграмма 3).
5. Убедитесь, что клей (мат-EVA) сторона пленки всегда сталкивается с внутренней (внутри слоя части) устройства.
   ВНИМАНИЕ: Обнажение клей будет таять против внутренних частей ламинатора и придерживаться их, в результате не только в потере устройства, но и влияет на будущую производительность ламинатора.
6. После того, как все слои были наложены, проинспектировать устройство. Между всеми слоями должна быть по крайней мере одна сторона EVA, и EVA не должна подвергаться воздействию. При введении материалов с покрытием, не входящих в EVA (например, пленка поливинилхлорид (ПВХ), стекло), пленка с покрытием EVA с обеих сторон может потребоваться, особенно в случае более сложных устройств(рисунок 5).

4. Ламинирование

1. Включите и установите ламинатор в желаемую настройку толщины. Некоторые ламинаторы предлагают 3 и 5 миль настройки, в то время как некоторые нет. Для любого устройства с 4 или более слоев используйте 5-мильную настройку.
2. Как только ламинатор будет готов, запустите устройство через ламинированные ролики(рисунок 1H-I). Поместите конец, к которому двойная лента была добавлена для достижения наилучших результатов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При изготовлении устройств из пяти или более слоев, они могут быть запущены через ламинатор более одного раза.
3. Восстановить ламинированное устройство.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется для устройств, чтобы быть достаточно большим, чтобы сделать легко их восстановление от ламинатора. Это соображение не влияет на размер каналов или архитектуры чипа, он просто требует "рамки", которая может легко пройти через ламинатор, не оставаясь внутри.

5. Впускные/выходные порты

1. Используйте роторный инструмент и 1/32 дюйма сверло бит, чтобы вырезать небольшое отверстие через центр бампера мебели. Кроме того, используйте 1 мм биопсии удар перфорировать бамперы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется буровой пресс. Хотя размеры варьируются, 2 мм х 6 мм диаметр бамперов рекомендуется. Избегайте просто "заколоть" бампер. Если материал не будет удален, бампер будет уплотнения снова(Дополнительная рисунок 1). Перфорации, как указано выше, предназначены для взаимодействия с политереторкетоном (PEEK) трубкой, пипеткой и кончиком, или тупой иглой (16-18 G). Большие перфорации могут быть достигнуты с помощью вращающихся плоскогубцев удар(Дополнительный рисунок 1). Они полезны, когда бампер используется в качестве "резервуара" для жидкостей или других биологических веществ.
2. Убедитесь, что это может быть полностью прозрачно, удалив любой мусор (вызванный бурением или штамповкой) с парой небольших пинцетов.
3. После того, как порты входе/выхода успешно очищаются, тщательно выровняйте бамперы с портами входе/выходом на ламинированном устройстве(рисунок 1J-K). Этот шаг необходим для правильного потока жидкостей в и из устройства. Держите бампер позади устройства, положение клей лицо мягче открытой входе / розетки на устройстве, затем выровнять и придерживаться. Сборка устройств завершена.

6. Тестирование

1. Доступ к архитектуре канала/камеры через перфорированные бамперы (порты). Есть несколько вариантов относительно того, как ввести жидкости и биологические препараты в устройствах.
2. Используйте лабораторные или медицинские/хирургические трубки, прикрепив ее к пластиковому разъему (например, адаптеры Luer) или к тупой игле. Также можно использовать стандартный пипетка и наконечник или трубки PEEK без адаптеров(Дополнительная диаграмма 2).
3. Выполните настой или рисунок жидкости со шприцев и труб с помощью шприцев или перистальтических насосов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Есть много вариантов на рынке, начиная с 300 долларов США на момент написания.
4. Установите различные настройки скорости потока в зависимости от устройства и эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно используем параметры скорости потока в диапазоне 0,01-100 л/мин, но другие ставки могут быть использованы.

Рисунок 1: Изготовление. (A) Офисный ламинатор и резец ремесла являются единственными двумя единицами оборудования, необходимого для изготовления. Оба доступны в Интернете или в магазинах ремесел / канцелярских принадлежностей. Другие необходимые инструменты включают ножницы и пинцет. (B) Нормандская и камерная архитектуры могут быть составлены в цифровом виде с помощью любой программной программы, которая включает в себя инструменты рисования (векторная графика может быть предпочтительна для некоторых пользователей, но не требуется). Линии и фигуры нарисованы черным цветом с белым фоном. Файл или захват экрана дизайна могут быть импортированы в программное обеспечение резак ремесла путем перетаскивания и падения. (C) Craft резак программное обеспечение доступно бесплатно для скачивания и требуется для управления резак. Программное обеспечение приобретает дизайн и позволяет для модификаций, как размер. Он также предоставляет инструменты рисования. (D) Режущий коврик несет пленку для резки. Это слегка клей, что позволяет обездвижить материалы должны быть сокращены. На рисунке показаны четыре различных материала, готовых к загрузке: 3 мили толщиной ПЭТ/EVA пленки (вверху), 5 миль толщиной ПЭТ / EVA пленки (средний), 6 миль толщиной EVA / ПЭТ / EVA (внизу слева) и ПВХ пленки (внизу справа). (E) Cutter открыт для отображения лезвия (в черном) единицы и загружены коврик. (F) После резки, отдельные слои поднимаются с помощью пинцета. Вырезать выходы каналов и камер остаются прикреплены к коврику, а затем удалены и отбрасываются. (G) Индивидуальные слои выровнены и накладываются для ламинации. Небольшие кусочки двусторонней ленты (стрелка) часто используются для выравнивания и предотвращения смещения слоя во время ламинирования. (H, I) Устройство подается в верхней части ламинатора и восстанавливается через слот. Ламинирование обеспечивает надежное уплотнение, оставляя пути канала открытыми. (J, K) Для того, чтобы получить доступ к каналам, необходимо добавить перфорированные, самоклеящиеся виниловые бамперы. Изображение в (J) отображает "обратный" подход к выравниванию, в котором бампер помещается со спины, что позволяет визуальное выравнивание входе / розетки с перфорацией бампера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Результаты

В дополнение к низкой стоимости и быстрой итерации, технология PETL может быть легко настроена для решения конкретных задач. Во-первых, мы описываем простое устройство, состоящее из стеклянного крышки, камерного слоя, слоя канала и впускного/выходного слоя(рисунок 2). Это устройство было разработано для облегчения визуализации клеток и микроорганов под постоянным потоком. Культурная среда пополняется при низких темпах потока для поощрения обмена питательными веществами и газом. Круглая камер...

Обсуждение

В то время как микрофлюитики все чаще присутствуют в арсенале лабораторий по всему миру, темпы внедрения были разочаровывающими, учитывая потенциал для его положительного воздействия¹⁶. Низкая стоимость и высокая эффективность изготовления микрожидкости устройства имеют важное значение для ускорения внедрения этой технологии в средней исследовательской лаборатории. Описанный здесь метод использует несколько слоев пленки для создания двух- и трехмерных устройств на долю времени и затрат, требуемых ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пуансон для биопсии (1 мм)	Miltex	33-31AA	Опционально, заменяет набор ротационного инструмента
Тупые иглы	Janel, Inc.	JEN JG18-0.5X-90	Снять пластик и прикрепить к трубке Tygon
Покровные стекла	Любые		24 x 60 мм предпочтительны
Коврик для резки и лезвия	Silhouette America или Nicapa	www.silhouetteamerica.com/shop/blades-and-mats	повторного использования/одноразовые материалы
Двусторонний	скотч/3M	667	Небольшие количества, любой ширины или марки
Трубка PEEK	IDEX/любой	1581L	Доступны различные конфигурации. Рассмотрите возможность использования трубки Tygon intead, если вы еще не используете
термоламинатную пленку PEEK PET/EVA Scotch	/3M & Transcendia	TP3854-200, TP5854-100 & transcendia.com/products/trans-kote-pet	3 - 6 мил (мил = 1/1000 дюйма) пакеты или рулоны для ламинирования.
Пленка ПВХ - Пищевая пленка	Glad / Любая		упаковка пищевых продуктов
Вращающийся инструмент-дрель	Dremel/Любая	200-121 или другая	1/32 и 3/64" Сверла от Dremel рекомендуется
Резиновый ролик	Speedball	4126	Для облегчения адгезии подойдет любая марка
Ножницы и пинцет	Любые	Fiskars-Inch-Titanium-Softgrip-Scissors |Коул-Пармер  –# UX-07387-12	Рекомендуются качественные бренды
Silhouette CAMEO Craft cutter	Silhouette America	www.silhouetteamerica.com/shop/cameo/SILHOUETTE-CAMEO-3-4T	Предпочтительный крафтовый резак
Silhouette Studio программное обеспечение	Silhouette America	www.silhouetteamerica.com/software	Управляет крафтовым резаком и предоставляет инструменты для рисования (скачать бесплатно MAC и ПК)
Шприцевой насос	Идеально подходят аппараты Harvard или насосы New Era	70-4504 или NE-300	, можно использовать пипетки или бюретки.
Шприцы	Любые		1-3 мл
Термоламинатор	Scotch/3M	TL906	Стандартная модель дома/офиса
Трубка Tygon (E-3603)	Cole-Parmer	EW-06407-70	Использование с тупыми кончиками игл
Виниловые мебельные бамперы	DerBlue/3M/ Everbilt	Прозрачные, самоклеящиеся (6 x 2 мм и 8 x 3 мм)	Рекомендуются круглые бамперы