Method Article

Одновременное циклометрическое использование потока нескольких типов клеток, извлеченных из мозга мыши / спинного мозга с помощью различных методов гомогенизации

DOI:

10.3791/60335

⸱

November 19th, 2019

 ,  ,  , 
1Dana-Farber/Boston Children's Cancer and Blood Disorders Center, 2Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем метод цитометрии потока для идентификации одновременно различных типов клеток, извлеченных из мозга мыши или спинного мозга. Этот метод может быть использован для изоляции или характеристики чистых популяций клеток при нейродегенеративных заболеваниях или для количественной оценки степени ориентации клеток на in vivo вирусных векторов или наночастиц.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавние достижения в области вирусного вектора и наноматериальных наук открыли путь для новых передовых подходов к исследованию или манипулированию центральной нервной системой (ЦНС). Однако дальнейшая оптимизация этих технологий будет способствовать методам, позволяющим быстро и упорядочить определение степени ЦНС и клеточного таргетинга при приеме вирусных векторов или наночастиц в организме. Здесь мы представляем протокол, который использует высокую пропускную способность и мультиплексирование возможности цитометрии потока, чтобы позволить простой количественной оценки различных подтипов клеток, изолированных от мозга мыши или спинного мозга, а именно микроглии / макрофагов, лимфоцитов, астроцитов, олигодендроцитов, нейронов и эндотелиальных клеток. Мы применяем этот подход, чтобы подчеркнуть критические различия между двумя методами гомогенизации тканей с точки зрения урожайности клеток, жизнеспособности и состава. Это может поручить пользователю выбрать лучший метод в зависимости от типа ячейки (ы) интереса и конкретного приложения. Этот метод не подходит для анализа анатомического распределения, так как ткань гомогенизирована для создания одноклеточной суспензии. Тем не менее, это позволяет работать с жизнеспособными клетками и может быть объединена с клеточной сортировкой, открывая путь для нескольких приложений, которые могли бы расширить репертуар инструментов в руках нейробиолога, начиная от создания первичных культур, полученных из чистоклеточных популяций, до анализа генной экспрессии и биохимических или функциональных анализов на четко определенных подтипах клеток в контексте нейрогенеративных заболеваний, на фармакологическом лечении или генной терапии.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Технологии доставки генов и лекарств (таких как вирусные векторы и наночастицы) стали мощным инструментом, который может быть применен, чтобы получить лучшее представление о конкретных молекулярных путей, измененных в нейродегенеративных заболеваний и для развития инновационных терапевтических подходов1,2,3. Оптимизация этих инструментов основывается на количественной оценке: (1) степень проникновения в ЦНС на различных путях управления и (2) ориентации на конкретные популяции ячеек. Гистологические анализы обычно применяются для визуализации флуоресцентных генов репортера ил....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Института рака Даны Фарбер (протокол No 16-024).

1. Подготовка решений, необходимых для эксперимента

  1. Приготовьте сбалансированный солевой раствор 1x Hank (HBSS), разбавив 10x HBSS стерильной водой. Предварительно охладите раствор на льду. Для каждого образца требуется не менее 25 мл раствора.
  2. Подготовка изотонического решения Percoll (IPS) путем смешивания 10x стерильных HBSS 1:10 со средой градиента плотности (т.е. Percoll). Предварительно охладить на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: IPS может храниться до 30 дней при 4 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы сравнили два различных метода гомогенизации (DH против PD), применяемых к мозгу мыши и спинному мозгу, чтобы проверить эффективность в извлечении различных жизнеспособных типов клеток, пригодных для применения ниже по течению. Для этого мы использовали 9-цветную цитометрию потока панели, предназначенные для характеристики, в том же образце, различные типы клеток ЦНС, включая микроглии, лимфоциты, нейроны, астроциты, олигодендроциты и эндотелий.

Ткани мозга и спинного мозга были извлечены из.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом мы описываем протокол для совместного очищения и одновременного цитометрического анализа потока некоторых из наиболее релевантных клеток ЦНС из мозга мыши и спинного мозга. Традиционно, гистологические анализы были применены для описания распределения наночастиц или трансдукционной эффективности вирусных векторов в ЦНС5,13, или для получения информации о морфологических и молекулярных изменений, происходящих в конкретных типах клеток во время патологии или.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было профинансировано Бостонской детской больницы стартовых средств для A.B., ALSA грант nr. 17-IIP-343 в М.П., и Управление помощника министра обороны по вопросам здравоохранения через амиотрофический боковой склероз исследовательской программы в соответствии с премией No. W81XWH-17-1-0036 до M.P. Мы признаем DFCI Flow Cytometry Core за техническую поддержку.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10X HBSS (без кальция, хлорида магния и сульфата магния)Gibco14185-052
70 мм Клеточный фильтрCorning431751
ACSA/ACSA2 антитело против мышейMiltenyi Biotec130-117-535APC конъюгированное
бычье сывороточное альбуминSigma AldrichA9647-1KG
CD11b крысиное антителопротив мышейInvitrogen47-0112-82APC-eFluor 780 конъюгированное
CD31 антитело к мышам у крысыBD Bioscience562939BV421 конъюгированное
антитело к мыши к крысе CD45 Biolegend103138Brilliant Violet 510 конъюгированное
CD90.1/Thy1.1 антитело к мышам у крысыBiolegend202518PE/Cy7 конъюгированное
CD90.2/Thy1.2 антитело против мышиу крысыBiolegend1005325PE/Cy7 конъюгированные
конические пробирки (15 мл)CellTreat229411
конические пробирки (50 мл)Набор
Dounce (включает ступку, а также пестики A и B)Sigma-AldrichD9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Блок-антитело к мышамкрысы BD Pharmingen553142
Фетальная бычья сывороткаBenchmark100-106
Набор для диссоциации нервной ткани (P)Miltenyi Biotec130-092-628
O4 против мышей/крыс/человеческих антителMiltenyi Biotec130-095-895Биотин конъюгированный
PercollGE Healthcare10266569продается как нестерильный реактив
PercollSigma65455529стерильный реагент (для использования в приложениях, требующих стерильности)
Percoll PLUSSigmaGE17-5445-01реагент, содержащий очень низкие следы эндотоксина
стрептавидинаInvitrogenS3258Alexa Fluor 680 конъюгированный
измельчителей тканей Dounce 229422

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
  2. Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryCell IsolationTissue HomogenizationMouse BrainSpinal CordCell ViabilityCell YieldEnzymatic DigestionAntibody StainingCell Sorting

Related Articles