Методическая статья

Создание и анализ трехмерных (3D) органоидов, полученных из метастазов костной ткани рака простаты Исты и их Ксенотранспланты

DOI:

10.3791/60367

⸱

3 февраля 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, University of California, San Diego, 2Moores Cancer Center, University of California, San Diego, 3Department of Medicine, University of California, San Diego, 4Department of Radiation Oncology, University of California, Los Angeles, 5Department of Orthopedic Surgery, University of California, San Diego

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трехмерные культуры пациентов BMPC образцов и ксенотрансплантатов костного метастатического рака предстательной железы поддерживать функциональную неоднородность своих оригинальных опухолей в результате чего кисты, сфероиды и сложные, опухолевидные органоиды. Данная рукопись содержит стратегию оптимизации и протокол для 3D-культуры неоднородных образцов, полученных пациентом, и их анализа с использованием МФк.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трехмерная (3D) культура органоидов из опухолевых образцов пациентов и получаемых пациентом ксенотрансплантата (PDX) моделей рака предстательной железы, именуемых органоидами, полученными от пациента (PDO), являются бесценным ресурсом для изучения механизма опухолевого и метастазов рака предстательной железы. Их главным преимуществом является то, что они поддерживают отличительную геномную и функциональную неоднородность оригинальной ткани по сравнению с обычными клеточными линиями, которые этого не делают. Кроме того, 3D культуры PDO могут быть использованы для прогнозирования воздействия лечения наркотиков на отдельных пациентов и являются шагом к персонализированной медицины. Несмотря на эти преимущества, несколько групп обычно используют этот метод отчасти из-за обширной оптимизации условий культуры PDO, которые могут потребоваться для различных образцов пациентов. Ранее мы продемонстрировали, что наша модель метастаза рака простаты PDX, PCSD1, вновь показала устойчивость метастазировать в кости пациента-донора к антиандрогенной терапии. Мы использовали органоиды PCSD1 3D для дальнейшей характеристики механизмов антиандрогенной резистентности. После обзора опубликованных в настоящее время исследований моделей PDX и PDO мы описываем пошаговой протокол для 3D-культуры PDO с использованием куполообразных или плавающих мембран ывейной (например, Matrigel) сфер в оптимизированных условиях культуры. In vivo стежок изображений и обработки клеток для гистологии также описаны. Этот протокол может быть дополнительно оптимизирован для других приложений, включая западный пятно, совместной культуры и т.д., и может быть использован для изучения характеристик 3D культивируемой PDO, относящихся к лекарственной устойчивости, опухолевому, метастазам и терапии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трехмерные культивированные органоиды обратили внимание на их потенциал для повторения архитектуры in vivo, клеточной функциональности и генетической подписи их оригинальных тканей1,2,3,4,5. Самое главное, 3D органоиды, установленные из опухолевых тканей пациента или пациента производных ксенотрансплантата (PDX) модели предоставляют бесценные возможности для понимания механизмов клеточной сигнализации при опухолевом и определить влияние медикаментозного лечения на каждую популяцию клеток6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 разработали стандартный протокол для создания органов простаты человека и мыши, который был широко принят в области урологии. Кроме того, значительные усилия были направлены на дальнейшую характеристику 3D-органоидов и понимание детальных механизмов опухолевого и метастазов4,12,14,15. В дополнение к ранее установленному и широко принятому протоколу для культур 3D органоидов, мы описываем здесь пошаговой протокол для 3D-культуры PDO, используя три различных метода доминга в оптимизированных условиях культуры.

В этой рукописи, 3D органоиды были созданы в качестве модели ex vivo кости метастатического рака предстательной железы (BMPC). Клетки, используемые для этих культур пришли из рака предстательной железы Сан-Диего (PCSD) серии и были получены непосредственно из метастатического рака простаты метастатических опухолевых тканей (PCSD18 и PCSD22) или пациента производные ксенотрансплантат (PDX) опухоли модели (образцы под названием PCSD1, PCSD13, и PCSD17). Потому что спонтанные метастазы костной ткани раковых клеток редко в генетически модифицированных моделей мыши16, мы использовали прямую внутри-femoral (IF) инъекции человеческих опухолевых клеток в мужской Rag2-/-КК-/- мышей для создания PDX модели кости метастатического рака предстательной железы17.

После того, как 3D органоиды устанавливаются из неоднородных опухолевых клеток пациента или пациента, полученных ксенотрансплантатов, важно, чтобы подтвердить их идентичность в качестве клеток опухоли простаты и определить их фенотипы в 3D органоидных культур. Иммунофлуоресценция химии (IFC) позволяет визуализации экспрессии белка на месте в каждой клетке, часто с указанием потенциальных функций для конкретных популяций клеток2,4. В целом протоколы МФЦ для подавляющего большинства образцов, включая ткани и клетки, просты и полностью оптимизированы. Однако плотность клеток и количество органоидов могут быть значительно ниже, чем у обычной культуры. Поэтому протокол МФК для органоидов требует дополнительных шагов для обеспечения надлежащей обработки и встраивания в парафин для всех органоидов в образцах. Мы описываем дополнительные шаги для процесса предварительного встраивания агарозы и советы по обозначения расположения разделенных органоидов на слайде, что увеличивает показатель успеха МФК на органоидов, особенно когда образцы органоидов имеют более низкую плотность клеток, чем хотелось бы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в Руководстве для Совета по институциональному обзору Калифорнийского университета в Сан-Диего (UCSD). IRB #090401 одобрение было получено от UCSD Институциональный обзор совета (IRB) для сбора хирургического образца от пациентов для исследовательских целей. От каждого пациента было получено информированное согласие, и в результате ортопедического ремонта патологического перелома бедренной кости был получен хирургический образец метастазрака рака простаты. Протоколы животных были выполнены в соответствии с Калифорнийским университетом в Сан-Диего (UCSD) защиты животных и институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC) утвержденный протокол #S10298. Клетки механически и ферментативно диссоциированной ткани опухоли пациента были внутри-femorally введены в 6 до 8 недель мужчина Rag2-/-; qc-/- мышей, как ранее описано17. Объем опухоли Xenograft был определен с помощью системы визуализации биолюминесценции in vivo и измерений калибра. При росте опухоли до 2,0 см (максимально допустимый размер одобрен IACUC), опухоль была собрана для установки 3D-органоидов.

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показан рабочий процесс для установления 3D органоидов и протокольный номер для каждого шага экспериментальных процедур.

1. Обработка производных ксенотрансплантата (PDX) опухолевых тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Это первый шаг для органоидного создания опухоли, полученной из модели ксенотрансплантатмыши. Этот протокол адаптирован из предыдущей публикации Drost et al.5, и мы изменили условия сми, включив добавки сыворотки к органоидным носителям.

  1. Обработайте образец опухоли, как описано ниже.
    1. Образцы опухоли фарша до 1-3 мм3 размера штук и переварить образцы с 10 мл раствора диссоциации клеток в течение 45 минут при комнатной температуре.
    2. Чтобы прекратить пищеварение, добавьте 20 мл полного носителя DMEM в образцы.
    3. Фильтр подвески через 70 мкм ячейки ситечко. Используйте стерильный поршень фланг, чтобы подтолкнуть любые остатки ткани на вершине 70 мкм ячейки ситечко.
    4. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
    5. Вымойте клеточные гранулы три раза со свежимa adMEM полный носителей. Соподогвайте объем средств для мытья и повторного свистого с объемом носителей, предложенных в таблице 3. Например, для 24 хорошо пластины культуры состояние, объем для стирки должно быть 500 зл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано в таблице 3,протокол применим к различным условиям культуры.
    6. Определить окончательные количество клеток с помощью трипан синий краситель и гемоситометр.
    7. После получения клеток рассчитывает, повторно приостановить клеточные гранулы в 80 Зл 2 00 FBS в PBS на 2 х 106 опухолевых клеток.
    8. Добавьте 20 злитровых коктейлей для истощения мышей на 2 x 106 опухолевых клеток. Хорошо перемешайте и инкубировать в течение 15 мин при 2-8 градусах Цельсия.
    9. Отрегулируйте громкость до 500 кЛ с 2% FBS в буфере PBS на 2 х 106 опухолевых клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: До 1 х 107 опухолевых клеток в 2,5 мл клеточной суспензии могут быть обработаны на одной колонке LS.
    10. Загрузите колонны LS на магнитный сепаратор колонны и поместите коническую трубку 15 мл на стойку под ним, чтобы собрать поток через.
    11. Промыть каждый столбец с 3 мл 2% FBS в буфере PBS. Откажитесь от конической трубки с промывкой и замените новой, стерильной конической трубкой 15 мл.
    12. Добавьте на колонку клеточную суспензию (до 2,5 мл из 1 х 107 опухолевых клеток). Сбор потока через которые будут обогащены человеческими опухолевыми клетками.
    13. Вымойте столбец дважды с 1 мл 2% FBS в буфере PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выполнять шаги мытья, как только столбец пуст. Кроме того, старайтесь избегать образования пузырьков воздуха.
  2. Aliquot соответствующий объем подвески клетки до трубки 1.5 mL для пожеланной установки культуры(таблица 3).
  3. Центрифуга 1,5 мл трубки на 300 х г и 4 КК в течение 5 мин.
  4. Тщательно удалите и отбросьте супернатант.

2. Обработка первичных опухолевых тканей пациента

ПРИМЕЧАНИЕ: Это первый шаг для органоидного истеблишмента.

  1. Следуйте всем шагу 1, за исключением процесса истощения клеток мыши, который не является необходимым для обработки первичных опухолевых тканей пациента.

3. Формирование прилагаемого круглого купола на тарелке

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта рукопись описывает три способа сделать купол из смеси клеточных гранул и мембраны подвала (например, Matrigel), как показано на рисунке 1 и рисунке 2. В шагах 2-4, клетки и мембрана подвала должны быть сдержаны на льду для того чтобы предотвратить затвердевание мембраны подвала.

  1. Приостановите действие клеточной гранулы в соответствующем объеме мембраны подвала (например, 40 л) для 24 хорошо настроенной пластины(таблица 3).
  2. Pipette вверх и вниз нежно для того чтобы обеспечить что клетки re-suspended наилучшим образом в мемне подвала.
  3. Pipette соотвествующее тома (Таблица 3) смеси мембраны клетки-подвала (и факультативного 10 l adDMEM вполне средств) в центр pre-warmed плиты культуры ткани.
  4. Перевернуть пластину и сразу же поместите пластину вверх дном в инкубатор культуры CO2, установленный на уровне 5% CO2,37 градусов по Цельсию в течение 15 мин. Это предотвращает клетки от урегулирования и прилипания к нижней пластины, позволяя мембраны подвала затвердеть.
  5. Pipette соответствующий объем(Таблица 3) предварительно подогретой среды, содержащей 10 МКм Y-27632 дигидрохлорид в каждой скважине.
  6. Поместите тарелку правой стороной внутри инкубатора культуры CO2 (5% CO2,37 градусов по Цельсию).
  7. Меняйте носители каждые 3-4 дня. После 5-7 дней, использовать среду культуры без 10 ММ Y-27632 дигидрохлорид для поддержания культур.

4. Формирование плавающего купола из прилагаемого круглого купола на плите

  1. После шага 3.7 отсоедините купол с помощью клеточного скребока.

5. Формирование плавающих бусин

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол назван как плавающие бусы, так как смесь мембраны подвала, носителей и органоидов выглядят как бисер.

  1. Вырезать 2 дюйма х 4 дюйма кусок парафиновой пленки.
  2. Поместите парафина пленка на верхней части divots пустой наконечник-держащий стойку из 1000 л пластиковых пипетки наконечник поле.
  3. Аккуратно нажмите на парафина фильм проследить divots с помощью перчаточного указательного пальца, но не пробивая парафина пленки.
  4. Спрей парафина пленка с 70% этанола и включите УФ лампы в клеточной культуре капот стерилизовать подготовленную пленку парафина, по крайней мере 30 минут.
  5. Приготовьте смесь клеток и 20 зл и мембраны подвала. Плотность посевов может сосена 50 000 - 250 000 клеток на купол.
  6. Пипетка смесь клеток, обработанных от шага 1 или 2, и 20 зл и л подвальной мембраны в форму divot формируется в подготовленной парафина пленки.
  7. Resuspend клетки гранулы в подвале мембраны и пипетки клеточной подвески в подготовленных парафин снимали divots.
  8. Поместите затвердевные бусы и парафина пленки в 6-колодец пластины. Один колодец в 6-хорошей пластине может поместиться до 5 шариков.
  9. Пипетка 3-5 мл предварительно подогретой среды, содержащей 10 мкм Y-27632 дигидрохлорид в каждом колодце в то время как мягко щеткой бисер от парафина пленки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В минимальном объеме рекомендуется 3 мл. Для максимального количества бусин (N-5) на скважину рекомендуется 5 мл среднего.
  10. Поместите тарелку в инкубатор CO2 (5% CO2,37 градусов по Цельсию).
  11. Меняйте органоидные носители каждые 3-4 дня. После 5-7 дней, использовать среду культуры без 10 ММ Y-27632 дигидрохлорид для поддержания культур.

6. In vivo органоидов изображение сшивания с помощью микроскопа8

ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые микроскопы не могут достичь внешнего периметра клеточной пластины (краевая стена); Поэтому мы предлагаем использовать скважины, расположенные по периметру клеточной пластины, при сшивке изображения.

  1. Поместите пластину культуры клеток в восходящем положении в держатель пластины в микроскоп Keyence.
  2. Поместите объектив в центр ею.
  3. Настройте процесс автоматического сшивания, выбрав количество кадров. Например, 3 х 3 или 5 х 5 могут быть выбраны для создания 9 изображений или 25 изображений в общей сложности.
  4. Нажмите кнопку захвата, чтобы инициировать процесс визуализации.
  5. Откройте программное обеспечение для просмотра изображений и загрузите группу изображений, сделанных шагом 4.
  6. Нажмите на сшивание изображения, чтобы создать сшитое изображение с высоким разрешением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Захват серийных 9 или 25 изображений может быть выполнен либо вручную, либо автоматически настроить, чтобы фокусировать ячейки.

7. Органоидная обработка гистологии: метод спин-дауна агарозы

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из предыдущей публикации Vlachogiannis и др.7. Мы добавили шаг с участием агарозы встраивания успешно вставлять все популяции органоидов.

  1. Удалите существующие носители из скважины. Будьте осторожны, чтобы не аспирировать подвальные мембранные купола.
  2. Добавьте равный (равный объем множеству носителей, удаленный со ступени 1) объема раствора восстановления клеток и инкубируйте в течение 60 мин при 4 градусах Цельсия.
  3. Выбить подвал мембранный купол с помощью пипетки и раздавить подвал мембранный купол с помощью трубчатого наконечника. Соберите разобщенный купол и раствор восстановления клеток в трубке длиной 1,5 мл.
  4. Центрифуга при 300 х г и 4 кв 5 мин.
  5. Удалите супернатант (решение восстановления клеток). Сохранить все супернацианты в отдельных трубах до конца, когда присутствие органоидов подтверждается в заключительном шаге гранулирования.
  6. Добавить желаемый объем (Таблица 3) холодной PBS и мягко пипетка вверх и вниз, чтобы механически беспокоить гранулы.
  7. Центрифуга при 300 х г и 4 кв 5 мин.
  8. Удалите супернатант (PBS).
  9. Исправьте гранулы в соответствующем объеме (например, 500 л для одной гранулы из 24 хорошо пластины культуры состоянии, Таблица 3) 4% ПФА в течение 60 минут при комнатной температуре.
  10. После фиксации, центрифуга на 300 х г и 4 кв кв в течение 5 мин.
  11. Удалите супернатант (PFA).
  12. Вымойте с соответствующим объемом (например, 500 л на одну гранулу из 24 хорошо пластины состояние культуры, Таблица 3) PBS и центрифуги на 300 х г и 4 КК в течение 5 мин.
  13. Подготовка теплой агарозы (2% агарозы в PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, пеллеты клетки для замороженных разделов можно сразу повторно приостановить в 200 ЗЛ соединения OCT без дальнейших шагов в Протоколе 7.
  14. Повторно приостановить клеточные гранулы в 200 зл агарозы (2% в PBS).
    1. Сразу же после добавления агарозы, осторожно отсоедините клеточные гранулы от стенки трубки 1,5 мл, используя 25 G иглу, прикрепленную к шприцу 1 мл. Как показано на рисунке 3, если клетка гранулы физически не отделены от стены 1,5 мл трубки, то есть риск потери всех или части клеточной гранулы во время процесса встраивания агарозы.
  15. Подождите, пока 2% агарозы в PBS полностью затвердевает.
  16. Отсоедините затвердеваемый блок агарозы из трубки 1,5 мл, используя 25 G иглу, прикрепленную к шприцу 1 мл.
  17. Перенесите отсоединенный блок агарозы, содержащий клеточные гранулы, в новую трубку 1,5 мл.
  18. Заполните трубку с 70% EtOH и продолжить работу с использованием обычного протокола для обезвоживания тканей и встраивания парафина.

8. Гистология и иммунофлооресцентная цитохимия (МФК) органоидов

  1. Выберите слайд (ы) для гистологии или МФК.
  2. Прежде чем начать процесс окрашивания, выяснить, где клетки расположены на слайде и нарисовать круг вокруг клеток на слайде с помощью маркера.
  3. Нарисуйте периметр вокруг края или бордера слайда и где круги расположены на слайде в лабораторном блокноте, чтобы записать их местоположение.
  4. Выполните желаемое окрашивание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого процесса, отмеченные круги исчезают, так как регулярный производитель не устойчив к химическим веществам. Даже некоторые гистологии постоянные маркеры могут быть стерты во время процесса окрашивания.
  5. После процесса окрашивания поместите слайд над рисунком в лабораторном блокноте, чтобы найти расположение клеток на слайде.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D органоиды были успешно созданы из пациента производных ксенотрансплантат (PDX) модель метастатического рака предстательной железы (BMPC), а также непосредственно из метастатического рака предстательной железы пациента(рисунок 4). Короче говоря, наши модели PDX BMPC были созданы путем внутри-бедренной (IF) инъекции опухолевых клеток в мужской Rag2-/- c-/- мышей, а затем PDX опухоли были собраны и обработаны, как описано в этой рукописи. Как показано на

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D органоиды, полученные из метастазов костей пациента раковых клеток предстательной железы по-прежнему относительно редки. Здесь мы описываем стратегии и дальнейший оптимизированный протокол для успешно говорутого серийного 3D-пациента, полученных из органов (PDF) BMPC. Кроме того, описаны протоколы для обеспечения органоидов в образцах с более низкой плотностью клеток для анализа МФк и IHC. Дифференциальные фенотипы в виде кисты, сфероидов и более сложных органоидов указывают на то, что этот протокол обеспечивает культ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Санги Ли и Кристина А.М. Джеймисон являются приглашенными редакторами коллекции Методов JoVE.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Благотворительным фондом Лео и Анны Альберт и Фондом JM. Мы благодарим Калифорнийского университета в Сан-Диего Мурс онкологический центр членов, д-р Цзин Ян и д-р Кей Т. Енг за предоставленную нам возможность использовать их микротомы и Рэндалл французский, Департамент хирургии для технических знаний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл ПипеттманГилсонF123602
1 мл шприцBD329654
1,5 мл тубаSpectrum Lab Продукция941-11326-ATP083
25G иглаBD PrecisionGlideигла 305122
4% параформальдегида (PFA)Alfa AesarJ61899
70% этанола (EtOH)VWRBDH1164-4LP
A83-01Tocris Bioscience2939
AccumaxInnovative Cell Technologies, Inc.AM105
adDMEMLife Technologies12634010
AgaroseLonza50000
Антитело к цитокератину 5Biolegend905901
Антитело к цитокератину 8Biolegend904801
B27Life Technologies17504044
Биолюминесцентная система визуализации, IVIS 200Perkin Elmer IncIVIS 200
Cell Culture Plate - 24 лункиCostar3524
Cell Culture Plate - 48 лунокCostar3548
Cell Culture Plate - 6 лунокCostar3516
Решение для диссоциации клеток, AccumaxInnovative Cell Technologies, Inc.AM105
Решение для восстановления клетокCorning354253
скребок для клетокSarstedt83.180
Сетчатый фильтр для клетокFalcon (Corning)352350
CO2 инкубаторFisher Scientific3546
DAPIVector VectashieldH-1200
DHTSigma-AldrichD-073-1ML
dPBSCorning/Cellgro21-031-CV
EGFPeproTechAF-100-15
FBSGemini Bio-Products100-106
FGF10PeproTech100-26
FGF2PeproTech100-18B
ЩипцыDenville ScientificS728696
GlutamaxGibco35050-061
HEPESGibco15630-080
LSКолонки Miltenyi130-0420401
Магнитный сепаратор колонок: QuadroMACSСепаратор Miltenyi130-090-976
МаркерVWR52877-355
Matrigel (снижение фактора роста)Mediatech Inc. (Corning)
Matrigel (высокая концентрация)BD (Fisher Scientific)CB354248
программное обеспечение для визуализации микроскопа, KeyenceBZ-X800 (новейшее программное обеспечение) BZ-X700 (старое программное обеспечение)
Микроскоп, KeyenceBZ-X700 (модель 2016-2017)/BZ-X710 (модель 2018-2019)
Набор для истощения клеток мышиMiltenyi130-104-694
N-ацетилцистеинSigma-AldrichA9165-5G
никотинамидSigma-AldrichN0636-100G
NogginPeproTech120-10C
OCT CompoundTissue-Tek4583
ParafilmAmerican National CanN/A
Pen-StrepMediatech Inc. (Corning)30-002-CI-1
Наконечники для пипеток на 1 мл (синие наконечники)Поршень Fisherbrand Redi-Tip21-197-85
(от шприца объемом 3 мл)Шприц BD309657
простагландином E2Tocris Bioscience2296
R-Spondin 1Trevigen3710-001-01
SB2021190Sigma-AldrichS7076-25MG
Маленькая настольная столешница ЦентрифугаThermoFisher Scientific75002426
водяная баняFisher Sci2320
Y-27632 ДигидрохлоридAbmole BioscienceM1817
356231

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  2. Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
  3. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  4. McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051(2019).
  5. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  6. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  7. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  8. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  9. Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
  10. Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
  11. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
  12. Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  13. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404(2018).
  14. Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
  15. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
  16. Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
  17. Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275(2014).
  18. Keyence Fluorescence Microscope. , Keyence Corporation. Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Prostate Cancer Organoids3D Organoid CulturePatient Derived OrganoidsBone Metastasis ModelsDoming TechniqueBasement Membrane CultureOrganoid Histology ProcessingImmunofluorescent CytochemistryDrug Resistance TestingWestern Blot Applications

Похожие статьи