Method Article

Производство, кристаллизация и структурное определение мкножеского домена NEMO, имеющего обязательную силу IKK

DOI:

10.3791/60339

⸱

December 28th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Dartmouth College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем протоколы для определения структуры IKK-обязательной области NEMO с помощью рентгеновской кристаллографии. Методы включают экспрессию белка, очищение и характеристику, а также стратегии успешной оптимизации кристалла и определения структуры белка в его несвязанной форме.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NEMO – это белок, который играет важную роль на пути NF-ЗБ, собирая IKK-комплекс с киназами IKK и IKK. После активации комплекс IKK фосфорилатирует молекулы I'B, ведущие к ядерной транслокации NF-'B и активации генов-мишеней. Ингибирование взаимодействия NEMO/IKK является привлекательной терапевтической парадигмой для модуляции активности пути NF-ЗВ, что делает NEMO мишенью для проектирования и открытия ингибиторов. Чтобы облегчить процесс обнаружения и оптимизации ингибиторов NEMO, мы разработали улучшенную конструкцию связывающей области NEMO, которая позволила бы определить структуру белка в форме апо и при этом привязанных к небольшим молекулярным ингибитогам веса. Здесь мы представляем стратегию, используемую для проектирования, выражения и структурной характеристики мкноэ, имеющей обязательную область NEMO. Белок выражается в клетках кишечной палочки, растворяется в условиях денатурирования и очищается через три хроматографических шага. Мы обсуждаем протоколы получения кристаллов для определения структуры и описываем стратегии сбора и анализа данных. Протоколы найдут широкое применимость к структурному определению комплексов ИНГибиторов NEMO и малых молекул.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Путь НФ-ЗБ активируется в ответ на различные стимулы, включая цитокины, микробные продукты и стресс, для регулирования экспрессии генов-мишеней, ответственных за воспалительный и иммунный ответ, гибель клеток или выживание и пролиферацию1. Патологии, включая воспалительные и аутоиммунные заболевания и рак2,3,4,5 были коррелированы с гиперактивацией пути, что сделало модуляцию деятельности NF-QB основной мишенью для разработки новых методов лечения6,7.

Канонический путь NF-QB, в частности, отличается от неканонического пути, ответственного за лимфорганогенез и активацию В-клеток, зависимостью первого от леса белка NEMO (NF-QB основной модулятор8) для сборки IKK-комплекса с кининами IKK и IKK. Комплекс IKK отвечает за фосфорилирование ИЗБЗ (ингибитор ЗВ), который нацелен на деградацию, освобождая димеры NF-qB для перемещения в ядро для транскрипциигенов 1 ЗЗ и, следовательно, является привлекательной мишенью для развития ингибиторов для модулирования активности NF-B.

Наше исследование фокусируется на характеристике белково-белкового взаимодействия между NEMO и IKK, ориентированной на NEMO для разработки малых молекул ингибиторов формирования комплекса IKK. Минимальная связывающая область NEMO, необходимая для связывания ИККЗ, включает в себя остатки 44-111, и его структура была определена в комплексе с пептидом, соответствующим последовательности IKK 701-7459. NEMO и IKK' образуют четырехсепарок, где NEMO dimer вмещает два сипов IKK (701-745) в удлиненный открытый паз с расширенным интерфейсом взаимодействия. IkK (734-742), также известный как NEMO-обязательный домен (NBD), определяет наиболее важную горячую точку для связывания, где два основных триптофанов (739 741) хоронят глубоко в кармане NEMO. Детали сложной структуры могут помочь в структуре на основе проектирования и оптимизации малых ингибиторов молекулы ориентации NEMO. В то же время, трудно, что связывание небольшой молекулы или пептида воссоздало бы в NEMO полное конформивное изменение (т.е. обширное открытие dimer с коритой сутышки NEMO), вызванное связыванием длинной IKK (701-745), как наблюдается в кристалле, и структура несвязанной NEMO или NEMO, связанной с небольшим ингибитором молекулы, может представлять собой лучшую структуру ингибирования.

Полноформатные NEMO и более мелкие конструкции усечения, охватывающие область IKK-связывания, оказались неразрешимыми для определения структуры в несвязанной форме с помощью рентгеновской кристаллографии и методов ядерного магнитного резонанса (ЯМР)10, что побудило нас разработать улучшенную версию обязательной области NEMO. Действительно, NEMO (44-111) в несвязанной форме лишь частично сложен и претерпевает конформационный обмен, и поэтому мы намерены стабилизировать его димерную структуру, складку свернутой катушки и стабильность, сохраняя при этом связывающее сродство к IkK. Путем связывать 3 heptads идеально dimeric coiled-coil последовательностей11 на N-и C-termini протеина, и серии 4 перегласовок пункта, мы произвели NEMO-EEAA, конструкцию полно dimeric и сложенную в свернутой катушке, которая спасла IKK-связывающе сродство к наномолярному диапазону как наблюдаемое для полной длины NEMO12. В качестве дополнительного преимущества мы надеялись, что адаптеры с кудрявых катушек (на основе последовательности GCN4) облегчат кристаллизацию и в конечном итоге помогут в определении структуры рентгеновского излучения с помощью молекулярной замены. Сонючие катушка адаптеры были аналогичным образом использованы как для повышения стабильности, улучшить поведение решения и облегчить кристаллизацию для тримерных скудных катушек и фрагментов антител13,14. NEMO-EEAA легко выражается и очищается от клеток Escherichia. coli с размытым тегом гистидина, растворяется, сложен в стабильную тусклую свернутую катушки и легко кристаллизуется, с дифракцией до 1,9 евро. Наличие упорядоченных спиральных катушек регионов GCN4 может дополнительно помочь в постепенном использовании данных из кристаллов NEMO-EEAA путем молекулярной замены с использованием известной структуры GCN415.

Учитывая результаты, полученные с apo-NEMO-EEAA, мы считаем, что описанные здесь протоколы также могут быть применены к кристаллизации NEMO-EEAA в присутствии небольших пептидов (например, пептида NBD) или малых ингибиторов молекулы, с целью понимания требований к ингибированию NEMO и структурной оптимизации первоначальных ингибиторов свинца к высокой сродости. Учитывая пластичность и динамичный характер многих доменов скудной катушки16,использование смоченной катушки адаптеры могли бы найти более общую применимость в оказании помощи структурного определения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Конструкция конструкции для кристаллографии

  1. Клон последовательность NEMO-EEAA, как и в предыдущей публикации12 в векторе для выражения в кишечной палочке с помощью промоутера T7, в том числе N-терминал hexa-гистидин теги и протеазы расщепления сайта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы использовали вектор, измененный, чтобы включить тег гекса-гекса-гистидина N исайтрасщепления табачного etch (TEV). Этот вектор облегчает расщепление его тега для кристаллизации белка и оставляет только короткое расширение остатков GSW до начала желаемой последовательности белка. Вектор, из которого это было получено, и альтернативные векторы перечислены в таблице материалов. В этом протоколе, последующие изменения в оригинальной последовательности NEMO (44-111) были введены поэтапно, как описано ранее10, с использованием стороны направлены мутагенеза. Сначала мы попытались стабилизировать NEMO смозавка катушки димер, подостройяя идеальные скручиваемые адаптеры (длиной не менее трех гептов) к N-терминалу или C-терминалу или к обоим. Двойная скручиваемая катушка была наиболее перспективной из предыдущих испытаний кристаллизации, и впоследствии она была изменена введения мутаций для улучшения кристаллизации, как описано ранее12.

2. Крупномасштабное выражение его6 помеченных NEMO-EEAA

  1. Преобразование конструкции в компетентные ячейки BL21 (DE3). Хранить при -80 градусов по Цельсию в виде клеточного глицерола.
  2. День 1 - Подготовка клеток стартера культуры. В колбу Erlenmeyer 125 мл добавьте 20 мл раствора Terrific Broth и 20 л 100 мг/мл бульона ампициллина. Добавьте несколько микролитров клеточного глицерола (от -80 градусов по Цельсию хранения BL21 (DE3) компетентных клеток, преобразованных с переносчиком).
  3. Встряхните 10 мл стартовой культуры на ночь при 37 градусах по Цельсию, 220 об/мин (примерно 15 л).
  4. День 2 - От стартера, разбавить до OD600 и 0,1 в 250 мл Потрясающий бульон. Добавьте ампициллин к конечной концентрации 100 мкг/мл. Вырастидо доOD 600 и 0,8-1,0.
    1. Добавьте изопропил-Д-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до 500 мкм и вырастем на 4 ч при 37 градусах Цельсия.
    2. Измерьте OD600 индуцированной культуры после 4 h. Культура должна достигнуть OD600 и 6-10.

3. Очистка его6 помечены NEMO-EEAA

  1. Культура спиновых клеток снизилась на 3800 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия.
  2. Сохранить клетку гранулы и отбросить среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пеллеты клетки могут быть сохранены и сохранены при -20 градусов по Цельсию в этой точке, для очистки на более позднем времени.
  3. Resuspend клетки в 40 мл лисис буфера, содержащего 20 мм Трис, 150 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 2 мМ MgCl2, 0,5 мм фенилметилфолфонил фторид, 2 мМ Дитиотрейтол (DTT), и 3 QL бензоназа Нуклизе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Никель обездвиженной металлической ионной сродства хроматографии (IMAC) колонка используется совместима с 2 мМ DTT. Кроме того, можно использовать 0,2 мМ три (2-карбоксетил) фосфин (TCEP).
  4. Разделите повторно еле-клетки на две аликоты 20-25 мл.
  5. Лысы клетки с помощью французского пресса (приблизительное давление 25000 пси), повторяя 2-3 раза для каждого aliquot (в холодной комнате).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, клетки могут быть лиизированы с помощью звуковой (не проверены в этом протоколе).
  6. Добавить мочевину в клеточный лизат до конечной концентрации 8 М, дайте инкубировать на качалке платформы как минимум 2 ч или до ночи. Это и все последующие шаги очистки, за исключением диализа, могут быть выполнены при комнатной температуре.
  7. День 3 - Передача лизата в ультрацентрифуговых труби и баланс веса, обеспечивая лисат заполняет трубки, по крайней мере 3 / 4 полной. Спин лизат на 125000 х г в течение 45 мин при 25 градусах Цельсия. Декант супернатант в стакан 100 мл для погрузки на колонну.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугия при 4 градусах Цельсия приведет к вылету мочевины.
  8. В быстрожидкой системе хроматографии удалите этанол из колонки IMAC 5 мл с 25 мл ультрачистого H2O при 5 мл/мин, затем 25 мл элюционного буфера, содержащего 20 мм Трис, 150 мм NaCl, 500 мМ имидазол, 2 мМ DTT, pH 8.0, затем 25 мл связывающего буфера, содержащего 20 мм Tris, 150 мМ NaCl, 10 мм имидазола, 2 мМ DTT, 8 М.
  9. Нагрузка мочевины инкубируется супернатант на 3 мл / мин на iMAC колонки, собирая поток через. Вымойте столбец для 10 объемов столбцов с связывающим буфером на 3 мл/мин.
  10. Сворачивайте конструкцию NEMO-EEAA на колонне, промыв колонной с складывающимся буфером на 20 столбцов на 3 мл/мин, содержащий 20 мм, 150 мм NaCl, 10 мм имидазола, 2 мМ DTT, pH 8.0.
  11. Выполните градиентный выращение NEMO-EEAA, от 10 до 500 мМ Имидазол атакжем 12-колонного объема градиента, собирая все eluate в пластине сбора фракций (1 мл фракций).
  12. Продолжить elution на 500 мМ имидазола для двух объемов колонны, продолжая собирать.
  13. Запуск натрия додецил сульфат (SDS) - полиакриламид гель электрофорес (PAGE) фракций для определения NEMO- EEAA присутствие в elution фракций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали 10% акриламид, буфер МЧС.
  14. Фракции пула, содержащие чистый целевой белок.
  15. Измерение концентрации белка Брэдфорд анализ17.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо для оценки количества протеазы для расщепления тегов.

4. Его6 тегов декольте и очищение

  1. Добавить TEV в 1:10 соотношение веса tEV: NEMO-EEAA белка расщеплять его6 тега. Протеаза TEV была очищена в доме.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте количество TEV, время и температуру, необходимые для полного расщепления отдельно.
    1. Экспресс TEV протеазы, S219V мутант18 в BL21 (DE3)-RIL клеток и очистить, как описано ранее19. Кратко вырастите клетки, как описано в шаге 2, lyse французской прессой и очистите с помощью колонки IMAC. Храните окончательный белок в буфере фосфата натрия 25 мМ, рН 7,8, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 2 мМ DTT, 20% v/v глицерол.
  2. Диализ образца на ночь (примерно 15 ч) в 4 L из 20 мм Tris, 150 мМ NaCl, 2 мМ DTT, pH 8.0, чтобы обеспечить расщепление и удалить избыток имидазола из образца для последующего очищения.
  3. День 4 - Удалите образец из диализа. Запустите гель SDS-PAGE образца из расщепления TEV, чтобы обеспечить завершение расщепления.
  4. В быстрожидкой системе хроматографии удалите этанол из колонки IMAC 5 мл с 25 мл ультрачистого H2O при 5 мл/мин, затем 25 мл элюционного буфера, содержащего 20 мм Трис, 150 мм NaCl, 500 мМ имидазол, 2 мМ DTT, pH 8.0, затем связывающий буфер, содержащий 20 мм Tris, 150 мм NaCl, 10 мм имидазол, 2 мМ DTT, pH 8.0.
  5. Загрузите колонну на 1 мл/мин с TEV-расщепляется NEMO-EEAA. Расщепляется NEMO-EEAA будет щелкать в потоке через: собирать в 96 хорошо фракции сбора пластины (1 мл фракций). Вымойте колонну на пять колонн объемов 20 мм Tris, 150 мМ NaCl, 10 мМ имидазола на 1 мл/мин, продолжая собирать в фракционную пластину сбора.
  6. Elute TEV и дядя его6-NEMO-EEAA с тремя объемами колонны 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 500 мМ имидазол, 2 мМ DTT, рН 8.0, собирая elution в колбе 50 мл.
  7. Выполнить SDS-PAGE гель потока через фракции, чтобы определить наличие расщепляется NEMO-EEAA.
  8. Пул поток через фракции, содержащие расщепляется NEMO-EEAA построить, и сосредоточиться с помощью перемешивают ячейки концентратор до 5 мл. Мембрана молекулярного отсечения веса (MWCO) 3 kDa.
  9. Используя мембрану 3 kDa MWCO, диализ концентрированный образец в 2 L из 20 мМ Tris, 100 мМ NaCl, 2 мМ DTT, pH 8.0 для 2 ч. Изменение буфера диализа до 2 л свежего диализа буфера для ночного диализа (примерно 15 л), при 4 градусах По с.
  10. День 5 - Нагрузка 5 мл диализированного образца на размер исключения хроматографии (SEC) 16 мм х 60 см колонки (34 мкм средний размер частицы) на 1 мл/мин в 2 мм ММ Трис, 100 мм NaCl, 2 мМ DTT, pH 8.0. Повторите с дополнительными столбцов в зависимости от объема образца.
  11. Объедините фракции, соответствующие димерической NEMO-EEAA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: NEMO-EEAA elutes между 60-65 мл, что соответствует больше молекулярного белка веса, из-за удлиненного характера димерической скудной катушки.
  12. Концентрируйтесь с помощью концентратора с перемешивания и мембраны MWCO 3 kDa до конечной концентрации 113 мкм (1,65 мг/мл).
  13. Aliquot белка и хранить при 4 градусах Цельсия (стабильный в течение 1 месяца).

5. Скрининг матрицы Sparse

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол выполняет испытания кристаллизации с использованием коммерчески доступных экранов и настройки сидящих экспериментов капли с помощью робота кристаллизации. Кристаллические изображения собираются автоматически изображением.

  1. Используя коммерчески доступные редкие матричные экраны (см. Таблицу Материалов),пипетку 60 л разреженной матричного раствора в каждую из 96 скважин 2 капли камеры кристаллизации пластины для диффузии сижу капли пара (решение резервуара).
  2. Используя роботизированный сеттер капли, распределите 100 нл белкового раствора при 1,65 мг/мл в соотношении 1:1 с раствором резервуара в падении 1 для конечного объема 200 нл; затем 66 нл белкового раствора с 134 нл раствора резервуара для окончательного объема 200 нл в падении 2 (1:2 соотношение).
  3. Печать пластины с помощью 3-дюймовый шириной уплотнения ленты сразу после дозирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Капли высохнут, если их оставят под воздействием атмосферы дольше 2-3 мин.
  4. Храните лотки в хранилище кристаллизации изображений, при 20 градусах Цельсия, проверяя изображения, собранные автоматически на наличие кристалла, начиная через два дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверка кристаллизации проходила параллельно с оптимизацией конструкции. Первоначальные кристаллы образуются в следующих условиях (коммерческие экраны, перечисленные в таблице материалов): а) 0,1 M Tris, pH 8.0, 30% v/v полиэтиленгликоль (PEG) MME 550, 5% поли-з-глутаминовая кислота, 200-400 kDa низкомолекулярного веса полимера (PGA-LM); б) 0,1 м Трис, рН 7,8, 20% ж/ч/ v PEG MME 2k, 5% PGA-LM; в) 0.1 M Tris, рН 7.8, 20% w/v PEG 3350, 5% PGA-LM. Кристаллы спарчатого матричного экрана будут иметь плохую однородность решетчатой; поэтому они будут выглядеть плохо, используя кросс-поляризованные изображения. Используйте УФ-изображения, чтобы убедиться, что кристаллы содержат белок. Следующий шаг генерации семенного запаса необходим для получения окончательных кристаллов качества дифракции.

6. Генерация семенного запаса

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы воспроизводимые получить кристаллы для генерации семян в 0,1 М Трис рН 8,0, 5% PGA-LM, 3,6% ж / V PEG 20k. Тем не менее, кристаллы будут показывать высокую мозаичность и непригодны для сбора данных на данном этапе.

  1. Используя комплект для генерации семян, подготовить семенной запас путем pipetting из всей капли с хрустальным настоящим, и место в 50 злиц раствор ажениса кристаллизации в предусмотренных флакон.
  2. Vortex семенной запас в течение 3 мин, пульсируя 20 с и 10 с.
  3. Серийно разбавлять семенной запас в 1:10 приращений до 1:10,000. Храните все разбавления при 4 градусах Цельсия, для дальнейшего использования.

7. Тонкие экраны

  1. Дизайн тонких экранов, изменяющих условия для Tris, PGA-LM и PEG. Вариная длина PEG для отдельных лотков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тонкий экран, который произвел кристалл, используемый для определения структуры NEMO-EEAA использовали следующие условия: 0.1 M Tris pH 8; PGA-LM варьировался от 8 до 0% в столбцах 1-12. Строки A-H отсеивают различные ПЭГ, при этом концентрации варьируются в столбцах 1-12 следующим образом. О: PEG 200 (0-40% v/v); B: PEG 400 (0-40% v/v); C: PEG MME 500 (0-40% v/v); D: PEG 1000 (0-30% w/v); E: PEG 3350 (0-30% w/v); F: PEG 6k (0-30% w/v); G: PEG 10k (0-20% w/v); H: PEG 20k (0-20% w/v). Кристалл появился в колодце H4 (5,45% ж/v PEG 20k, 5,8% w/v PGA-LM). В этом протоколе, протеиновый кристаллографии экрана строитель жидкости обработчик был использован для создания экранов.
  2. Семжа белковый бульон в соотношении объема 1:25 1:1,000 разбавления семян.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация NEMO-EEAA немного снизится, но кристаллы все равно сформируются.
  3. Повторите шаг 2 с использованием 1:10,000 разбавления семян, то же соотношение 1:25 объема.
  4. Используя капельный сеттер, раздавать 100 нл белкового раствора на 1,65 мг/мл, с 1:1,000 разбавления семенного фонда в соотношении 1:1 с резервуарным раствором в падении 1 для окончательного объема 200 нл. Повторите для падения 2, но с 1:10,000 разбавления семян запасов настоящее время.
  5. Печать пластины с помощью 3-дюймовый шириной уплотнения ленты сразу после дозирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Капли высохнут, если их оставят под воздействием атмосферы дольше 2-3 мин.
  6. Храните лотки в хранилище изображений, при 20 градусах Цельсия, проверяя изображения, собранные через два дня, на наличие кристалла.
  7. Проверьте кристаллы с кросс-поляризатора imager для решетки однородности, чтобы выбрать для отдельных условий, чтобы создать следующие лотки.

8. Генерация кристаллов для сбора данных

  1. Дизайн одного состояния экранов вокруг Tris, PGA-LM, и PEG состояние, которое производится однородные кристаллы, как анализируется кросс-поляризованных изображений, и крупнейших кристаллов возможно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллы из этих условий нерегулярные по форме, в основном прямоугольные тонкие листы. Это ключ, чтобы выбрать условие, где края кристалла четко определены и имеют наибольшую толщину возможно.
  2. Сделайте 20 мл состояния кристаллизации вручную.
  3. Используя многоканальный пипетктор, распределять 60 Л л на хорошо в 2 капли камеры, 96 хорошо кристаллизации пластины для сидения падение диффузии пара.
  4. Подготовка семенного фонда, как описано в шаге 6.2.
  5. Распределите белок, как описано в шаге 6.3.
  6. Печать пластины с помощью 3-дюймовый шириной уплотнения ленты сразу после дозирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Капли высохнут, если их оставят под воздействием атмосферы дольше 2-3 мин.
  7. Храните лотки в изображении на 20 градусов по Цельсию и проверить изображения на наличие кристалла каждый день.
  8. Проверьте кросс-поляризованные изображения кристаллов на наличие единообразия решетки, чтобы выбрать кристаллы для сбора данных.

9. Определение криозащиты

  1. Чтобы протестировать крио-протекторы, создайте биржевые растворы, соответствующие условиям кристаллизации, но содержащие 30%, 20%, 10% и 5% более высокую концентрацию каждого компонента. Добавление криозащитного тома приведет к окончательной концентрации компонентов, что такое же, как условия кристаллизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для тестирования крио-защиты при концентрации 30% по объему для 0,1 М Tris кристаллизации состояние, начните с фондового раствора 0,143 M Tris, прежде чем добавить крио-защиты.
  2. Из комплекта крио-реагентов создайте 10 зл и пробы для крио-защитного теста, смешивая 30% по объему крио-условия в 70% раствора запасов состояния кристаллизации, для конечной концентрации 30% крио-защиты в исходных условиях кристаллизации. Тщательно перемешайте.
    1. Используя пипетку с 10 л, возьмите 5 кЛ тестовых криозащищенных растворов и погрузите кончик трубы в жидкий азот. Если лед наблюдается, отбросьте.
    2. Проверьте все крио-защиты на 30%. Для успешных решений повторите процесс на уровне 20%, затем 10% и 5% криозащиты.
    3. Используя успешный крио-протекционтный раствор с наименьшим процентом криозащиты, добавьте 0,5 л раствора в тестируемую каплю с кристаллами. Наблюдайте под микроскопом, время, сколько времени кристалл длится в состоянии, если не неопределенный.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти кристаллы для тестирования только и будут отброшены. Для NEMO-EEAA оптимальным криозащитным раствором является 12% 1,2-пропанедиол. 12% приходится на разбавление крио-защиты раствор будет испытывать при добавлении к кристаллической капли около 100 нл, для приблизительной конечной концентрации 1,2-пропанедиола 10%.

10. Хрустальная петля

  1. Кристаллы петли за 1-2 дня до отгрузки в синхротрон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллы будут примерно 60-100 мкм в диаметре: 0,05 - 0,10 мм петли идеально подходят для циклов.
  2. Вырезать ленту из верхней части колодца.
  3. Добавьте 0,5 л раствора кристаллизации, содержащего 12% 1,2-пропанедиол крио-защиты непосредственно в скважину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация 1,2-пропанедиола в настоящее время составляет около 10%, из-за разбавления на 100 нл раствора падения (приблизительное уменьшение объема падения с первоначальных 200 nL, из-за диффузии пара).
  4. Петля кристалла из колодца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллы часто растут на дне колодца, но вытеснят нежным подталкивание от петли. После того, как выбили, петля.
  5. Храните кристалл, содержащий крио-петли в шайбах, погруженных в жидкость N2.
  6. Храните эти шайбы в жидкой N2 в колбе Dewar, пока они не будут готовы к отправке для рентгеновской дифракции на синхротрон.

11. Сбор данных

  1. Соберите данные рентгеновской дифракции. В этом протоколе используйте AMX beamline (ID: 17-ID-1), Национальный синхротронный источник света II.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные были собраны на месте, но могут быть собраны удаленно. Сбор данных в области кристалла, которые показали однородность решетки в кросс-поляризованных изображений. Расположите кристаллы в петле так, чтобы сбор данных не предусматривал «плохих» областей кристалла, в то время как кристалл вращается в гониометре. Данные, которые обеспечили наилучшее разрешение пришли из сбора на краю расширения кристалла около 5 х 5 мкм в размерах. Используйте rastering, чтобы определить лучшие области на кристалле, чтобы собрать20.

12. Обработка рентгеновских данных

  1. Обработка набора данных с максимальным разрешением собранного (1,8 евро) с помощью программы XDS IDXREF для определения космической группы, ячейки и содержания растворителя.
  2. Интегрируйте данные с помощью программы XDS INTEGRATE.
  3. Процесс масштабировал интенсивность программы XDS XSCALE с использованием сервера STARANISO, используя среднее отсечение I/I 1,2 для поверхности ограничения дифракции для данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные не будут вырезаны в истинном эллипсоиде. Сохраняйте все данные выше I/I отсечения 1.2. Статистика по данным, рассчитанным на сферическую полноту, будет неудовлетворительной из-за несферической усечения. Эллиптической полноты составила 88% с самымвысоким разрешением: 1,88, 2,10 и 2,55 евро вдоль оси а, би и с, соответственно.

13. Структурное решение

  1. Используйте рентгеновскую структуру GCN4 (PDB: 4DMD)15 в качестве модели поиска для молекулярной замены с использованием MRage21 в PHENIX22. Структура 4DMD была определена в MRage как «ансамбль», и решение MRage успешно построило структурную часть, соответствующую адаптеру N-терминала сонливки NEMO-EEAA, гомологичной модели поиска, для обеих цепей в димере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выключите коррекцию анизотропии в PHASER, или данные будут дополнительно сокращены.
  2. Используйте последовательные раунды Autobuild23 в PHENIX и ручного строительства (с использованием 2Fo-Fc и Fo-Fc карт, в Coot24) для создания оставшейся части структуры.
  3. Ручно построить остатки по-прежнему отсутствует в модели на основе 2Fo-Fc и Fo-Fc карты, используя Coot24.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последний этап включал в себя строительство 4 N-терминала остатков и 4 C-терминала остатков для каждого мономера. Размещение Sidechain также вручную корректировалось по мере необходимости.
  4. Рассчитайте композитную карту опускания с помощью PHENIX и 10% упущения структуры.

14. Доработка структуры

  1. Уточните конструкции с помощью PHENIX Refine. Запустите первоначальные уточнения против объемных растворителей и стереохимии весов, расслабляющий RMSbond и RMSangle ограничения 0,01 и 1,0, соответственно. Продолжить уточнение по индивидуальным B-факторам, параметрам TLS и заполняемости.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клонирование, выражение и очищение связывающей области NEMO, имеющей обязательную iKK.
Протокол, последовавший в этом исследовании, чтобы получить окончательную последовательность NEMO-EEAA(Рисунок 1A), который произвел дифракционные кристаллы качества, участие выражения и характеристики всех промежуточных конструкций, в том числе добавление скручиваемой катушки адаптеры на N- и или C-терминус, мутации C76A, C95S и мутации E56A, E57A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Попытки кристаллизации NEMO в несвязанной форме оказались безуспешными, включая попытки использования полноформатного белка и несколько конструкций усечения, охватывающих область, связывающую IKK. Наша биофизическая характеристика МКК-связывающей области NEMO (остатки 44-111) круговой дихрозом, спектроскопией ЯМР и анисотропной флуоресценцией показала, что конструкция, хотя и способна связывать ИККЗ, существовала в состоянии конформации, не пригодной для кристаллизации9,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим профессора Д. Мэддена за многочисленные полезные дискуссии на протяжении всего проекта. Мы благодарим профессора Д. Болона за дар плазмиды, содержащей оптимизированную катушки GCN4. Мы благодарим доктора Б. Го за плазмиды NEMO. Мы благодарим Кристину Р. Арнольди, Тамар Басиашвили и Эми Кеннеди за демонстрацию процедуры. Мы благодарим БиоМТ Кристаллография Основной фонд и кафедры химии и биохимии и клеточной биологии в Дартмуте за использование кристаллографического оборудования и персонала BioMT за их поддержку. В этом исследовании использовалась линия луча AMX Национального синхротронного источника света II, Управления министерства энергетики США (DOE) Управления научных пользователей, работаемого для Управления науки Министерства энергетики США По линии Брукхейвенской национальной лаборатории по контракту No. ДЕ-SC0012704. Мы благодарим сотрудников NSLS II за их поддержку. Эта работа была профинансирована грантами NIH R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 и P20GM1131332, а также грантом Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
20% масс./об. &гамма;-PGA (форма Na+, LM)Молекулярные размерыMD2-100-150Для тонкой экранной кристаллизации NEMO-EEAA
3,5 кДа MWCO Dialysis MembraneSpectra/POR132724Для диализного удаления имидазола
Amicon Stirred CellMillipose SigmaUFSC 05001Для концентрации белка
Хлорид аммонияMillipore SigmaG8270Для минимальной маркировки среды
Бензоназа НуклеазаMillipore Sigma9025-65-4Для расщепления нуклеиновой кислоты
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Компетентные клеткиAgilentTechnologies Модель: 230245Экспрессия TEV
CryoProHampton ResearchHR2-073Набор криопротекторов
D-глюкоза (декстроза)Millipore SigmaA9434Для минимальная маркировка на носителях
Difco Terrific BrothThermoFisherDF043817Для роста культуры
Дитиотреитол > 99%GoldbioDTT25Для снижения дисульфидов
E. coli: Rosetta 2 (DE3)Novagen71400-3Экспрессия немеченого NEMO-EEAA
FORMULATORFormulatrixОбработчик жидкостей / сборщик сит
HCl & ндаш; 1,0 М РастворHampton ResearchHR2-581Для тонкой ситовой кристаллизации NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pgGE Healthcare28989333Для исключения размера
HisTrap HP 5 мл колонкаGE Healthcare17524802Для очистки His-меченого NEMO-EEAA
HT 96 MIDASMolecular DimensionsMD1-59Для скрининга разреженной матрицы NEMO-EEAA
HT 96 MorpheousMolecular DimensionsMD1-46Для скрининга разреженной матрицы NEMO-EEAA
ImidazoleThermoFisher288-32-4Для элюирования из колонки His-trap
Изопропил-бета-D-тиогалактозидGoldbioI2481C5Для индукции культур
MRC2 Кристаллизационная пластинаHampton ResearchHR3-083Кристаллизационная пластина
NT8 - Установщик капельFormulatrixCrystallization
pET-16bMillipore Sigma69662Для клонирования NEMO-EEAA
pET-45bMillipore Sigma71327Для клонирования
фенилметилсульфонилфторидаThermoFisher36978Для ингибирования протеаз
Поликарбонат Флакон для использования в ультрацентрифуге Ротор Тип 45 TiBeckmann Coulter339160Ультрацентрифуга Бутылка
Полиэтиленгликоль 20,000Hampton ResearchHR2-609Для тонкой кристаллизации экрана NEMO-EEAA
pRK793 (TEV)AddgenePlasmid 8827Для производства TEV
QuikChange XL IIAgilent Technologies200522сайт-направленный мутагенез
Требуемая сборка колпачка:Beckmann Coulter355623Ultracenttrifuge крышка от бутылки
ROCK IMAGERFormulatrixCrystallization Imager
Seed Bead KitHampton ResearchHR2-320Генерация семян
Sodium Chloride ≥ 99%Millipore SigmaS9888Для буферизации очистных растворов
TCEP (Трис (2-Карбоксиэтил) фосфин гидрохлорид)GoldbioВосстановитель TCEP1
Фильтр БерклиРигакуMD15-BerekelyДля скрининга с разреженной матрицей NEMO-EEAA
Скрининг PGAМолекулярные размерыMD1-50Для тонкой кристаллизации NEMO-EEAA
Tris – 1,0 М растворHampton ResearchHR2-589Для тонкой кристаллизации экрана NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (порошок формат)Thermofisher15504020Для буферизации очистных растворов мочевины
ThermoFisher29700Для денатурации NEMO-EEAA
NEMO-EEAA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
  2. Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
  3. Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
  5. Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
  6. Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663(2018).
  7. Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
  8. Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
  9. Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
  10. Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
  11. Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
  12. Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950(2019).
  13. Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), London, England. 1611-1622 (2017).
  14. Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
  15. Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
  16. Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
  19. Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
  20. Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. (2019).
  21. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, Pt 4 658-674 (2007).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 2 213-221 (2010).
  23. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, Pt 1 61-69 (2008).
  24. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, Pt 12 Pt 1 2126-2132 (2004).
  25. Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
  26. Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  27. Tickle, I. J., et al. STARANISO. , (2018).
  28. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
  29. Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
  30. Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
  31. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

IKK binding DomainNEMO ProteinProtein ExpressionChromatographic PurificationSize ExclusionCrystallization ScreeningX ray DiffractionMolecular ReplacementCoiled coil AdapterTEV Protease

Related Articles