Изоляция и дифференциация первичных миобластов от мышь скелетных мышц высасывания

Краткое содержание

Myoblasts являются размножающимися клетками-предшественниками, которые дифференцируются, образуя полинуклиатые миотубины и в конечном итоге скелетные мышцы миофиберов. Здесь мы представляем протокол для эффективной изоляции и культуры первичных миобластов от молодых взрослых мышечных скелетных мышц. Метод позволяет молекулярные, генетические и метаболические исследования мышечных клеток в культуре.

Аннотация

Первичные миобласты являются недифференцированными пролиферирующими предшественниками скелетных мышц. Они могут быть культивированы и изучены в качестве предшественников мышц или индуцированных дифференцировать в более поздних стадиях развития мышц. Протокол, представленный здесь, описывает надежный метод изоляции и культуры высокопролиферативной популяции клеток миобласта от молодых взрослых вылабов мышц скелета мыши. Эти клетки полезны для изучения метаболических свойств скелетных мышц различных моделей мыши, а также в других приложениях вниз по течению, таких как трансфекция с экзогенной ДНК или трансдукция с вектором вирусного выражения. Уровень дифференциации и метаболического профиля этих клеток зависит от продолжительности воздействия, и состав средств массовой информации, используемых для индуцирования дифференциации миобластов. Эти методы обеспечивают надежную систему для изучения метаболизма мышечных клеток мыши ex vivo. Важно отметить, что, в отличие от моделей in vivo, описанные здесь методы обеспечивают популяцию клеток, которые могут быть расширены и изучены с высоким уровнем воспроизводимости.

Введение

Хотя часто цитируется в качестве признака общего метаболического здоровья, несколько исследований показали, что индекс массы тела (ИМТ) у пожилых людей не всегда связано с более высоким риском смертности. На сегодняшний день единственным фактором, который, как было показано, соответствует снижению смертности в этой популяции, является увеличение мышечной массы^1. Мышечная ткань представляет собой один из крупнейших источников чувствительных к инсулину клеток в организме, и поэтому имеет решающее значение в поддержании общего метаболического гомеостаза². Активация скелетной мышечной ткани с помощью физических упражнений св....

Протокол

Этот протокол следует рекомендациям по уходу за животными ВКП Scripps Research.

1. Сбор и обработка мышечных тканей Explants

1. За день до вскрытия стерилизовать все вскрытие оборудования (щипцы, лезвия бритвы и ножницы) и подготовить все необходимые носители: фосфат буферный солей (PBS), MB Plating media (12,5 мл DMEM, 12,5 мл HAMS F12, 20 мл тепло-инактивированного плода сыворотки (FBS), 5 мл амниотической жидкости средней добавки), и покрытие решение (24 мл DMEM, 24 мл HAMS F12, 1,7 мл коллагена, 1 мл матригеля).
2. День вскрытия, пальто один 6-см блюдо с покрытием решение для каждой мышцы, чтобы быть вскрыты. Добавьте 2 мл....

Результаты

После раздела 1 предусмотренного протокола должны давать первичные клетки, выходящие из эксплансов, которые будут видны под стандартным световым микроскопом(рисунок 2). Неоднородная популяция клеток будет рассматриваться растет из и окружающих каждой мышечной ткани explant. Миобласты будут выглядеть как маленькие, круглые, яркие сферы. После раздела 2 протокола даст ранний урожай миобластов из тканевых эксплантов, которые будут содержать несколько клеток и бу.......

Обсуждение

Скелетные мышцы имеют жизненно важное значение для создания и поддержания метаболического гомеостаза^11. Изучение физиологии мышц осложняется межиндивидуальной изменчивостью, а также трудностями в получении образцов, особенно в случае человеческих исследований. Культурные первичные миотубеты были показаны, чтобы резюмировать многие особенности физиологии мышц, в том числе гомеостаза кальция¹², регенерация поврежденной мышечной ткани⁵, метаболические и.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Coating Solution:
DMEM	Gibco	10569010	Всегда добавляйте гентамицин (1:1000 по объему) перед использованием; 24 мл
HAMS F12	Lonza	12-615F	Всегда добавляйте гентамицин (1:1000 по объему) перед использованием; 24 мл
Collagen	Life Technologies	A1064401	1,7 мл
Matrigel	Fisher	CB40234A	1 мл
Plating Media:
DMEM	Gibco	10569010	Всегда добавляйте гентамицин (1:1000 по объему) перед использованием; 12,5 мл
HAMS F12	Lonza	12-615F	Всегда добавляйте гентамицин (1:1000 по объему) перед использованием; 12,5 мл
Heat Inactivated FBS	Life Technologies	16000044	20 мл; можно приобрести как обычный FBS, так и термоинактивируемый, поместив в 40 градусов; C водяная баня в течение 20 минут
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 мл
Myoblast Media:
DMEM	Gibco	10569010	Всегда добавляйте гентамицин (1:1000 по объему) перед использованием; 17,5 мл
HAMS F12	Lonza	12-615F	Всегда добавляйте гентамицин (1:1000 по объему) перед использованием; 17,5 мл
тепла Инактивированный FBS	Life Technologies	16000044	10 мл; может быть приобретен как обычный FBS и термоинактивированный, помещенный в 40 ° градусов; C водяная баня в течение 20 мин
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 мл
<сильный>дифференцированный сред:
DMEM	Gibco	10569010	Всегда добавляйте гентамицин (1:1000 по объему) перед использованием; 24 мл
HAMS F12	Lonza	12-615F	Всегда добавляйте гентамицин (1:1000 по объему) перед использованием; 24 мл
Инактивированная лошадиная сыворотка	Sigma	H1138	1,5 мл
инсулин-селен-трансферрин	Life Technologies	41400045	0,5 мл
Другие материалы:
PBS	Gibco	14040133
гентамицин	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
ДМСО	Сигма	472301	Приготовьте в виде 10% ДМСО в среде Миобласта для замораживания клеток
Щипцы	Любые
бритвенные лезвия	Любые
ножницы	Любой
ватман бумага	VWR	21427-648
60 мм пластина	VWR	734-2318
10 см Пластина	VWR	25382-428 (CS)
T25 Колбы	ThermoFisher	156367
T75 Колбы	ThermoFisher	156499
центрифужные пробирки (15 мл)	BioPioneer	CNT-15
<сильно>Расход кислорода:
Seahorse XFe96 Анализатор	Agilent	Seahorse XFe96	Прибор, используемый для измерения интенсивности потребления кислорода, считываемый путем подкисления внеклеточной среды
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	96-луночные планшеты для использования в анализаторе XFe96 Seahorse
XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	компоненты могут быть приобретены у других поставщиков после проведения анализа; некоторые рекомендации перечислены ниже
Субстрат Seahorse XF Palmitate-BSA FAO	Компоненты Agilent	102720-100	могут быть приобретены у других поставщиков после проведения анализа; некоторые рекомендации перечислены ниже:
Пальмитиновая кислота	Sigma	P5585-10G	для измерения окисления жирных кислот
Карнитин	Sigma	C0283-5G	для измерения окисления жирных кислот
Этомоксир	Sigma	E1905	для измерения окисления жирных кислот
BSA	Sigma	A7030	используется в качестве контроля или в конъюгации с пальмитиновой кислотой для измерения окисления жирных кислот

тепла