Используя первичные эпителиальные клетки простаты человека, мы сообщаем о новом методе, свободном от биомаркеров функциональной характеристики стволовых клеток, спомощьив сфероидной этикетке- удержания. Пошаговым протоколом описывается для маркировки 2D, CFSE или Far Red 2D-клеток; трехмерное образование сфероидов; маркировка удерживающей стволовые клетки идентификации иммуноцитохимии; и изоляция от FACS.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изоляция стволовых клеток от трехмерных сфероидных культур
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Несмотря на достижения в исследованиях стволовых клеток взрослых, выявление и изоляция стволовых клеток от образцов тканей остается серьезной проблемой. В то время как резидентные стволовые клетки относительно тихие с нишевыми удерживающими устройствами во взрослых тканях, они входят в клеточный цикл в трехмерной (3D) культуре и проходят как симметричное, так и асимметричное деление клеток, что приводит как к стеблю, так и к прародителю Клетки. Последние быстро размножаются и являются основной популяцией клеток на различных стадиях линии обязательств, образуя неоднородные сфероиды. С использованием первичных нормальных человеческих эпителиальных клеток простаты (HPrEC), сфероид основе, этикетки удержания асссбыл был разработан, что позволяет идентификации и функциональной изоляции сфероидов инициирующих стволовых клеток в одном разрешении клеток.
HPrEC или клеточные линии двухмерно (2D) культивируются с BrdU в течение 10 дней, чтобы позволить его включение в ДНК всех разделительных клеток, в том числе самообновляющихся стволовых клеток. Вымыть начинается после переноса в 3D-культуру на 5 дней, в течение которых стволовые клетки самообновляются через асимметричное деление и инициируют образование сфероидов. В то время как относительно тихие стволовые клетки дочери сохраняют родительскую ДНК, помеченную BrdU, потомки дочери быстро размножаются, теряя этикетку BrdU. BrdU можно заменить CFSE или Far Red pro-dyes, которые позволяют изоляцию стволовых клеток в реальном маштабе времени FACS. Характеристики стволовых клеток подтверждаются образованием сфероидов in vitro, анализами регенерации тканей in vivo и документированием их симметричных/асимметричных делений клеток. Изолированные этикетки удерживающих стволовых клеток могут быть тщательно допрошены вниз по течению молекулярных и биологических исследований, в том числе РНК-сек, ChIP-seq, одноклеточного захвата, метаболической активности, протеоме профилирования, иммуноцитохимии, органоидного образования, и in vivo ткани регенерации. Важно отметить, что этот подход, свободный от маркеров функциональной изоляции стволовых клеток, определяет стволовые клетки из свежих образцов рака и линии раковых клеток из нескольких органов, что свидетельствует о широкой применимости. Он может быть использован для выявления рака стволовых клеточных биомаркеров, экран фармацевтических препаратов ориентации рака стволовых клеток, и обнаружить новые терапевтические цели в раковых заболеваниях.
Введение
Человеческая предстательная железа содержит светящийся эпителий с секреторной функцией и базальные клетки, лежащие в ее основе вместе с необычным нейроэндокринным компонентом клеток. Эпителиальные клетки, в этом случае, генерируются из редкой популяции стволовых клеток простаты, которые являются относительно затихи в vivo и выступать в качестве системы ремонта для поддержания железистого гомеостаза на протяжении всей жизни1. Несмотря на многие достижения, выявление и функциональная изоляция стволовых клеток простаты остается серьезной проблемой в этой области. Биомаркеры стволовых клеток, в том числе клеточной поверхности маркера на основе мето....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все обработки клеток и средств массовой информации препараты должны быть выполнены с асептической техникой в классе II биологической безопасности кабинета (BSC).
1. Культура и содержание ячеек HPrEC в 2D
- Пальто 100 мм культуры блюда с 2 мл 2,5 мкг /см2 фибронектина раствор на ночь при комнатной температуре (RT). Приготовьте раствор и дайте культуре посуда на сухом воздухе в BSC в течение 45 мин. Фибронектин покрытием культуры блюда могут храниться 2-4 недели при 4 градусах Цельсия.
- Добавьте 9 мл среды роста эпителиальной клетки простаты (например, PrEGM) в блюдо культуры с покрытием 100 мм с покрытием фибронек....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Первичные нормальные клетки эпителия простаты человека помещаются в фибронектин покрытием культуры блюда и рост клеток поддерживается в 2D культуры(Рисунок 1a). При переходе в 3D-культуру с мембранной матрицей подвала дифференцированные эпителиальные клетки медленно вымирают. Только стволовые клетки простаты могут выжить в якорь свободной культуры и формы сфероидов в 5 дней(Рисунок 1b).
Двойная маркир.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Цитометрия потока с использованием нескольких маркеров поверхности стволовых клеток является широко используемым подходом для исследования стволовых клеток, несмотря на отсутствие как специфичности, так и избирательности1,5,6. В то время как образование сфероидов в системе 3D культуры является еще одним полезным методом в обогащении редких популяций стволовых клеток из первичных эпителиальных клеток, включая HPrEC, в результате .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют финансовых отношений раскрывать.
Благодарности
Это исследование было поддержано грантами Национального института рака R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Мы благодарим Flow Cytometry Core в Университете Иллинойса в Чикаго за помощь в сортировке клеток.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,05% Трипсин-ЭДТА | Gibco | 25300-054 | |
| 1 мл туберкулиновых шприцев | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1,5 мл микроцентрифужные пробирки, стерильные | |||
| 100 мм чашки для культур | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-луночный планшет для культивирования | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 мл центрифуга трубки | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 мм покровные стекла, sq | Corning | 284522 | Для MatTek 35 мм чашка |
| для культуры 24 x 50 мм покровные накладки | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1,5 дюйма игла для подкожных инъекций | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 мм чашка для культуры с покровным стеклом дно | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Стеклянное дно No 0, без покрытия,  облученное |
| 40 &микро; m поровое нейлоновое клеточное сетчатое фильтр | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 инкубатор для культур, 37 ° C | Forma | ||
| 50 мл центрифужные пробирки | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5 мл Полистирольная трубка с круглым дном и защелкивающимся колпачком | фильтра Corning | 352235 | 35 & микро; m нейлоновая сетка |
| 6-луночные культуральные планшеты | Corning | 353046 | |
| 8-луночные камерные слайды | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Водная монтажная среда, содержащая DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A Ядерный флуоресцентный краситель |
| Шкаф биологической безопасности, сертифицированный | |||
| BrdU уровня 2 (5-бром-2'-дезоксиуридин) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 мМ стоковый раствор в ДМСО |
| Центрифуга для 1,5 мл микроцентрифуги | Eppendorf | ||
| Центрифуга для 15 мл пробирок | Beckman Coulter Allegra | 6 | |
| CFSE (карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 мМ стоковый раствор в ДМСО |
| цитохалазин D | Thermo Fisher Scientific | ||
| Dispase 1U/ml | StemCell Cells Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 мМ стоковый раствор в ДМСО |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | |||
| Фибронектин | Sigma-Aldrich | F0895 | Для покрытия 100 мм культуральных чашек |
| Флуоресцентный микроскоп с цветной цифровой камерой | Carl Zeiss | Axioskop 20 флуоресцентный микроскоп; цветной цифровой Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Первичные нормальные клетки эпителия предстательной железы человека) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Собрано от 3 молодых (19-21 лет) доноров органов без заболевания; 1 x 105 клеток/мл; хранится в |
| ведре для льда с | |||
| Инвертированный микросоп с цифровой камерой | |||
| Matrigel, низкий фактор роста, фенол-красный свободный | Corning | 356239 | |
| метанол | Corning | A452-4 | |
| Мышиное антитело против BrdU Cell | Signaling | 5292S | |
| Мышиное антитело IgG ( отрицательный контроль) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Нормальная сыворотка для коз | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Фосфатный буферный раствор (PBS), pH 7,4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Дозаторы и наконечники, различные размеры | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Йодид пропидия (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μ г/мл PI в PBS, хранящемся при 4 ° C в темноте |
| Серологические пипетки, различные размеры | |||
| Программное обеспечение для подсчета сфер и измерения | |||
| Программное обеспечение: 3D-изображения с использованием Imaris программное обеспечение для визуализации с возможностями | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Водяная баня, 37 градусов; C | |||
| z-стековые изображения с помощью инвертированного флуоресцентного конфокального микроскопа |
Ссылки
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
