Методическая статья

Узор геометрия человеческих эмбриональных колоний стволовых клеток на совместимых субстратов для управления тканью уровня механики

DOI:

10.3791/60334

⸱

28 сентября 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco and University of California Berkeley, 2Center for Bioengineering and Tissue Regeneration, Department of Surgery, University of California San Francisco, 3Department of Mechanical Engineering, University of California Berkeley, 4Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California San Francisco, 5UCSF Comprehensive Cancer Center, Helen Diller Family Cancer Research Center, University of California San Francisco, 6Department of Anatomy, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, and Department of Radiation Oncology, University of California San Francisco

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные матричные лиганды могут быть узорчатына на гидрогели полиакриламид, чтобы культура эмбриональных стволовых клеток человека в ограниченных колониях на совместимых субстратах. Этот метод может быть объединен с микроскопией силы тяги и биохимическими анализами для изучения взаимодействия между геометрией тканей, силами, генерируемыми клетками, и спецификацией судьбы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриональные стволовые клетки человека демонстрируют уникальную способность реагировать на морфогены в пробирке самоорганизующиеся модели спецификации судьбы клеток, которые соответствуют первичному образованию зародышевого слоя во время эмбриогенеза. Таким образом, эти клетки представляют собой мощный инструмент для изучения механизмов, которые управляют ранним развитием человека. Мы разработали метод культуры эмбриональных стволовых клеток человека в замкнутых колониях на совместимых субстратах, который обеспечивает контроль как над геометрией колоний, так и над их механической средой, чтобы резюмировать физические параметры, которые в основе эмбриогенеза. Ключевой особенностью этого метода является способность генерировать гидрогели полиакриламид с определенными паттернами внеклеточного матричного лиганда на поверхности для содействия вложению клеток. Это достигается путем изготовления трафаретов с желаемыми геометрическими узорами, использования этих трафаретов для создания узоров внеклеточного матричного лиганда на стеклянных крышках, и переноса этих узоров на гидрогели полиакриламидов во время полимеризации. Этот метод также совместим с микроскопией силы тяги, что позволяет пользователю измерять и картировать распределение клеточных сил в пределах ограниченных колоний. В сочетании со стандартными биохимическими анализами, эти измерения могут быть использованы для изучения роли механических сигналов в спецификации судьбы и морфогенеза в начале человеческого развития.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриональные стволовые клетки человека (HESCs) имеют большие перспективы для использования в регенеративной медицине и применениях тканей. Плюрипотентная природа этих клеток дает им возможность дифференцироваться в любой тип клеток взрослого. Хотя большие успехи были сделаны в направлении судьба hESCs к конкретным типам клеток, она остается очень трудно генерировать целые ткани или органы de novo1,2,3,4, 5. Это в значительной степени объясняется ограниченным пониманием механизмов, которые приводят к образованию этих тканей в процессе развития человека. Для того, чтобы восполнить этот пробел в знаниях, в последние годы появился ряд методов моделирования раннего эмбриона и последующих стадий развития с эмбриональными стволовыми клетками6,7,8,9 ,10,11,12,13.

Вскоре после получения первых линий hESC14, было продемонстрировано, что эмбриональные тела, образованные из hESCs были способны спонтанно производить клетки из трех основных слоев зародыша6. Однако из-за присущего ему отсутствия контроля над размером и морфологией эмбриональных тел организация зародышевых слоев значительно изменилась и не соответствовала организации раннего эмбриона. Совсем недавно, Warmflash и др. разработали метод, чтобы ограничить колонии hESCs на стеклянных субстратов через микропаттернинг, обеспечивая контроль и согласованность над размером и геометрией колоний8. В присутствии BMP4, важного морфогена в раннем развитии, эти замкнутые колонии были способны самоорганизовать воспроизводимые модели спецификации к судьбам, представляющим первичные слои микробов. Хотя это дало полезную модель для изучения механизмов, с помощью которых устанавливаются первичные слои микробов, модели спецификации судьбы точно не соответствовали организации и морфогенезу, наблюдаемым во время эмбриогенеза15. Более верный повторение раннего эмбрионального развития было достигнуто путем встраивания hESCs в трехмерную внеклеточную матрицу (ECM) матригель11, обеспечивая на сегодняшний день убедительные доказательства способности ГССК самоорганизоваться и моделировать ранних стадиях эмбриогенеза ex vivo. Однако этот метод дает противоречивые результаты и, таким образом, несовместим с рядом анализов, которые могут быть использованы для выявления основополагающих механизмов самоорганизации и спецификации судьбы.

Учитывая эти существующие методы и их соответствующие ограничения, мы стремились разработать метод воспроизводства колоний hESC определенных геометрий в условиях, которые моделируют внеклеточной среды раннего эмбриона. Для этого мы использовали гидрогели полиакриламидового упругости для управления механическими свойствами субстрата. Используя атомную силовую микроскопию на куриных эмбрионах на стадии гастрирования, мы обнаружили, что эластичность эпибласта варьировалась от сотен паскалей до нескольких килопаскалей. Таким образом, мы сосредоточились на генерации гидрогелей полиакриламидов с эластичностью в этом диапазоне, чтобы служить в качестве субстрата для колоний HESC. Мы модифицировали наши предыдущие методы культивирования ГЭС на полиакриламидных гидрогелях7,9, чтобы обеспечить надежный контроль над геометрией колоний. Мы достигли этого путем первого узора ECM лиганды, а именно matrigel, на стеклянные крышки через микрофабрикаты трафаретов, как ранее сообщалось16. Затем мы разработали новую технику для переноса узорчатого лиганда на поверхность гидрогелей полиакриламидов во время полимеризации. Метод, который мы описываем здесь включает в себя использование фотолитографии для изготовления кремниевой пластины с желаемыми геометрическими узорами, создание марок диссертаций геометрических особенностей с полидиметилсилоксаном (PDMS), и с помощью этих марок для создания трафаретов, которые в конечном счете позволяют узор лиганда на поверхность стеклянных покрывающих и переносить на полиакриламид.

В дополнение к повторению механической среды раннего эмбриона, ограничение hESC колоний на полиакриламид позволяет измерения клеточных сил с помощью маслечной микроскопии силы (TFM), как сообщалось в нашем предыдущем методе9. Короче говоря, флуоресцентные бусы могут быть встроены в полиакриламид и использоваться в качестве фидуциальных маркеров. Силы, генерируемые клетками, рассчитываются путем визуализации смещения этих бусин после посева hESCs на узорчатый субстрат. Кроме того, полученные карты силы тяги могут быть объединены с традиционными анализами, такими как иммуностогирование, для изучения того, как распределение клеточных сил в замкнутых колониях HESC может регулировать или модулировать вниз по течению сигнализации. Мы ожидаем, что эти методы покажут, что механические силы играют важную роль в моделиции спецификации судьбы клеток во время раннего эмбрионального развития, которое в настоящее время упускается из виду.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, описанные здесь, относящиеся к использованию hESCs были одобрены человека Gamete, эмбрионов и стволовых клеток исследований (GESCR) Комитета в Университете Калифорнии в Сан-Франциско.

1. Приготовление кремниевой пластины с геометрическими особенностями

  1. Создайте фотомаску с желаемыми геометрическими особенностями. Используйте программное обеспечение для разработки функций с помощью компьютера. Для использования с отрицательным фоторезис, сделать функции непрозрачными и оставшуюся часть маски прозрачной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для узора на 18 мм диаметр охватывает, групповые функции для каждого экспериментального состояния в 10 х 10 мм областях для обеспечения трафаретов, генерируемых в шаге 3 подходят на крышки.
  2. Спин пальто отрицательное фотоустойчивость на 100 мм кремниевой пластины. Используйте лист данных photoresist для определения скорости и длины вращения для создания толщины пленки 100-250 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина пленки должна быть скорректирована таким образом, чтобы соотношение сторон ширины узоров к высоте трафарета было максимально приближено к 1:1. Тем не менее, мы рекомендуем минимальную толщину 100 мкм, так как все меньше производит деликатные трафареты, которые легко рвутся.
  3. Обработка фотоустойчивость в соответствии с листом данных продукта. Это обычно включает в себя мягкую выпечку, УФ-экспозицию с фотома-маской в маске выравнивания, после экспозиции испечь, развитие, и жесткий выпекать. Например, процедура, используемая для обработки пластин, используемых в этом протоколе, изложенав таблице 1 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при обработке кремниевых пластин, поскольку они хрупкие. После сгенерированного, могут быть использованы повторно до тех пор, пока они не повреждены.

2. Подготовка обложек

  1. Приготовление кислотно-промытых «верхних» чехлов
    1. Поместите 18 мм диаметром #1 толщиной покрывает в стеклянную чашку Петри. Соответствующее количество покрывало зависит от размера блюда. Для 100-мм блюда приготовьте 50-100 чехлов за один раз. Объемные суммы, выделяемые на оставшуюся часть этого раздела, соответствуют 100-миллиметровому блюду.
    2. Добавьте 20 мл 1 м HCl в чашку Петри и осторожно встряхните блюдо, чтобы разогнать крышки. Убедитесь, что все крышки погружены и высвобождают пузырьки воздуха между крышками. Инкубировать на ночь при комнатной температуре с нежной тряской.
      ВНИМАНИЕ: HCl кислый и коррозионный. Используйте осторожность и носите соответствующие СИЗ во время работы с HCl.
    3. Декант HCl из блюда. Добавьте 20 мл ультрачистой воды и промойте нежной тряской в течение 10 мин. Отбросьте воду и повторите в общей сложности пять стирков.
    4. После отбрасывания окончательной стирки, добавить 20 мл 100% этанола в блюдо. Используя щипц, удалите крышки по отдельности и расположите между двумя кусками фильтровальной бумаги, чтобы высохнуть.
    5. Храните сушеные крышки в запечатанном контейнере. Кислотные крышки могут быть подготовлены заранее и храниться в течение месяца или дольше в условиях, свободных от пыли.
  2. Приготовление глютаральдегида активированных "нижних" чехлов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к предыдущим методам для получения дополнительной информации7,9.
    1. Поместите 18 мм диаметром #1 толщиной покрываетв в чашку Петри.
    2. Добавьте 20 мл 0,2 М HCl в чашку Петри и осторожно встряхните блюдо, чтобы разогнать крышки. Убедитесь, что все крышки погружены и высвобождают пузырьки воздуха между крышками. Инкубировать на ночь при комнатной температуре с нежной тряской.
    3. Декант HCl из блюда. Добавьте 20 мл ультрачистой воды и промойте нежной тряской в течение 10 мин. Отбросьте воду и повторите в общей сложности пять стирков.
    4. После отбрасывания окончательной стирки, добавить 20 мл 0,1 М НаОХ и встряхнуть осторожно, чтобы разойтись и погрузить крышки. Инкубировать при комнатной температуре с нежной тряской в течение 1 ч.
    5. Декант NaOH из блюда. Добавьте 20 мл ультрачистой воды и промойте нежной тряской в течение 10 мин. Отбросьте воду и повторите в общей сложности пять стирков.
    6. После отбрасывания окончательной стирки, добавить 20 мл 1:200 разбавления 3-aminopropyltrimethoxysilane в ультрачистой воде и встряхнуть осторожно, чтобы разойтись и погрузить крышки. Инкубировать при комнатной температуре с нежной тряской в течение 1 ч или на ночь.
      ВНИМАНИЕ: 3-аминопропилтриметоксилан является легковоспламеняющимся и может вызвать раздражение кожи. Обработайте с осторожностью, изнашивайте соответствующие СИЗ и выбрасывайте отходы в соответствии с местными правилами утилизации.
    7. Декант разбавленный 3-аминопропилтриметоксилановый раствор из блюда. Добавьте 20 мл ультрачистой воды и промойте с нежной тряской в течение 10 мин. Отбросьте воду и повторите в общей сложности не менее пяти стирков. Очень важно, чтобы удалить все 3-aminopropyltrimthoxysilane перед началом работы.
    8. После отбрасывания окончательной стирки, добавить 20 мл 1:140 разбавления 70% глютаральдегида в фосфат буферных солей (PBS) и встряхнуть осторожно, чтобы разогнать и погрузить крышки. Инкубировать при комнатной температуре с нежной тряской в течение 1 ч или на ночь.
      ВНИМАНИЕ: 70% глютаральдегид является токсичным и может вызвать раздражение кожи. Обработайте с осторожностью, изнашивайте соответствующие СИЗ и выбрасывайте отходы в соответствии с местными правилами утилизации.
    9. Декант разбавленный раствор гюмтаральдегида из блюда. Добавьте 20 мл ультрачистой воды и промойте нежной тряской в течение 10 мин. Отбросьте воду и повторите в общей сложности пять стирков.
    10. После отбрасывания окончательной стирки, добавить 20 мл 100% этанола. Используя щипц, удалите крышки по отдельности и расположите между двумя кусками фильтровальной бумаги, чтобы высохнуть.
    11. Храните сушеные крышки в запечатанном контейнере. Глютаральдегид активированные крышки могут быть подготовлены заранее и храниться до шести месяцев.

3. Поколение трафаретов для узоров ECM лиганда

  1. Генерация промежуточных марок пополиметилсилоксана (PDMS)
    1. Смешайте базу PDMS с агентом лечения PDMS в соотношении 10:1, по весу. Тщательно перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для первоначального применения PDMS, подготовить около 100 г PDMS для заполнения 100 мм блюдо. Для последующего применения удалите PDMS только из центра блюда, где расположены кремниевые пластины, и приготовьте 20-30 г новых PDMS.
    2. Дега смесь PDMS в desiccator в течение 30-60 минут или до тех пор, пока все пузырьки воздуха удаляются.
    3. Поместите модифицированную кремниевую пластину от шага 1 в пластиковую тарелку 100 мм. Медленно и равномерно вылейте смесь PDMS на поверхность. Нажмите блюдо на рабочей поверхности, чтобы освободить любые пузырьки воздуха с поверхности.
    4. Дега смесь PDMS налил на вафу в течение 10 минут или до тех пор, пока все пузырьки воздуха удаляются или пришли на поверхность PDMS.
    5. Выпекать PDMS при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 2 ч. Дайте остыть до комнатной температуры.
    6. Используя скальпель или фрезу коробки, вырежьте участок PDMS из центра блюда, который содержит геометрические особенности.
    7. Разрежьте PDMS примерно на 10 х 10 мм квадратов, каждый из которых содержит функции для одного экспериментального состояния. В последующих этапах протокола они называются «штампами».
  2. Создание плоских плит PDMS
    1. Смешайте базу PDMS с агентом лечения PDMS в соотношении 8:1, по весу. Приготовьте примерно 20 г для каждой 100-мм тарелки, которая будет использоваться. Тщательно перемешайте.
    2. Дега смесь PDMS в desiccator в течение 30-60 минут или до тех пор, пока все пузырьки воздуха удаляются.
    3. Медленно и равномерно налейте PDMS в чистую 100-мм тарелку. Нажмите блюдо на рабочей поверхности, чтобы освободить любые пузырьки воздуха.
    4. Выпекать PDMS при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 2 ч. Дайте остыть до комнатной температуры.
    5. Удалите PDMS из блюда. Инвертировать так, что поверхность PDMS, который был в контакте с нижней части блюда лицом вверх.
    6. Для каждой марки, генерируемой в шаге 3.1, вырежьте квадрат PDMS 15 x 15 мм. В последующих этапах протокола они называются «плоскими плитами».
  3. Генерация трафаретов
    1. Упорядочить плоские плиты PDMS на крышке 150 мм блюдо, или другой плоской поверхности для облегчения обработки. Обеспечить достаточную интервал между плитами (например, для 150-мм блюда, организовать девять плоских плит с ровным интервалом).
    2. Переворачивать каждую марку, генерируемую в шаге 3.1, на плоскую плиту PDMS, чтобы функции на марке соприкасаются с плоской плитой PDMS. Аккуратно нажмите на верхней части марки с щипками, чтобы обеспечить даже контакт.
    3. Тщательно подпирайте крышку, держа pdMS штамп / плита пары на базе блюда, так что крышка лежит под углом. Это помогает фитиль УФ-излечимых полимеров на следующем шаге.
    4. Поместите небольшую каплю УФ-излечимого полимера в верхний интерфейс каждой пары штампа/плиты. Полимер будет нечестивым между ними поверхностным натяжением, с помощью гравитации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе могут работать различные УФ-излечивые полимеры. Мы выбрали Norland Optical Adhesive 74 для следующих свойств: i) Быстрое лечение при воздействии УФ-излучения, ii) Легкое удаление от штампов PDMS при лечении, iii) Крепление к стеклянным крышкам с ручным давлением.
    5. После того, как полимер был полностью злой через, поместите крышку с печатью / плиты пары плоские на рабочей поверхности. Поместите небольшую каплю УФ-излечимого полимера на каждой из оставшихся трех сторон интерфейса марки/плиты.
    6. Используя наконечник пипетки в 200 л, соедините капли полимера по краям интерфейса штампа/плиты. Это создает границу, которая будет держать лиганд решение в шаге 4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при работе полимера по краям марки. Если интерфейс штампа/плиты нарушен, полимер будет фитиль под функциями и трафарет не будет формироваться должным образом.
    7. Аккуратно поместите пары штампа/плиты в уф-стерилизацию. Используйте стерильную настройку питания "Str" и разоблачай в течение 10 мин.
    8. Удалите пары штампа/слябиизм из окна УФ-стерилизации. Используя две пары щипцы, осторожно удалите штамп PDMS, удерживая плоскую плиту и трафарет, который образовался из УФ-излечимого полимера.
    9. Используя щипцы, тщательно удалите трафарет и инвертируйте его таким образом, чтобы поверхность, которая была в контакте с плоской плитой PDMS, обращена вверх.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трафареты деликатны. Будьте осторожны при передаче их, особенно при первоначальном удалении их из PDMS, так что они не рвутся.
    10. Поместите перевернутые трафареты обратно в УФ-стерилизации поле. Используйте стерильную настройку питания "Str" и выставляй в течение 3 мин.

4. Узоринг ECM лиганд на крышках

  1. Нажатие трафаретов на кислотно-промытые крышки
    1. Поместите один кислотно-промытый крышкой для каждого трафарета на чистый кусок лабораторной пленки.
    2. Используя щипцы, аккуратно поместите каждый трафарет, плоский вниз, на кислотно-промытый coverslip. Разместите такие, что объекты сосредоточены на крышке.
    3. Поместите небольшой кусок лабораторной пленки поверх каждого трафарета. Твердо и равномерно нажмите на трафарет, чтобы создать сильный контакт между трафаретом и крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг! Нажмите твердо и по всей поверхности трафарета. Если не будет создан достаточный контакт, лигандное решение протечет между трафаретом и крышками, и узор не утихнет. ФАКЦИОН: Чтобы подтвердить достаточный контакт между трафаретом и крышкой, пипетка 100 л ультрачистой стерильной воды на поверхность каждого трафарета и инкубировать при комнатной температуре. После 1 ч, проверьте на утечку. Аспирируй воду из успешно связанных трафаретов и продолжить.
  2. Плазменная очистка поверхности трафаретных крышкдляв для повышения гидрофилики
    1. Поместите крышки с трафаретами в плазменный очиститель. Нанесите плазму высокой мощности на 30 с.
  3. Приготовление раствора ECM ligand
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги должны быть завершены в стерильных условиях, если это возможно.
    1. Поместите стерильные 100 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, pH 8.0 раствор на льду. После ледяного холода добавьте матригель и коллаген для достижения концентраций 225 мкг/мл и 25 мкг/мл, соответственно. ФАКЦИОН: Для устранения неполадок или для визуализации лиганда, включите флуоресцентно помеченный лиганд в растворе лиганда.
      1. ПРИМЕЧАНИЕ: Различные лиганды ECM могут быть использованы с этим методом. Для различных лигандов может потребоваться дополнительная оптимизация для определения идеальной концентрации, времени инкубации и температуры инкубации. Дополнительную информацию можно узнать в разделе обсуждения.
    2. Пипетка лигандовый раствор на поверхность каждого трафарета. Для трафаретов, изготовленных из 10 х 10 мм квадратных марок, нанесите 100 л л на трафарет.
    3. Проверьте наличие пузырьков воздуха в функциях трафарета. При необходимости используйте пузыри с тонкими наконечниками или наконечником пипетки в размере 2 л, чтобы удалить пузырьки воздуха с функций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг! Если пузырьки воздуха остаются в ловушке на поверхности крышки, лиганд не будет адсорбировать на поверхность и в результате картина будет неполным.
    4. Поместите трафаретные крышки с лигандой в блюдо, оберните лабораторной пленкой и инкубировать при 4 градусах Цельсия на ночь.

5. Передача лиганда в полиакриламидный гель

  1. Удаление раствора лиганда и трафарета с каждого покрытия
    1. Примачить раствор лиганда с поверхности трафарета. Раствор Ligand можно собирать и хранить при 4 градусах Цельсия и повторно использовать в течение месяца.
    2. Используя щипцы, кратко погрузите крышку с трафаретом в тарелку содержащую стерильную PBS для мытья.
    3. Кратко погрузите крышку с трафаретом во второе блюдо стерильной PBS для мытья.
    4. Снимите трафарет с поверхности крышки. Будьте осторожны, чтобы не сломать крышку.
    5. Кратко погрузите покрывало в блюдо, содержащее ультрачистую стерильную воду, чтобы удалить соли из смывает PBS. Нажмите на край coverslip к деликатной задаче протрите фитиль от лишней воды.
    6. Высушите крышку под инертным газом, таким как азот. Отметьте нижней части coverslip, чтобы отслеживать ориентацию с этого момента вперед. Будьте осторожны, чтобы держать узорчатую сторону вверх.
    7. Повторите шаги 5.1.1 до 5.1.6 для каждого трафаретного coverslip.
  2. Изготовление гидрогелей полиакриламидов с узорчатыми крышками
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к предыдущим методам для дополнительных деталей7,9 Стерилизовать все крышки держатели, трубки и прокладки, используемые для полиакриламидных гелей путем мытья с 10% отбеливателя на ночь, промывка водой по крайней мере пять раз, чтобы удалить отбеливатель, и мытье кратко в 70% этанола. Поместите все части на деликатные салфетки задачи в стерильных биобезопасности шкаф высохнуть перед использованием.
    1. Подготовка полиакриламидного раствора для получения желаемой упругости гидрогеля(таблица 2). Смешайте все компоненты, кроме флуоресцентных микросфер и перульфата калия (PPS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 1% раствор персульфата калия свежий каждый раз.
    2. Дега раствор полиакриламид, микросферы и PPS в отдельных трубах под вакуумом в течение 30 минут.
    3. Для каждого узорчатого обкрытия, подготовить глютаральдегидактивированный активированный "нижний" coverslip с прокладкой (18 мм внешнего диаметра, 14 мм внутреннего диаметра), размещенных на вершине.
    4. После дегазации кратко снотворно езтье микросферы и добавить соответствующий объем в раствор полиакриламид. Смешайте путем pipetting вверх и вниз, стараясь не ввести пузырьки воздуха. Кратко sonicate.
    5. Добавьте соответствующий объем PPS в раствор полиакриламид. Пипетка вверх и вниз, чтобы смешать раствор, стараясь не вводить пузырьки воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления PPS, работать быстро, чтобы завершить шаги 5.2.6 до 5.2.11 до полимеризации полимеризации полимеризации полимеризации.
    6. Пипетка 75-150 л (в зависимости от толщины прокладки) к центру каждого гюмтараальдегида активированного coverslip.
    7. Используя щипцы, поместите узорчатый покрывало на каждый глютаральдегид-активированный покрывало с полиакриламидом и прокладкой, так что узорчатый лиганд сталкивается с раствором полиакриламид. Если будет добавлендостаточный раствор полиакриламид, поверхностное натяжение будет цифировать полиакриламид между двумя крышками и никаких пузырьков воздуха не будет.
    8. Возьмите каждый полиакриламид "сэндвич" и осторожно прикоснуться к стороне деликатной задачей протрите фитиль от избыточного раствора полиакриламид.
    9. Аккуратно поместите каждый полиакриламид "сэндвич" в крышку держателя с нитями, которые совместимы с 15 мл конической нижней трубки. Ориентация должна быть такой, чтобы нижняя часть крышки глютаральдегида соприкасалась с нижней частью крышки держателя, а узорчатый обкрытие находится сверху.
    10. Винт 15 мл конической нижней трубки в каждый держатель крышки провести полиакриламид "сэндвичи" на месте. Трубки должны быть плотными, чтобы предотвратить утечку, но будьте осторожны, чтобы не затягивать и трещины крышки.
    11. Центрифуги полиакриламид "сэндвичи" в трубах в качели-ведра на 200 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалите трубки из центрифуги и поместите в трубку стойки для поддержания ориентации в течение дополнительных 50 минут, чтобы обеспечить полимеризацию. Держите покрыты фольгой, чтобы предотвратить отбеливание флуоресцентных микросфер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Центрообразуя критически при использовании этого метода для выполнения TFM. Центробежная сила перемещает все микросферы в одну плоскость, которая в конечном итоге будет находиться чуть ниже поверхности гидрогеля. Это идеально подходит для визуализации микросфер смещения, которые используются для расчета клеточных напряжений тяги. Если не выполнять ТФМ, микросферы могут быть оставлены из раствора полиакриламид и полимеризации может произойти на скамейке без центрифугации.
    12. Удалить полимеризованные полиакриламидные "сэндвичи" из труб и погрузиться в PBS в 100-мм блюдо. Оберните в лабораторную пленку и инкубировать в течение 3 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию.
  3. Подготовка узорчатых гелей для посевных клеток
    1. Используйте скальпель и щипцы, чтобы тщательно удалить узорчатый coverslip и прокладка из полиакриламид "сэндвич", пока он остается погруженным в PBS. Узорчатый лиганд перейдет в полиакриламид во время полимеризации и останется после снятия крышки. Полиакриламид гель будет оставаться прикрепленным к глютаральдегида активированный coverslip.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг! Полиакриламид должен быть погружен в PBS при удалении coverslip или лиганд ы модели будут уничтожены.
    2. Поместите каждый coverslip с узорчатым полиакриламидом в крышку держателя. Поместите прокладку (18 мм внешнего диаметра, 14 мм внутреннего диаметра) на верхней части крышки и вокруг полиакриламид, где был расположен прокладка. Винт распиленный 15 мм конической нижней трубки в крышку держателя, образуя хорошо с узорчатым полиакриламид в нижней части. Эти сборки вписываются в колодцы стандартной 12-хорошей пластины для легкой обработки.
    3. Вымойте каждый гель, добавив 500 л PBS в хорошо сборки. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре с нежной тряской. Удалить PBS и повторить дважды в общей сложности три стирания.
    4. После окончательного мытья PBS, добавьте 500 qL средств knockout-DMEM к гелям и инкубировать на 37 qS на ночь. Гели могут храниться при 37 градусах Цельсия со средствами массовой информации в течение 5 дней до посева клеток.
    5. За день до посева клетки, заменить нокаут-DMEM для полного KSR средств массовой информации и инкубировать на 37 градусов по Цельсию в одночасье.

6. Культивирование hESCs на узорчатых гелях

ПРИМЕЧАНИЕ: Если планируете исправить образцы для иммуно-пятна после TFM, принимать изображения неподчеркнутых состояний микросферы до посева клеток. В этом случае флуоресцентно помеченный лиганд следует использовать в шаге 4.3.1, чтобы возможные места расположения клеток были известны до того, как посев ные и микросферы можно будет отобразить в этих регионах.

  1. Поддержание запасов hESC культур и вторичных фидер-свободных культур, подготовленных на матригеле покрытием пластин в условных средств КСР до посева на узорчатые гели полиакриламид, как ранее описано9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Создание условных средств KSR путем культивирования облученных эмбриональных фибробластов мыши в средствах кСР, дополненных 4 ng/mL основным фактором роста фибробластов (bFGF). Сбор и замена носителей каждые 24 ч.
  2. Аспирируй средства массовой информации из hESCs. Кратко мыть с нокаутом-DMEM средств массовой информации. Добавьте 0,05% трипсин-ЭДТА, дополненный 10 мкм Y27632 (ингибитор киназы Rho) и инкубировать при 37 градусах По области в течение 5-10 мин.
  3. Добавить средства массовой информации с сывороткой, чтобы ингибировать трипсин. Аккуратно аспирировать средства массовой информации и пипетки над блюдом, чтобы удалить клетки. Продолжить pipetting осторожно, чтобы удалить все клетки и разъединить клеточные кластеры на одиночные ячейки.
  4. Соберите суспензию и центрифугу при 200 х г в течение 3 мин.
  5. Приспособите супернатант и resuspend гранулы в эквивалентном объеме ksR средств для мытья. Центрифуга при 200 х г в течение 3 мин.
  6. Приготовьте супернатант и resuspend гранулы в условных средств кср дополнены 10 нг /мл bFGF и 10 мкм Y27632.
  7. Подсчитайте клетки гемоситометром и отрегулируйте суспензию клетки до концентрации 300 000 клеток на мл. Пипетка 500 л клеточной подвески на каждый узорчатый гель (150 000 клеток на гель).
  8. 3 ч после посева, используйте пипетку, чтобы тщательно аспирировать средства массовой информации от каждого геля и заменить свежими условными средствами КСР дополнены 10 нг/мл bFGF и 10 мкм Y27632. Это удаляет избыточные клетки, которые не придерживались узорчатых областей полиакриламид.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг! На этом этапе клетки будут слабо прилипать к узорчатому лиганду. Будьте очень осторожны при замене носителей, чтобы не отсоединить клетки. В последующих шагах следует соблюдать равную осторожность при каждом из обменов средств массовой информации.
  9. 24 ч после посева, используйте пипетку, чтобы тщательно аспирировать средства массовой информации и обмена на условные средства консилиум кСР дополнены 10 нг/мл bFGF и 5 мКМ Y27632.
  10. 48 ч после посева, используйте пипетку, чтобы тщательно аспирировать средства массовой информации и обмена на условные средства консилиумдов дополните 10 нг/мл bFGF. Это удаляет ингибитор Род киназы из средств массовой информации и эксперименты могут начаться на следующий день, 72 ч после посева.

7. Выполнение TFM

  1. При желании выполните TFM, как ранее описано9 при желаемых экспериментальных условиях.
  2. Если неподчеркнутые позиции микросферы были изображены перед посевными клетками, зафиксировать клетки после того, как они занимают подчеркнутое положение микросферы, и выполните иммуностоинг для определения локализации белков, представляющих интерес по отношению к регионам с высокими и низкими тяговыми силами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основная задача, которую необходимо преодолеть при попытке культуры HESC в колониях контролируемой геометрии на совместимых субстратах, заключается в выработке однородной модели ECM-лигана на поверхности субстрата. Стратегия, представленная в этом методе включает в себя сначала генерации желаемого шаблона на поверхности стеклянного coverslip, а затем впоследствии переноса этого шаблона на поверхность полиакриламид гидрогеля во время полимеризации геля (Рисунок 1

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для упрощения длинного и детального протокола этот метод состоит из трех критических стадий: 1) генерации моделей ECM ligand на стеклянных крышках, 2) переноса узоров на гидрогели полиакриламидов во время полимеризации геля и 3) посевных ГЭС на узорчатый гидрогель. Есть критические шаги, которые должны быть рассмотрены на каждом из этих трех этапов. Для того, чтобы создать высокой точностью моделей на стеклянные крышки, трафарет должен быть твердо нажата на крышку, чтобы предотвратить утечку раствора лиганда и все пузырь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы отметить финансирование из гранта CIRM RB5-07409. JMM хотел бы поблагодарить FuiBoon Кай, Dhruv Thakar, и Роджер Ория для различных дискуссий, которые руководствовались генерации и устранения неполадок этого метода. JMM также благодарит UCSF Discovery Стипендию за постоянную поддержку его работы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% трипсинGibco25300054
100 мм стеклянная чашка ПетриFisher Scientific08-747B
100 мм пластиковая чашка ПетриFisher ScientificFB0875712
15 мл трубки с коническим дномCorning352095
150 мм пластиковая чашка ПетриFisher ScientificFB0875714
18 мм диаметр #1 покровные стеклаThermo Scientific18CIR-1
2% бисакриламидBio-Rad161-0142
3-аминопропилтриметоксисиланACROS Organics313251000
40% акриламидBio-Rad161-0140
Алюминиевая фольгаFisher Scientific01-213-100
Основной фактор роста фибробластовSigma-AldrichF0291
ОтбеливательCloroxN/A
Центрифуга с качающимися ведрамиEppendorf22623508Модель: 5804 R
КоллагенCorning354236
DessicatorFisher Scientific08-642-7
ЭтанолFisher ScientificAC615095000
плода бычья сывороткаGibco16000044
флуоресцентные микросферыThermo ScientificF8821
Щипцы (для покровных стекол)Fisher Scientific16-100-122
Щипцы (для пластин)Fisher Scientific17-467-328
Держатели для геляН/Д Н/ДДержатели геля изготовлены на заказ на 3D-печать, чертеж САПР доступен по запросу
Глутаровый альдегидFisher Scientific50-261-94
HEPESThermo ScientificJ16926A1
Горячая пластинаFisher ScientificHP88854100
Соляная кислотаFisherScientific A144S-500
Изопропиловый спиртFisherScientific A416-500
Kimwipes (деликатные рабочие салфетки)Kimberly-Clark Professional34120
Замена сыворотки KnockoutGibco10828028
Knockout-DMEMGibco10829018
Выравниватель маски (для фотолитографии)Karl Suss America, Inc.Karl Suss MJB3 Выравниватель
MatrigelCorning354277
Микроскоп для измерения силы тягиNikonN/AМодель: Eclipse TE200 U
Моторизованный позиционный столикPrior ScientificN/AМодель: HLD117
Газообразный азотAirgasNI 250
Norland оптический клей 74 (полимер, отверждаемый ультрафиолетовым излучением)Norland ПродукцияNOA 74
ПечьThermo ScientificPR305225G
Парапленка (лабораторная пленка)Fisher Scientific13-374-12
PDMS (Sylgard 184)Fisher ScientificNC9285739
ФотошаблонCAD/Art Services, Inc.Н/ДФотошаблоны изготавливаются на заказ. CAD чертеж для наших проектов доступен по запросу
Плазменный очистительFisher ScientificNC9332171
Пластик для прокладкиMarian ChicagoHT6135
Пластик для дистанционной рамкиTAP ПластикN/AПоликарбонатный лист, толщина 0,01 дюйма
Хлорид калия (для изготовления PBS)Fisher ScientificP217-500
Фосфат калия одноосновной (для изготовления PBS)Fisher ScientificP285-500
Персульфат поттассияACROS Organics424185000
СкальпельFisher Scientific14-840-00
Кремниевая пластинаЭлектронная микроскопия Sciences71893-06Тип P, 3 дюйма, кремниевые пластины
Хлорид натрия (для изготовления PBS)Fisher ScientificS271-1
Гидроксид натрияFisherScientific S318-100
Дигидрат диосновного фосфата натрия (для изготовления PBS)FisherScientific S472-500
SU8-3050 ФоторезистMicroChemSU8-3000
SU8-проявительMicroChemY020100
TEMEDBio-Rad161-0800
УФ-стерилизационный боксBio-RadN/ABio-Rad GS Gene Linker УФ-камера
Y27632 (ингибитор рокиназы)StemCell Technologies72304
маски

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  2. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
  4. Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001(2017).
  5. Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
  6. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
  7. Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mace, K., Braun, K. 916, Humana Press. Totowa, NJ. 317-350 (2012).
  8. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
  9. Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
  10. Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
  11. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
  12. Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
  13. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
  14. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  15. Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
  16. Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Human Embryonic Stem CellsPolyacrylamide HydrogelsTraction Force MicroscopyColony Geometry ControlCompliant SubstratesExtracellular Matrix PatterningPDMS Stencil FabricationFluorescent Ligand TransferCell Fate SpecificationMechanical Cues Analysis

Похожие статьи