Индуцирование посттравматической эпилепсии в мышиной модели повторяющихся диффузных травматических травм головного мозга

Каждый год TBI затрагивает, по оценкам, 60 миллионов человек во всем мире. Воздействие лиц подвергаются более высокому риску развития эпилепсии, которая может проявляться лет после первоначальной травмы. Хотя тяжелые TBIs связаны с более высоким риском эпилепсии, даже мягкий ТБИ увеличивает шансы человека на развитие эпилепсии^1,2,3,4. Все TBIs могут быть классифицированы как координационные, диффузные, или сочетание того и другого. Диффузная черепно-мозговая травма, присутствуюая во многих, если не во всех ТБО, является результатом стрижки мозгов различной плотности друг против друга из-за ускорения замедления и вращательных сил. По определению, диффузная травма происходит только в изоляции в мягкой / сотрясение не проникающей черепно-мозговой травмы, в которой не поражения головного мозга видны на компьютерной томографии⁵.

В настоящее время существуют две критические проблемы в области ведения пациентов, у которых развивается посттравматическая эпилепсия (ПТЭ). Во-первых, как только ПТЭ проявляется, судороги устойчивы к имеющимся противоэпилептических препаратов (AED)⁶. Во-вторых, AEDs одинаково неэффективны в профилактике эпилептогенеза, и нет эффективных альтернативных терапевтических подходов. Для того, чтобы решить этот дефицит и найти лучшие терапевтические цели и кандидатов на лечение, необходимо будет изучить новые клеточные и молекулярные механизмы в корне PTE⁶.

Одной из характерных особенностей посттравматической эпилепсии является скрытый период между первоначальным травматическим событием и наступлением спонтанных, неспровоцированных, периодических припадков. События, которые происходят в этом временном окне являются естественным фокусом для исследователей, потому что это время окно может позволить лечение и профилактика PTE в целом. Модели животных наиболее часто используются для этого исследования, потому что они предлагают несколько различных преимуществ, не последним из которых является то, что непрерывный мониторинг человеческих пациентов будет непрактичным и дорогостоящим в течение таких потенциально длительных периодов времени. Кроме того, клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе эпилептогенеза, могут быть исследованы только в моделях животных.

Модели животных со спонтанными посттравматическими припадками и эпилепсией предпочтительнее перед моделями, где припадки индуцируются после ТБИ менее физиологически значимыми средствами, такими как хемоконвульяторы или электрическая стимуляция остро, хронически или разжиганием. Спонтанные посттравматические модели припадков тест, как TBI изменяет здоровую сеть мозга, что приводит к эпилептогенезу. Исследования с использованием дополнительной стимуляции после TBI оценить, как воздействие TBI снижает порог захвата и влияет на восприимчивость к судорогам. Преимущества животных моделей с изъятиями, вызванными химически или с электрической стимуляцией, заключаются в тестировании специфических механизмов огнеупорности к AED и эффективности существующих и новых AED. Тем не менее, степень релевантности и перевода этих данных на людей может быть неоднозначной⁷ из-за следующего: 1) механизмы захвата могут отличаться от тех, которые индуцируются только ТБИ; 2) не все из этих моделей приводят к спонтанным припадков⁷; 3) поражения, созданные судорожным агентом себя, с канюлей, необходимых для его доставки, или путем стимулирования размещения электродов в глубинных структурах (например, гиппокампа или миндалины) уже может вызвать повышенную восприимчивость захвата и даже гиппокампа эпилептиформных потенциалов эпилептиформных⁷. Кроме того, некоторые судорожные агенты (т.е. кайновая кислота) производят прямые поражения гиппокампа и склероз, что не характерно после диффузного ТБИ.

До недавнего времени существовали только две животные модели посттравматической эпилепсии: контролируемое воздействие корки (CCI, фокус) или жидкие ударные травмы (FPI, фокусные и диффузные)⁸. Обе модели приводят к большим очаговым поражениям наряду с потерей тканей, кровоизлиянием и глиозом у грызунов^8. Эти модели имитируют посттравматическую эпилепсию, вызванную крупными очаговыми поражениями. Недавнее исследование показало, что повторный (3x) диффузный ТБИ достаточен для развития спонтанных припадков и эпилепсии у мышей даже при отсутствии очаговых поражений^9,добавляя третью модель грызунов PTE с подтвержденными спонтанными периодическими припадками. Эта новая модель имитирует клеточные и молекулярные изменения, вызванные диффузной TBI, лучше представляя население с мягкими, сотрясением туберкулеза. В этой модели, скрытый период в три недели или более до начала захвата и появление поздних, спонтанных, повторяющихся изъятий позволяет исследовать коренные причины посттравматического эпилептогенеза, тестирование эффективности профилактических подходов и новых терапевтических кандидатов после начала захвата, и имеет потенциал для развития биомаркеров посттравматического эпилепгенеза, потому что примерно половина животных развиваются посттравматического эпилепсии.

Выбор животной модели для изучения посттравматической эпилепсии зависит от научного вопроса, типа исследуемой черепно-мозговой травмы и того, какие инструменты будут использоваться для определения основных клеточных и молекулярных механизмов. В конечном счете, любая модель посттравматической эпилепсии должна продемонстрировать как появление спонтанных припадков после ТБИ, так и начальный период задержки в подмножестве животных ТБИ, потому что не все пациенты, которые несут ТБИ, переходят к развитию эпилепсии. Для этого в этом протоколе используется электроэнцефалография (ЭЭГ) с одновременным приобретением видео. Понимание технических аспектов, лежащих в основе оборудования и подходов к сбору данных, имеет решающее значение для точной интерпретации данных. Важнейшие аппаратные аспекты включают тип системы записи, тип электродов (винт или провод свинца) и материал, из которого они сделаны, синхронизированное приобретение видео (как часть системы ЭЭГ или третьей стороны), а также свойства компьютерной системы. Крайне важно установить соответствующие параметры приобретения в любом типе системы в зависимости от цели исследования, событий ЭЭГ, представляющих интерес, метода дальнейшего анализа и устойчивости хранения данных. Наконец, необходимо учитывать метод конфигурации электрода (монтаж), так как каждый из них имеет преимущества и недостатки и повлияет на интерпретацию данных.

Этот протокол подробно, как использовать модифицированные Marmarou падение веса модели^10,11, чтобы вызвать диффузные травмы в результате спонтанного, неспровоцированные, периодические судороги у мышей, описывает хирургические подходы к приобретению одного и многоканального непрерывного, и синхронизированные видео ЭЭГ с использованием монополярного, биполярного или смешанного монтажа.

Все процедуры для животных, описанные в этом протоколе, были выполнены в соответствии с Институциональным Комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Технологического университета Вирджинии и в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» Национальных институтов здравоохранения. .

1. Протокол обращения с животными

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для привыкание животных, заказанных от поставщика на объект после прибытия и условие их к обработке экспериментатором. Это улучшает благополучие животных за счет снижения стресса и тревоги и упрощает определенные процедуры, которые требуют обращения с животными, в том числе индуцирование TBI, послеоперационный мониторинг, и подключение животного к системе приобретения.

1. Когда многие животные получают от поставщика, ухо-тег и случайно назначить их в экспериментальной группы (TBI) или контрольной группы (фиктивная хирургия) при объединении их в клетках от 2 до 5 животных. Дом TBI животных отдельно от фиктивных животных, потому что фиктивные мыши иногда действуют агрессивно по отношению к мышам, которые прошли TBI.
2. Обработка день 1 (24'48 h после уха пометки): Подготовьте диаграмму для журналов животных ухо метки, дата рождения, даты обработки, вес животных на обработке дней, продолжительность обработки, и раздел для комментариев и замечаний.
3. Аккуратно чашку животное с помощью обеих рук. Не хватай животное за хвост, так как оно индуцирует защитные механизмы и стрессовую реакцию.
4. Проверьте и запишите ушную бирку животного.
5. Поместите животное в контейнер на весовой шкале и запишите вес.
6. Аккуратно чашку животное обеими руками снова и обрабатывать его в течение 1 мин, что позволяет ему двигаться и исследовать в руках. Выполните это над скамейкой в процедурной комнате и будьте осторожны, чтобы не уронить животное на пол.
7. После 1 мин обработки, поместите животное обратно в клетку.
8. Повторите шаги 1.3'1.7 для других животных в клетке.
9. Обработка день 2 (на следующий день): Повторите шаги 1.2'1.5.
10. Аккуратно чашку животное обеими руками снова и обрабатывать его в течение 2 минут, что позволяет ему двигаться и исследовать в руках. Выполните это над скамейкой в процедурной комнате и будьте осторожны, чтобы не уронить животное на пол.
11. После 2 минут обработки, поместите животное обратно в клетку.
12. Повторите шаги 1.10-1.11 для других животных в клетке.
13. Обработка день 3 (на следующий день): Повторите шаги 1.2'1.5.
14. Аккуратно чашку животное обеими руками снова и обрабатывать его в течение 4 минут, что позволяет ему двигаться и исследовать в руках. Выполните это над скамейкой в процедурной комнате и будьте осторожны, чтобы не уронить животное на пол.
15. После 4 минут обработки, поместите животное обратно в клетку.
16. Повторите шаги 1.14-1.15 для других животных в клетке.
17. Обработка день 4 (контрольный день, 1 неделя с момента обработки день 1): Повторите шаги 1.2'1.5.
18. Аккуратно чашку животное обеими руками снова и обрабатывать его в течение 4 минут, что позволяет ему двигаться и исследовать в руках. Выполните это над скамейкой в процедурной комнате и будьте осторожны, чтобы не уронить животное на пол.
19. После 4 минут обработки, поместите животное обратно в клетку.
20. Повторите шаги 1.18-1.19 для других животных в клетке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: День обработки управления проверяет сохранение спокойного поведения после трехдневного протокола обработки.

2. Процедура снижения веса

1. Поместите мышь в индукционную камеру. Установите поток кислорода и вакуума как до 1 л/мин, так и уровень изофлуранского газа до 3%-5%. Анестезируйте мышь в течение 5 мин.
2. Снимите мышь с индукционной камеры и поместите ее на пенную площадку. Тест на отсутствие ответа на нос или хвост щепотку.
3. Подкожно вводить анальгетик (0,1 мг/кг бупренорфин). Если ЭЭГ хирургия выполняется в тот же день, вводить бупренорфин подкожно в сочетании с нестероидным противовоспалительным карпрофеном (5 мг/кг).
4. Подкожно администрирование раствора лактата натрия (3 л на грамм веса животного) подкожно до или после последнего удара. Раствор лактата натрия можно смешивать с анальгетиками для быстрого введения в одну инъекцию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор лактата натрия содержит смесь хлорида натрия, хлорида калия, хлорида кальция и лактата натрия в воде. Этот шаг помогает заменить жидкости и электролиты, помогая восстановлению.
5. Расположите головку мыши под трубкой падения веса(рисунок 1А)и поместите плоский диск из нержавеющей стали (диаметр 1,3 см, толщина 1 мм и вес 880 мг) в центре головы, между линией глаз и ушей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот диск рассеивает воздействие на поверхность черепа (Рисунок 1B).
6. Удалите штырь в трубке падения веса, чтобы освободить 100 г вес стержня с высоты 50 см. Чтобы вызвать фиктивную травму для контрольных мышей, удалите штангу веса из трубки, чтобы предотвратить случайное высвобождение штифта и падение веса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Голова животного должна быть расположена плоской, так что стержень свободно падает на всю поверхность диска.
7. Поместите бессознательное животное на спину для восстановления на грелке, покрытой стерильным полиподалистым абсорбирующим полотенцем. Время восстановления исправив рефлектор (т.е. время, необходимое мыши, чтобы исправить себя со спины) может быть измерено как считывание за время, проведенное без сознания.
8. Когда животное приходит в сознание, поместите его в чистую клетку, которая была подогрета на грелке, с восстановлением гель и несколько увлажненных частей чау, чтобы восстановить в течение 45 мин. Убедитесь, что есть достаточный мусор, чтобы клетка не перегреться. Перегрев животного может оказаться столь же большим препятствием для восстановления, как позволяет мыши стать слишком холодно.
9. После 45 мин повторите шаги 2,1–2,8 дважды, опустив шаг 2.3 (т.е. введение анальгетиков и противовоспалительных препаратов).
10. Разрешить животным, чтобы восстановить сява в течение 1 х 2 ч, если ЭЭГ электрод имплантации операция проводится в тот же день.

3. Хирургическая полевой подготовка для имплантации эЭГ-электродов

ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклав хирургических инструментов и винтов до операции. Очистите хирургические перчатки путем распыления и трения с 70% этанола до и после прикосновения к животному, нестерильных материалов, а также между обращением с животными. Стерилизовать хирургические инструменты в течение 2-3 минут в стерилизаторе биса (см. Таблица материалов)между животными. Измените стерильную драпировку перед размещением нового животного в стереотактический аппарат. Убедитесь, что хирургическое поле содержит все необходимые компоненты для операции(рисунок 2). Отсутствие инвазивной хирургической процедуры для индуцирования ТБИ в этой модели имеет ряд преимуществ: 1) имплантация электродов является гибкой и может быть выполнена в тот же день, что и ТБИ, или после определенного периода времени; 2) время восстановления животного быстрее; 3) череп остается нетронутым, что позволяет больше площади поверхности и гибкости для имплантации электродов.

1. Анестезируйка мыши в изофлуранском газе в индукционной камере в течение 5 минут.
2. Перенесите мышь из индукционной камеры в стереотактический аппарат и поместите ее на стерильную драпировку на грелку с изофрурановым газом и вакуумными трубками, подключенными к носовому конусу.
3. Поддерживайте температуру тела на уровне 37 градусов по Цельсию в течение операции. Поместите датчик температуры так, чтобы он контактировал с грудной клеткой или брюшной стенкой мыши.
4. Исправьте голову животного на месте с помощью ушных прутьев.
5. Поддерживайте анестезию на уровне 1,5%-3,5% изофлюрани или при 60 вдохах/мин в хирургической плоскости (без реакции на нос или хвостовую щепотку).
6. Нанесите глазную мазь на глаза животного, чтобы держать их смазанным на протяжении всей операции.
7. Администрирование смеси анальгетиков (0,1 мг/кг бупренорфин) и нестероидных противовоспалительных препаратов (5 мг/кг карпрофена) в одной инъекции подкожно, если TBI была выполнена ранее в течение дня, и в этом случае животное уже получило анальгетики и противовоспалительные средства.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бупренорфин следует вводить снова, если время между первой TBI и ЭЭГ размещения хирургии превышает 8 ч или если животное отображает признаки боли 8 ч после первого введения, но она должна быть предоставлена без добавления карпрофена.
8. Подкожно администрирование раствора лактата натрия (3 л на грамм веса животного) для замены жидкостей и электролитов у животного.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если операция выполняется сразу после TBI, этот шаг должен быть приурочен должным образом. Раствор лактата натрия следует вводить каждые 2 ч, пока животное проходит процедуры и один раз после операции, 2 ч от предыдущей инъекции.
9. Удалите волосы с головы с помощью крема для удаления волос.
10. Перед тем, как сделать разрез, дезинфицировать кожу кожи головы с повидон-йод хирургического антисептического раствора и 70% этанола в чередующихся тампонах с стерильными марлевыми прокладками в круговом движении 3x (20 s на раствор каждый раз).
11. С помощью скальпеля, сделать рострал-каудальный разрез на коже головы средней линии от чуть выше глаз до задней части головы. Этот метод открытия кожи головы является предпочтительным по сравнению с резки кожи головы, как кожи лоскуты могут быть запечатаны над или вокруг ЭЭГ-шапка обеспечения большей стабильности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При подготовке черепа к имплантации 3-EEG headmount, отрезав кожу головы не требуется, так как размер головки не позволит для закрытия кожи закрылки над головой.
12. Расширьте область разреза, применяя небольшие гемостаты на открытых границах кожи. Если кровотечение происходит после разреза, очистить стерильной галей хлопка или тампоном.
13. Аккуратно удалите периостеум (т.е. тонкую мембрану над черепной костью) с помощью скальпеля. Если какое-либо кровотечение происходит во время этого шага, нажмите на место кровотечения с стерильной ватным тампоном, пока он не остановится.
14. Используйте стерильные ватные тампоны, чтобы очистить череп перекисью водорода, но не касаясь мягких тканей, окружающих открытые черепной области. Повторите этот шаг до тех пор, пока череп очищается от каких-либо мягких тканей и имеет беловатый вид.
15. Высушите череп стерильной марлей или ватным тампоном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.12-3.15 важны для правильной фиксации электродов и зубного цемента. Любые мягкие ткани, не приспущенные кровотечения, и мусор может вызвать инфекцию, нестабильную фиксацию головы, искаженный или отсутствующий сигнал, и потерю имплантата в течение нескольких дней или недель после операции.

4. Размещение электрода

1. Имплантировать единый ЭЭГ (1EEG) канал headmount.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аббревиативы в стереотаксических координатах представляют пространственные отношения и указывают расстояние в миллиметрах цели от брегмы при заданной ориентации на голову животного: передняя задняя (AP) и медиально-боковая (ML). Дорсаль-вентраль не применим в этом протоколе, потому что все электроды помещаются в эпидуральное пространство, а не в определенную структуру в головном мозге (Рисунок 3). Винз является активным электродом, а Вин- является его эталонным электродом.
   1. Используйте высокоскоростную дрель со стальным битом (0,5 мм, круглый, 1/4 дюйма) по цене 5000-6000 патронов за минуту (об/ ч) для создания шести отверстий заусенцев (три для винтов стабильности и три для электродов) с использованием предусмотренных стереотактических координат^12. Для двух передних винтов: А.. - 1,5 мм, МЛ - 1,5 мм; для одного заднего винта: АП -5,2 мм, МЛ -1,5 мм; для наземного электрода: А.. -5,2 мм, МЛ - 1,5 мм; для записывающих электродов: А.. -2,3 мм, МЛ - 2,7 мм, с Вином вправо и Вин- влево.
   2. Добавьте три винта для повышения устойчивости головной ступени. Используя отвертку, поверните винты 1'1.5 x каждый, чтобы быть исправлены заступнися в черепе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение винтов глубже повредит мозг.
   3. Вставьте головную очку 1EEG в стереотаксическую руку держателя и расположите голову так, чтобы три электрода располагались вдоль средней линии черепа. В этой конфигурации наземный электрод и его соответствующее отверстие в верхней части головки находится в задней части, электрод Вине в середине и Вин-электрод спереди. На головном уходе можно нанести отметку с помощью перманентного маркера.
   4. Согните каждый электрод 90 ", так что конец каждого провода согнут вниз и расположен выше соответствующего отверстия заусенцев. Затем измерьте длину 1 мм части провода, которая теперь перпендикулярно отверстию заусенки, и обрезать излишки(рисунок 3). Это обеспечит эпидуральное размещение электродов. Электроды должны едва касаться поверхности dura mater.
   5. Опустите головной убор и отрегулируйте все три электрода в соответствии с соответствующим отверстием заусенец. Для эпидуральной записи электроды должны быть размещены выше или едва касаясь матер дюра.
   6. Подготовка зубного цемента для применения путем смешивания 1/2 мерной ложки порошка с несколькими каплями растворителя. Используйте перемешивание шпателя и перемешать, пока окончательная смесь шальто-как, липкий, но податливый, и достаточно жесткой, чтобы быть правильно конденсируется при размещении на черепе животного.
   7. Нанесите зубную цементную смесь, покрывающую все винты и электроды, и подождите 3-5 минут, чтобы она затвердела. Убедитесь в том, чтобы не покрыть пластиковый пьедестал зубным цементом, потому что это сделает невозможным подключение животного к коммутатору с тросом.
   8. Отпустите гемостаты, держащие кожные лоскуты, и закройте разрез, соединив кожные лоскуты вокруг пластикового пьедестала. Нанесите несколько капель ткани клея (см. таблицу материалов), чтобы запечатать кожу закрылки.
   9. Нанесите хлоргексидин антисептик на область вокруг имплантата, чтобы избежать инфекции. Если животное находится под наркозом дольше 2 ч после предыдущей инъекции раствора лактата натрия, данного во время индукции ТБИ, вводят еще одну инъекцию подкожно. Для поддержания правильной гидратации животного, повторите инъекцию каждые 2 ч, которые животное проводит под наркозом.
   10. После операции, дать окончательный инъекции раствора лактата натрия 2 ч после предыдущей инъекции. Если операция менее 2 ч в длину, ввести окончательную дозу восстановления раствора лактата натрия 2 ч с первой инъекции.
   11. Удалить животное из стереотаксического аппарата и измерить вес животного после операции ЭЭГ в качестве эталона для будущего мониторинга. Благодаря имплантату вес животного будет больше, чем до операции.
   12. Поместите животное в чистую клетку на теплую грелку для восстановления.
2. Имплантировать два ЭЭГ и один EMG (2EEG/1EMG) каналы headmount.
   1. Используйте bregma в качестве ориентира для размещения головной уклад. Нанесите небольшое количество клей ткани (см. Таблица материалов)на нижнюю сторону головки 2EEG/1EMG, избегая четырех винтовых отверстий и поместите головную установку 2EEG/1EMG на поверхность черепа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет никаких конкретных координат для размещения этой головной уклады. Высота головы составляет 8 мм в длину и 5 мм в ширину, что покрывает большую часть черепной поверхности. Позиционирование головки с передним краем 3,0 мм переднюю часть к брегме является оптимальным и обеспечивает хорошее качество сигнала. Быстрое ручное размещение необходимо перед падением ткани клея лечит. Разрешить примерно 5 мин для ткани клея, чтобы вылечить полностью.
   2. Используйте стерильную иглу 23 G для создания пилотных отверстий для винтов через четыре отверстия в головном уходе. Для достижения этой цели, осторожно нажмите иглу и медленно вращаться, пока кончик иглы проникает в череп, не повреждая мозг. Удалите кровотечение из отверстия пилота с помощью стерильного ватного тампона.
   3. Вставьте 0.10 в винты в пилотных отверстий и поверните их, пока каждый не будет зафиксирован в черепе. Это может быть до половины длины винта, но не по всей длине, так как это повредит дюра матер и коры головного мозга. Если высота расположена таким образом, что есть зазор между поверхностью черепа и задней части головки использовать два 0,12 в винтах в задней части.
   4. Сделайте небольшое отверстие по бокам двухкомпонентной эпоксидной (серебряно-эпоксидной) сумки с двумя пакетами. Возьмите двусторонний шпатель и использовать каждую сторону, чтобы зачерпнуть небольшое и равное количество каждого компонента из мешка и смешать их вместе. Используйте только небольшое количество, достаточное для одной операции, потому что смесь затвердевает в течение 20 мин. Запечатать стороны сумки, чтобы предотвратить сушки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Серебристая эпоксидная сигнал обеспечивает надлежащий электрический контакт между винтом и головой и повышает стабильность винтов.
   5. Нанесите небольшое количество этой смеси между винтом и винтом отверстие, а затем затяните каждый винт, пока его голова лежит на базе имплантата. Убедитесь, что ни одна серебристо-эпоксидная не контактирует между двумя винтами, потому что каждый винт служит индивидуальным электродом и, чтобы обеспечить точный сигнал, он не должен входить в контакт с другим винтом.
   6. Если серебристо-эпоксидная смесь была неуместна, есть несколько вторых временных окон, чтобы тщательно вычерпывать избыток, чтобы отделить соединение. Тщательно согните оба ЭМГ ведет от задней кромки головки, чтобы следовать контуру головы и шеи животного, а затем вставьте их в нуклеальные мышцы.
   7. Подготовка зубного цемента для применения путем смешивания 1/2 мерной ложки порошка с несколькими каплями растворителя. Используйте перемешивание шпателя и перемешать, пока окончательная смесь шальто-как, липкий, но податливый, и достаточно жесткой, чтобы быть правильно конденсируется при размещении на черепе животного.
   8. Нанесите зубную цементную смесь, покрывающую всю головную гору, избегая при этом покрывающих шесть отверстий, так как это сделает невозможным подключение предварительного усилителя. Подождите 3-5 минут, чтобы цемент затвердеть. Убедитесь, что кожа не запечатана до головы зубным цементом.
   9. Отпустите гемостаты, держащие кожные лоскуты, и закройте разрез, соединив кожные лоскуты вокруг пластикового пьедестала. Нанесите несколько капель ткани клея, чтобы запечатать кожу закрылки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если разрез кожи был сделан дольше, чтобы позволить для выпрямление провода ЭмГ приводит, кожа может быть запечатана с клей ткани или зашедают. Запечатывание кожи с помощью клея ткани, как правило, достаточно. Однако, если во время послеоперационного мониторинга наблюдается открытие разреза, вместо этого рекомендуется швы.
   10. Нанесите хлоргексидин антисептик на область вокруг имплантата, чтобы избежать инфекции. Подкожно администрирование раствора лактата натрия (3 л на грамм веса животного) для замены жидкостей и электролитов, если животное находится под наркозом дольше 2 ч после предыдущей инъекции.
   11. Удалить животное из стереотаксического аппарата и измерить вес животного после операции ЭЭГ в качестве эталона для будущего мониторинга. Благодаря имплантату вес животного будет больше, чем до операции.
   12. Поместите животное в чистую клетку на теплой грелкой, с гель восстановления и несколько увлажненных кусочков чау для восстановления.
3. Имплантировать три ЭЭГ-канала (3EEG) головной убор.
   1. Используйте высокоскоростную дрель со стальным битом (0,5 мм, круглый, 1/4) при 5000-6000 об/мин, чтобы создать шесть отверстий заусенцев (три для винтов стабильности и три для электродов) с использованием предоставленных стереотактических координат^12. Для наземных и общих ссылок для ЭЭГ1 и ЭЭГ2: AP - 5,2 мм, МЛ - 1,5 мм; для ЭЭГ1 и ЭЭГ2: А.П. - 3,0 мм, МЛ - 3,0 мм; для независимого ЭЭГ3: А.. -1,4 мм, МЛ - 1,5 мм.
   2. Поместите шесть винтовых электродов в отверстия заусенцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение винтов глубже создаст значительные повреждения мозга. Винтовые электроды обеспечивают лучшую стабильность головки.
   3. Подготовка зубного цемента для применения путем смешивания 1/2 мерной ложки порошка с несколькими каплями растворителя. Используйте перемешивание шпателя и перемешать, пока окончательная смесь шальто-как, липкий, но податливый, и достаточно жесткой, чтобы быть правильно конденсируется при размещении на черепе животного.
   4. Нанесите зубную цементную смесь, покрывающую всю обнажаемую поверхность черепа и каждый винтэлектрод. Убедитесь, что кожа не запечатана до головы зубным цементом. Подождите, чтобы цемент мягко затвердел, подождите 1,2 мин. Нет необходимости ждать полного затвердевания, прежде чем переходить к следующему шагу.
   5. Включите паяльник, чтобы нагреть его. Поместите голову 3EEG в стереотаксическую руку держателя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Позиция headmount так, что шесть провода свинца позиции соответствуют положению провода приводит каждого винта электрода.
   6. Опустите головной уклад так, чтобы его брюшная часть покоится поверх зубного цемента.
   7. Твист провода каждого свинца от каждого из винтовых электродов с соответствующим проводом свинца головной уклад.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скручивание неправильных проводов сделает интерпретацию данных сложной или невозможной.
   8. Тщательно обрезать избыток проволоки с помощью ножниц. Солдер каждая витая пара проводов для правильного сигнала дирижированной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая пара проводов должна встыкаться в контакт с другой парой, в противном случае качество сигнала и интерпретация данных будут скомпрометированы.
   9. Согните каждую припаячную пару проводов вокруг головки, избегая контакта между каждой парой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если провод приводит не обрезается достаточно коротким может быть трудно согнуть их вокруг головки, не касаясь другого провода. В этом случае сначала согните одну пару, накройте ее зубной цементной смесью, подождите, чтобы затвердеть, а затем приступайте к следующей паре таким же образом.
   10. Готовое покрытие всей проволоки зубным цементом, оставляя только черную часть головки открытой.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не применять любой зубной цементный порошок или смесь в верхней части открытой части headmount как любой мусор или цемент в отверстиях будет блокировать контакт и приведет либо отсутствие сигнала или шума.
   11. Отпустите гемостаты, держащие кожные лоскуты. Нанесите хлоргексидин антисептик на область вокруг имплантата, чтобы избежать инфекции.
   12. Администрирование раствора лактата натрия (3 л на грамм веса животного) подкожно заменить жидкости и электролиты, если животное находилось под наркозом дольше 2 ч после предыдущей инъекции.
   13. Удалить животное из стереотаксического аппарата и измерить вес животного после операции ЭЭГ в качестве эталона для будущего мониторинга. Благодаря имплантату вес животного будет больше, чем до операции.
   14. Поместите животное в чистую клетку на теплой грелкой, с гель восстановления и несколько увлажненных кусочков чау для восстановления.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Перекись водорода помогает в удалении любых оставшихся мягких тканей из черепа.

5. Подключение животных к системе приобретения

1. Кубок животное обеими руками, чтобы удалить его из клетки приобретения и передать его в чистую область с плоской поверхностью, как animal Transfer Station (ATS).
2. Аккуратно возьмите мышь за кожу спины. Не хватай животное за хвост, так как это вызывает бедствие.
3. Определите отверстие в гоме ЭЭГ, соответствующем наземному электроду, и сопостройте соответствующий штифт троса для правильного соединения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратное соединение троса от коммутатора к животному головному убору приведет к различному чтению электродов и потенциально искаженных волновых форм.
4. Верните животное в клетку приобретения и соедините другой конец троса (ЭЭГ-система 1) или предварительно усилителя (Система ЭЭГ 2) к коммутатору.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При подключении предварительного усилителя (ЭЭГ-система 2) к тросу от коммутатора, сопоставляют белые метки на концах обоих тросов. Обратное соединение приведет к необратимому повреждению усилителя и требует ремонта со стороны производителя, которые являются дорогостоящими.
5. Аккуратно поверните трос, соединяющий животное с коммутатором, чтобы обеспечить работу механизма должным образом и, чтобы животное может свободно перемещаться.

6. Настройки получения данных ЭЭГ

1. Установите параметры приобретения Системы ЭЭГ 1.
   1. Установить частоту выборки до 500 Гц; получить 5000; режим Норм 35 Гц; LpN свыключен. Установите фильтр высокого прохода до 0,5 Гц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 100 Гц (низкий проход) является встроенным и не требует ручного ввода.
2. Установите параметры приобретения EEG System 2.
   1. Установить частоту выборки до 600 Гц; предусилитель усиления 100; получить 1 (EEG1,2). Установите фильтр низкого прохода до 100 Гц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1 Гц (высокий проход) встроен и не требует ручного ввода.

7. Настройки сбора видеоданных

1. Устанавливаем параметры приобретения для системы ЭЭГ 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения одновременных видеоданных необходима система приобретения видео третьей стороной.
   1. Установите частоту кадров между 15 (минимум рекомендуется) и 30 (максимум доступны) для соответствующего качества видео. Установите разрешение на 640 x 640 пикселей. Установите тип сжатия до H.264H.
2. Устанавливаем параметры приобретения для системы ЭЭГ 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта система ЭЭГ предлагает видеосистему и программное обеспечение, которые синхронизируют видео и ЭЭГ данные вместе в одном файле для четырех животных (см. Таблица материалов).
   1. Установите частоту кадров между 15 (минимум рекомендуется) и 30 (максимум доступны) для соответствующего качества видео. Установите разрешение на 640 x 480 пикселей. Установите тип сжатия в формате файла WebM.

В описанном здесь протоколе описывается метод индукции диффузной травмы в изоляции (например, при отсутствии очагового поражения) с помощью мышиной модели повторяющихся диффузных TBI (Рисунок 1). На рисунке 1А изображено устройство для снижения веса и его компоненты(рисунок 1А, a1'a5), используемый для индукции TBI в этой модели и критических шагов во время процедуры(Рисунок 1B, b1'b5).

Характеристики этой модели включают отсутствие очагового поражения мозга в результате ТБИ, потеря сознания, высокая выживаемость, появление позднего начала захвата (Зтт;1 неделя ТБИ), и спонтанные, неспровоцированные, периодические припадки в подмножестве TBI мышей после периода задержки, по крайней мере три недели после TBI.

Этот протокол демонстрирует подробные процедуры для создания чистого хирургического поля(рисунок 2), обеспечивает пошаговый подход к имплантации различных электродных массивов(рисунок 3),и включает в себя подробное руководство по использованию двух различных систем приобретения ЭЭГ (см. Таблица материалов) для обнаружения изъятий(Рисунок 4 и Рисунок 5) в этой модели. Спектральная мощность типичного захвата указывает на самую высокую плотность в частотном диапазоне от 10 до 40 Гц с пиком в 15 Гц(рисунок 4). Большинство изъятий у мышей являются судорожными, со средней продолжительностью 12-15 с. Лишь небольшая часть изъятий не является судорожным. Тщательное сравнение преимуществ и недостатков использования любой системы подробно описано в разделе Обсуждения. Кроме того, этот протокол демонстрирует сроки начала захвата у животных после повторного падения веса TBI, показывая захват кластеризации в некоторых животных(Рисунок 6), который подчеркивает важность приобретения непрерывной, а не прерывистые записи, так как это обеспечит точное стратификации животных, которые развиваются спонтанные изъятия после TBI от тех, которые этого не делают. Важно отметить, что в этом протоколе также рассматриваются преимущества и недостатки моделей грызунов PTE и их способность представлять определенную популяцию людей после ТБИ.

Рисунок 1: Модель мыши повторяющихся диффузных TBI. (A) Устройство падения веса. (a1) Трубка падения веса. (a2) 100 г весовой стержня. (a3) Пин, держащий стержень. (a4) Строка, чтобы поднять стержень вверх при изменении высоты или удаления стержня из трубки падения веса. (a5). Пена площадку для размещения животного под трубку падения веса. (B) Процедура падения веса. (b1) Диск из нержавеющей стали расположен в центре головы между линией глаз и ушей. (b2 и b3) После визуального подтверждения того, что голова животного находится в ровном положении и пенная подушечка перемещается, помещая голову животного под трубку падения веса. (b4) Освобождение булавки, держащей вес стержня, попав в центр диска из нержавеющей стали. (b5) Мышь помещается на стерильное полотенце сразу после удара и потери сознания оценивается путем измерения времени, необходимого для животного, чтобы восстановить и право себя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Хирургическая подготовка поля и схема размещения эЭГ-электрода. Автоматические инструменты и необходимые материалы для хирургического вмешательства и имплантации электрода готовятся перед анестезией животного для обеспечения наличия всех необходимых деталей. Это стерильная зона, и крайне важно не загрязнять эту зону нестерильными материалами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Стереотаксические ориентиры и схематическое представление размещения электродов с помощью ЭЭГ-системы 1 и 2. Верхняя панель изображает методы имплантации трех различных головных укладов, описанных в этом протоколе. (A) Единый канал ЭЭГ, биполярный монтаж. (B) Два эЭГ-канала с общей ссылкой, биполярный монтаж и один EMG-канал. (C) Три ЭЭГ-канала, используя монополярный (канал 1'2) и биполярный (канал 3) монтаж. Нижняя панель изображает головные уклады и винты, имплантированные как в верхнюю панель. Три типа винтов, используемых в этом протоколе для двух целей: как стабильные винты (ЭЭГ-система 1) или как стабильность, так и электрод (ЭЭГ-система 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Спонтанный захват, приобретенный с помощью системы ЭЭГ 1. Верхняя панель изображает спонтанный захват в мыши 23 дней после повторного падения веса TBI с использованием данных, полученных с помощью 1EEG headmount. (A)Пре-иктальная (предзахватная) активность. (B) Итальная (конфискация) активность. (C) Пост-иктальная (пост-припадок) депрессия. Нижняя панель: Плотность спектра мощности рассчитывается с помощью пользовательского скрипта и программного обеспечения (см. Таблицу Материалов). Средняя мощность - средняя мощность спектра мощности в эпоху (единицы: V2/Hz). Медианная частота - частота, при которой достигается 50% от общей мощности в эпоху (единицы: Гц). Средняя частота - частота, при которой достигается средняя мощность в эпоху (единицы: Гц). Спектральный край - частота, ниже которой достигается определенный пользователем процент от общей мощности в эпоху (единицы: Гц). Пиковая частота - частота, при которой максимальная мощность происходит в эпоху. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Спонтанные изъятия, приобретенные с помощью системы ЭЭГ 2. (A) Спонтанный несудорожный (электрографический) припадок у мыши через 65 дней после повторного падения веса TBI. Данные, полученные с помощью headmount 2EEG/1EMG. (B) Спонтанный судорожный припадок у мыши 97 дней после падения веса TBI. Данные, полученные с помощью headmount 3EEG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 6: Изъятие частоты сроки у мышей после повторного падения веса TBI. Самый ранний приступ наблюдался через три недели после травмы. Некоторые животные развиваются кластеры изъятий в течение того же дня, а затем несколько недель без судорог. Затравливали животных в течение четырех месяцев после ТБИ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Авторам нечего раскрывать.