Изоляция и дифференциация первичных миобластов от мышь скелетных мышц высасывания

Summary

Myoblasts являются размножающимися клетками-предшественниками, которые дифференцируются, образуя полинуклиатые миотубины и в конечном итоге скелетные мышцы миофиберов. Здесь мы представляем протокол для эффективной изоляции и культуры первичных миобластов от молодых взрослых мышечных скелетных мышц. Метод позволяет молекулярные, генетические и метаболические исследования мышечных клеток в культуре.

Abstract

Первичные миобласты являются недифференцированными пролиферирующими предшественниками скелетных мышц. Они могут быть культивированы и изучены в качестве предшественников мышц или индуцированных дифференцировать в более поздних стадиях развития мышц. Протокол, представленный здесь, описывает надежный метод изоляции и культуры высокопролиферативной популяции клеток миобласта от молодых взрослых вылабов мышц скелета мыши. Эти клетки полезны для изучения метаболических свойств скелетных мышц различных моделей мыши, а также в других приложениях вниз по течению, таких как трансфекция с экзогенной ДНК или трансдукция с вектором вирусного выражения. Уровень дифференциации и метаболического профиля этих клеток зависит от продолжительности воздействия, и состав средств массовой информации, используемых для индуцирования дифференциации миобластов. Эти методы обеспечивают надежную систему для изучения метаболизма мышечных клеток мыши ex vivo. Важно отметить, что, в отличие от моделей in vivo, описанные здесь методы обеспечивают популяцию клеток, которые могут быть расширены и изучены с высоким уровнем воспроизводимости.

Introduction

Хотя часто цитируется в качестве признака общего метаболического здоровья, несколько исследований показали, что индекс массы тела (ИМТ) у пожилых людей не всегда связано с более высоким риском смертности. На сегодняшний день единственным фактором, который, как было показано, соответствует снижению смертности в этой популяции, является увеличение мышечной массы^1. Мышечная ткань представляет собой один из крупнейших источников чувствительных к инсулину клеток в организме, и поэтому имеет решающее значение в поддержании общего метаболического гомеостаза². Активация скелетной мышечной ткани с помощью физических упражнений связана с повышением чувствительности к местному инсулину и общего метаболического здоровья^3. В то время как модели in vivo необходимы для изучения физиологии мышц и влияния мышечной функции на интегрированный метаболизм, первичные культуры миотубеб обеспечивают убираемую систему, которая снижает сложность исследований на животных.

Миобласты, полученные из послеродовых мышц, могут быть использованы для изучения влияния многочисленных условий лечения и роста в высоко воспроизводимым образом. Это уже давно признано и несколько методов для изоляции миобласти и культуры были описаны^4,5,6,7,8,9. Некоторые из этих методов используют неонатальные мышцы и дают относительно небольшое количество миобластов^5,8, требующих нескольких животных для более масштабных исследований. Кроме того, наиболее широко используемые методы культивирования миобластов используют «предварительное покрытие» для обогащения миобластов, которые менее привержены, чем другие типы клеток. Мы обнаружили, что альтернативный метод обогащения, описанный здесь, является гораздо более эффективным и воспроизводимым для обогащения высокопролиферативной популяции мизобластов. Таким образом, этот протокол позволяет изоляции высоко пролиферативных миобластов от молодых взрослых мышц explants, через нарост в культуре средств массовой информации. Myoblasts можно собрать повторно, над несколькими днями, быстро расширено, и наведено для того чтобы продифференцировать в myotubes. Этот протокол воспроизводит большое количество здоровых клеток миобласта, которые надежно дифференцируются в спонтанно подергивания миотубебий. Это позволило нам изучать метаболизм и циркадные ритмы в первичных миотубеусах мышей различных генотипов. Наконец, мы включаем методы подготовки миотубев для изучения окислительного метаболизма, используя измерения уровня потребления кислорода в 96-колодцах.

Protocol

Этот протокол следует рекомендациям по уходу за животными ВКП Scripps Research.

1. Сбор и обработка мышечных тканей Explants

1. За день до вскрытия стерилизовать все вскрытие оборудования (щипцы, лезвия бритвы и ножницы) и подготовить все необходимые носители: фосфат буферный солей (PBS), MB Plating media (12,5 мл DMEM, 12,5 мл HAMS F12, 20 мл тепло-инактивированного плода сыворотки (FBS), 5 мл амниотической жидкости средней добавки), и покрытие решение (24 мл DMEM, 24 мл HAMS F12, 1,7 мл коллагена, 1 мл матригеля).
2. День вскрытия, пальто один 6-см блюдо с покрытием решение для каждой мышцы, чтобы быть вскрыты. Добавьте 2 мл покрытия раствора на поверхность каждой пластины, встряхните осторожно, чтобы создать ровный слой на поверхности, и инкубировать пластины с раствором при 4 C в течение 1 ч.
3. Снимите решение для покрытия с пластин и вернитесь к биржевому раствору.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Решение для покрытия может быть повторно использовано на срок до шести месяцев и должно храниться при 4 градусах Цельсия.
4. Промыть пластины дважды с 2 мл PBS для удаления несвязанного коллагена и матригеля.
5. Поместите пластины в инкубатор культуры тканей 37 градусов во время вскрытия.
6. Приготовьте влажную камеру, поместив 2-3 листа толстой абсорбцивенной бумаги в полиэтиленовый пакет или стерильные 15 см блюдо и использовать пипетку, чтобы намочить поверхность бумаги стерильной водой.
7. Поместите камеру под ультрафиолетовым светом в течение 5 минут для стерилизации.
8. Вскрыть желаемые мышцы от 4 до 8-недельной мыши. Для стерилизации мышечной ткани, аккуратно промыть в PBS, содержащий 40 мкг/мл гентамицина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для четырехглавой и гастрокнемиозных мышц, пластины 1 мышцы на тарелку. Для soleus, plantaris и EDL, объединить мышцы обеих ног в одной пластине.
9. Используйте стерильные щипцы для переноса мышцы в стерильную 10 см непокрытую чашку Петри. Добавьте 0,5-1,0 мл покрытия носителей над мышцей так, что ткань влажная, но не плавающая(рисунок 1A).
10. Используйте стерильный скальпель или лезвие бритвы, чтобы аккуратно нарезать мышцу небольшими фрагментами (примерно 1-3 мм^3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно свести к минимуму обработку мышечной ткани для достижения наилучших результатов.
11. Используйте щипцы или пипетку для переноса фрагментов мышц на поверхность предварительно покрытой 6-сантиметровой пластиной. Очень аккуратно наложить дополнительные 0,8 мл покрытия средств массовой информации над тканью. Там должно быть достаточно средств массовой информации, чтобы держать ткани части гидратированных, но неплавающие (Рисунок 1B).
12. Поместите 6-см блюда, содержащие фрагменты мышц внутри влажной камеры и вернуться в инкубатор (37 градусов по Цельсию, 5% CO₂) для 48 ч(рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы фрагменты мышц прилипли к поверхности пластины, чтобы обеспечить рост миобласта. Не перемещайте пластины/камеры, по крайней мере, 48 ч.
13. После 48 ч, тщательно проверить пластины, чтобы убедиться, что фрагменты мышц придерживались. Наложение с 2 мл Plating Media, заботясь, чтобы не выбить фрагменты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии видимого загрязнения или мусора на пластинах, тщательно мыть мышечные части. Плита 2 мл раствора PBS/gentamicin на краю пластины и кончик осторожно, чтобы промыть мышечную ткань. Снимите PBS и повторите шаг стирки. После второй стирки, наложение 2 мл покрытия media.
14. Держите пластины в инкубаторе 37 градусов по Цельсию в течение еще 3 дней (5 дней с момента первоначального вскрытия) до сбора миобластов. Проверяйте каждый день на рост мыобластов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Появление клеток, возникающих из мышечных эксплантов, будет переменным и неоднородным. Первичные миобласты кажутся маленькими, круглыми и яркими клетками. Тем не менее, это не является ни необходимым, ни надежным, чтобы определить их по их внешнему виду на данном этапе(рисунок 2).

2. Урожай перерастания myoblasts

1. Подготовка и предварительное теплое Myoblast Media (17,5 мл DMEM, 17,5 мл HAMS F12, 10 мл FBS, 5 мл амниотической жидкости средней добавки), трипсин, и PBS / гентамицин. Пальто один T25 колба на мышцы группы собирают с покрытием решение и, как описано в шаге 1.2 (см. Таблица 1).
2. Удалите Plating Media и аккуратно промыть мышцы explants с 2 мл PBS / гентамицин. Быстро удалить PBS (промыть одну тарелку в то время, и не позволяйте пластины сидеть в PBS на этом этапе).
3. Аккуратно добавьте 1 мл PBS/gentamicin и поместите тарелку в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 1 мин.
4. Используйте пипетку P1000 для сбора PBS/клеток в 15 мл центрифуги трубки.
5. Добавьте 1 мл трипсина в тарелку и вернитесь в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 3 мин. Аккуратно коснитесь пластин, чтобы выбить миобласты. Соберите трипсин/клетки и объедините с коллекцией PBS. Добавьте 8 мл Myoblast Media в центрифугу трубки и аккуратно инвертировать, чтобы смешать.
6. Аккуратно наложить 2 мл покрытия раствора на мышечные пластины и вернуться к инкубатору 37 градусов.
7. Спин центрифуговых трубок, содержащих клетки в центрифуге в течение 3 мин при 200 х г.
8. Примачивайте супернатант до 1 мл, стараясь избежать клеточных гранул. Аккуратно добавьте Myoblast Media (см. таблицу 1) и перенесите клетки в предварительно покрытую колбу и поместите в инкубатор 37 градусов по Цельсию. Это урожай P0. При наблюдении под микроскопом, может быть очень мало клеток(Рисунок 3).
9. Повторите урожай, описанный выше, через день до трех раз. После третьего урожая отбросьте эксплансы.

3. Расширение и обогащение размножающихся миобластов

ПРИМЕЧАНИЕ: Урожай P0 будет неоднородным (60% миобластов). Следующие 2 прохода используют PBS для выборочного сбора миобластов. Многие из более приверженных клеток будут оставлены позади, и быстро размножающиеся миобласты будут на 95% чистой в течение 2 проходов. Как только myoblasts установлены, они должны быть сохранены на низкой плотности, чтобы избежать спонтанной дифференциации.

1. Для каждой колбы T25 из 40-50% сливающихся ячеек из раздела 2, пальто один T75 колбу с 5 мл покрытия решение и место на 4 КК для 1-4 ч.
2. Снимите решение для покрытия из колбы и вернитесь к штоковому раствору. Промыть фляги дважды с 2 мл PBS / гентамицин и место в инкубаторе 37 градусов по Цельсию.
3. Аспирируйте средства массовой информации из P0 myoblast T25 фляги. Промыть клетки кратко с 2 мл теплого PBS / гентамицин. АспирpbPB из колбы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этого шага (3.3) является снижение вероятности бактериального загрязнения. Если выполняется быстро и осторожно, это не должно привести к потере myoblasts. Он может быть опущен, чтобы максимизировать сохранение myoblast при желании.
4. Пипетка 2 мл теплого PBS (не трипсин) в каждую колбу, содержащую myoblasts. Поместите фляги с PBS в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 3 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Myoblasts должны легко отделить от колбы с PBS. Использование PBS, а не трипсин на этом этапе имеет решающее значение для снижения загрязнения населения myoblast с другими типами клеток.
5. Удалите клетки из инкубатора 37 градусов и твердо коснитесь стороны колбы, чтобы выбить клетки. Проверьте под легким микроскопом для свободно плавающих myoblasts.
6. Поместите колбы вертикально в капюшон культуры ткани и промыть дно колбы с 10 мл Myoblast Media 2-3 раза, чтобы убедиться, что все клетки выбиты.
7. Соберите клеточной/медиа-смеси в 15 мл центрифуги трубки. Центрифуга в течение 3 мин при 200 х г.
8. Примачивайте средства массовой информации до 1 мл, стараясь избежать клеточной гранулы. Аккуратно добавьте соответствующий объем Myoblast Media в центрифугу трубки и аккуратно перемешайте.
9. Распределите клеточную смесь на новые фляги T75. Добавьте 10 мл Myoblast Media к каждой новой колбе T75. Аккуратно встряхните колбы горизонтально, чтобы распределить клетки и поместить в инкубатор 37 градусов на ночь.
10. Два дня спустя, проход еще раз с PBS, расщепление каждой колбы T75 на три T75 фляги.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте myoblasts стать более чем на 50%-60% смещается, так как это приведет к их началу дифференциации и потере пролифатеривной способности.
11. Для дополнительных проходов используйте трипсин. Проходя дважды с PBS дает попытки дальнейшего улучшения чистоты, как правило, приводят к более плохой дифференциации.

4. Дифференциация первичных миобластов на миотубы

1. Плита P2 (или более поздний проход) myoblasts в Myoblast Media на покрытием пластин (см. таблицу 1 для предлагаемых объемов покрытия и покрытия и номеров клеток). Два или три дня спустя, когда клетки находятся на 70-80% вспыхнувания, изменить средства массовой информации на дифференциации СМИ (24 мл DMEM, 24 мл HAMS F12, 1,5 мл тепла инактивированной сыворотки лошади, 0,5 мл инсулина-селения-трансферрин).
2. Изменение дифференциации СМИ через день во время дифференциации первичных миобластов в миотубевые. Дифференциация, как правило, завершается к 4-5 дню и будет отмечена удлиненных, сброшенных ячеек, которые спонтанно дергаются. Выполняйте эксперименты на дифференцированных миотубевах в течение 6 дней. Обычно клетки просачиваются через пять или шесть дней после инициации.

5. Измерение уровня потребления кислорода в Миобластах или Миотубевах в 96-колодцах пластин

1. Пальто 96-колодец пластин ы с 25 злителю покрытия раствора на скважину. Centrifuge пластинна на 58 х г в течение 1 мин, чтобы удалить любые пузырьки.
2. Инкубировать пластины в покрытии раствора для 1-4 ч при 4 градусах Цельсия. Используйте многоканальный пипетка для снятия покрытия и мыть три раза в 25 Л холодных PBS/gentamicin. Centrifuge по крайней мере один из этих стихов, чтобы убедиться, что не пузыри в ловушке.
3. Добавьте 40 qL дифференциации Media к каждому колодцу. Центрифуги средств массовой информации на покрытием пластины без клеток в течение 1 мин на 58 х г, чтобы избежать пузырьков и удалить поверхностное натяжение, чтобы получить единый слой средств массовой информации.
4. Добавьте клетки, подвешенные в дополнительном 40 злитроносителях к каждой скважине. Спин снова на 58 х г.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность в покрытии имеет важное значение для достижения наилучших результатов и количество клеток, покрых на скважину, должно быть оптимизировано для каждой экспериментальной установки, и, вероятно, будет находиться в диапазоне от 10 000 до 25 000 миобластов, покрытых дифференциационными средствами в колодец 96-колодцвой пластины.
5. Аккуратно меняйте средства массовой информации ежедневно во время дифференциации. Не аспирировать средства массовой информации, а удалить его с пипеткой, оставляя небольшой объем позади, чтобы избежать вытеснения клеток или подвергая их воздуху. Например, заменить 50 л за один раз на три повтора, а не все 80 л одновременно.
6. Используйте 8-15 скважин на состояние. Это может быть необходимо, чтобы опустить некоторые скважины, если клетки не образуют единый слой миотубетов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Опускательные скважины по краям пластины, потому что они очень восприимчивы к испарению. Измените установку пластины для экспериментальных репликаций, чтобы избежать систематических ошибок.
7. Выполните желаемое ассеина на дифференцированных миотубайтах в течение 1-2 дней полной дифференциации (День 4-6 с начала дифференциации). Рекомендуемые приборы и реагенты для измерения уровня потребления кислорода перечислены в таблице материалов.

Results

После раздела 1 предусмотренного протокола должны давать первичные клетки, выходящие из эксплансов, которые будут видны под стандартным световым микроскопом(рисунок 2). Неоднородная популяция клеток будет рассматриваться растет из и окружающих каждой мышечной ткани explant. Миобласты будут выглядеть как маленькие, круглые, яркие сферы. После раздела 2 протокола даст ранний урожай миобластов из тканевых эксплантов, которые будут содержать несколько клеток и бу...

Discussion

Скелетные мышцы имеют жизненно важное значение для создания и поддержания метаболического гомеостаза^11. Изучение физиологии мышц осложняется межиндивидуальной изменчивостью, а также трудностями в получении образцов, особенно в случае человеческих исследований. Культурные первичные миотубеты были показаны, чтобы резюмировать многие особенности физиологии мышц, в том числе гомеостаза кальция¹², регенерация поврежденной мышечной ткани⁵, метаболические и...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coating Solution:
DMEM	Gibco	10569010	Всегда добавляйте гентамицин (1:1000 по объему) перед использованием; 24 мл
HAMS F12	Lonza	12-615F	Всегда добавляйте гентамицин (1:1000 по объему) перед использованием; 24 мл
Collagen	Life Technologies	A1064401	1,7 мл
Matrigel	Fisher	CB40234A	1 мл
Plating Media:
DMEM	Gibco	10569010	Всегда добавляйте гентамицин (1:1000 по объему) перед использованием; 12,5 мл
HAMS F12	Lonza	12-615F	Всегда добавляйте гентамицин (1:1000 по объему) перед использованием; 12,5 мл
Heat Inactivated FBS	Life Technologies	16000044	20 мл; можно приобрести как обычный FBS, так и термоинактивируемый, поместив в 40 градусов; C водяная баня в течение 20 минут
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 мл
Myoblast Media:
DMEM	Gibco	10569010	Всегда добавляйте гентамицин (1:1000 по объему) перед использованием; 17,5 мл
HAMS F12	Lonza	12-615F	Всегда добавляйте гентамицин (1:1000 по объему) перед использованием; 17,5 мл
тепла Инактивированный FBS	Life Technologies	16000044	10 мл; может быть приобретен как обычный FBS и термоинактивированный, помещенный в 40 ° градусов; C водяная баня в течение 20 мин
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 мл
<сильный>дифференцированный сред:
DMEM	Gibco	10569010	Всегда добавляйте гентамицин (1:1000 по объему) перед использованием; 24 мл
HAMS F12	Lonza	12-615F	Всегда добавляйте гентамицин (1:1000 по объему) перед использованием; 24 мл
Инактивированная лошадиная сыворотка	Sigma	H1138	1,5 мл
инсулин-селен-трансферрин	Life Technologies	41400045	0,5 мл
Другие материалы:
PBS	Gibco	14040133
гентамицин	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
ДМСО	Сигма	472301	Приготовьте в виде 10% ДМСО в среде Миобласта для замораживания клеток
Щипцы	Любые
бритвенные лезвия	Любые
ножницы	Любой
ватман бумага	VWR	21427-648
60 мм пластина	VWR	734-2318
10 см Пластина	VWR	25382-428 (CS)
T25 Колбы	ThermoFisher	156367
T75 Колбы	ThermoFisher	156499
центрифужные пробирки (15 мл)	BioPioneer	CNT-15
<сильно>Расход кислорода:
Seahorse XFe96 Анализатор	Agilent	Seahorse XFe96	Прибор, используемый для измерения интенсивности потребления кислорода, считываемый путем подкисления внеклеточной среды
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	96-луночные планшеты для использования в анализаторе XFe96 Seahorse
XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	компоненты могут быть приобретены у других поставщиков после проведения анализа; некоторые рекомендации перечислены ниже
Субстрат Seahorse XF Palmitate-BSA FAO	Компоненты Agilent	102720-100	могут быть приобретены у других поставщиков после проведения анализа; некоторые рекомендации перечислены ниже:
Пальмитиновая кислота	Sigma	P5585-10G	для измерения окисления жирных кислот
Карнитин	Sigma	C0283-5G	для измерения окисления жирных кислот
Этомоксир	Sigma	E1905	для измерения окисления жирных кислот
BSA	Sigma	A7030	используется в качестве контроля или в конъюгации с пальмитиновой кислотой для измерения окисления жирных кислот