Создание и анализ трехмерных (3D) органоидов, полученных из метастазов костной ткани рака простаты Исты и их Ксенотранспланты

Трехмерные культивированные органоиды обратили внимание на их потенциал для повторения архитектуры in vivo, клеточной функциональности и генетической подписи их оригинальных тканей^1,2,3,4,5. Самое главное, 3D органоиды, установленные из опухолевых тканей пациента или пациента производных ксенотрансплантата (PDX) модели предоставляют бесценные возможности для понимания механизмов клеточной сигнализации при опухолевом и определить влияние медикаментозного лечения на каждую популяцию клеток^{6,7,8,9,10,11,12,13}. Drost et al.⁵ разработали стандартный протокол для создания органов простаты человека и мыши, который был широко принят в области урологии. Кроме того, значительные усилия были направлены на дальнейшую характеристику 3D-органоидов и понимание детальных механизмов опухолевого и метастазов^4,12,14,15. В дополнение к ранее установленному и широко принятому протоколу для культур 3D органоидов, мы описываем здесь пошаговой протокол для 3D-культуры PDO, используя три различных метода доминга в оптимизированных условиях культуры.

В этой рукописи, 3D органоиды были созданы в качестве модели ex vivo кости метастатического рака предстательной железы (BMPC). Клетки, используемые для этих культур пришли из рака предстательной железы Сан-Диего (PCSD) серии и были получены непосредственно из метастатического рака простаты метастатических опухолевых тканей (PCSD18 и PCSD22) или пациента производные ксенотрансплантат (PDX) опухоли модели (образцы под названием PCSD1, PCSD13, и PCSD17). Потому что спонтанные метастазы костной ткани раковых клеток редко в генетически модифицированных моделей мыши¹⁶, мы использовали прямую внутри-femoral (IF) инъекции человеческих опухолевых клеток в мужской Rag2^-/-КК^-/- мышей для создания PDX модели кости метастатического рака предстательной железы¹⁷.

После того, как 3D органоиды устанавливаются из неоднородных опухолевых клеток пациента или пациента, полученных ксенотрансплантатов, важно, чтобы подтвердить их идентичность в качестве клеток опухоли простаты и определить их фенотипы в 3D органоидных культур. Иммунофлуоресценция химии (IFC) позволяет визуализации экспрессии белка на месте в каждой клетке, часто с указанием потенциальных функций для конкретных популяций клеток^2,4. В целом протоколы МФЦ для подавляющего большинства образцов, включая ткани и клетки, просты и полностью оптимизированы. Однако плотность клеток и количество органоидов могут быть значительно ниже, чем у обычной культуры. Поэтому протокол МФК для органоидов требует дополнительных шагов для обеспечения надлежащей обработки и встраивания в парафин для всех органоидов в образцах. Мы описываем дополнительные шаги для процесса предварительного встраивания агарозы и советы по обозначения расположения разделенных органоидов на слайде, что увеличивает показатель успеха МФК на органоидов, особенно когда образцы органоидов имеют более низкую плотность клеток, чем хотелось бы.

Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в Руководстве для Совета по институциональному обзору Калифорнийского университета в Сан-Диего (UCSD). IRB #090401 одобрение было получено от UCSD Институциональный обзор совета (IRB) для сбора хирургического образца от пациентов для исследовательских целей. От каждого пациента было получено информированное согласие, и в результате ортопедического ремонта патологического перелома бедренной кости был получен хирургический образец метастазрака рака простаты. Протоколы животных были выполнены в соответствии с Калифорнийским университетом в Сан-Диего (UCSD) защиты животных и институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC) утвержденный протокол #S10298. Клетки механически и ферментативно диссоциированной ткани опухоли пациента были внутри-femorally введены в 6 до 8 недель мужчина Rag2^-/-; q_c^-/- мышей, как ранее описано¹⁷. Объем опухоли Xenograft был определен с помощью системы визуализации биолюминесценции in vivo и измерений калибра. При росте опухоли до 2,0 см (максимально допустимый размер одобрен IACUC), опухоль была собрана для установки 3D-органоидов.

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показан рабочий процесс для установления 3D органоидов и протокольный номер для каждого шага экспериментальных процедур.

1. Обработка производных ксенотрансплантата (PDX) опухолевых тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Это первый шаг для органоидного создания опухоли, полученной из модели ксенотрансплантатмыши. Этот протокол адаптирован из предыдущей публикации Drost et al.^5, и мы изменили условия сми, включив добавки сыворотки к органоидным носителям.

1. Обработайте образец опухоли, как описано ниже.
   1. Образцы опухоли фарша до 1-3 мм³ размера штук и переварить образцы с 10 мл раствора диссоциации клеток в течение 45 минут при комнатной температуре.
   2. Чтобы прекратить пищеварение, добавьте 20 мл полного носителя DMEM в образцы.
   3. Фильтр подвески через 70 мкм ячейки ситечко. Используйте стерильный поршень фланг, чтобы подтолкнуть любые остатки ткани на вершине 70 мкм ячейки ситечко.
   4. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
   5. Вымойте клеточные гранулы три раза со свежимa adMEM полный носителей. Соподогвайте объем средств для мытья и повторного свистого с объемом носителей, предложенных в таблице 3. Например, для 24 хорошо пластины культуры состояние, объем для стирки должно быть 500 зл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано в таблице 3,протокол применим к различным условиям культуры.
   6. Определить окончательные количество клеток с помощью трипан синий краситель и гемоситометр.
   7. После получения клеток рассчитывает, повторно приостановить клеточные гранулы в 80 Зл 2 00 FBS в PBS на 2 х 10⁶ опухолевых клеток.
   8. Добавьте 20 злитровых коктейлей для истощения мышей на 2 x 10⁶ опухолевых клеток. Хорошо перемешайте и инкубировать в течение 15 мин при 2-8 градусах Цельсия.
   9. Отрегулируйте громкость до 500 кЛ с 2% FBS в буфере PBS на 2 х 10⁶ опухолевых клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: До 1 х 10⁷ опухолевых клеток в 2,5 мл клеточной суспензии могут быть обработаны на одной колонке LS.
   10. Загрузите колонны LS на магнитный сепаратор колонны и поместите коническую трубку 15 мл на стойку под ним, чтобы собрать поток через.
   11. Промыть каждый столбец с 3 мл 2% FBS в буфере PBS. Откажитесь от конической трубки с промывкой и замените новой, стерильной конической трубкой 15 мл.
   12. Добавьте на колонку клеточную суспензию (до 2,5 мл из 1 х 10⁷ опухолевых клеток). Сбор потока через которые будут обогащены человеческими опухолевыми клетками.
   13. Вымойте столбец дважды с 1 мл 2% FBS в буфере PBS.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выполнять шаги мытья, как только столбец пуст. Кроме того, старайтесь избегать образования пузырьков воздуха.
2. Aliquot соответствующий объем подвески клетки до трубки 1.5 mL для пожеланной установки культуры(таблица 3).
3. Центрифуга 1,5 мл трубки на 300 х г и 4 КК в течение 5 мин.
4. Тщательно удалите и отбросьте супернатант.

2. Обработка первичных опухолевых тканей пациента

ПРИМЕЧАНИЕ: Это первый шаг для органоидного истеблишмента.

1. Следуйте всем шагу 1, за исключением процесса истощения клеток мыши, который не является необходимым для обработки первичных опухолевых тканей пациента.

3. Формирование прилагаемого круглого купола на тарелке

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта рукопись описывает три способа сделать купол из смеси клеточных гранул и мембраны подвала (например, Matrigel), как показано на рисунке 1 и рисунке 2. В шагах 2-4, клетки и мембрана подвала должны быть сдержаны на льду для того чтобы предотвратить затвердевание мембраны подвала.

1. Приостановите действие клеточной гранулы в соответствующем объеме мембраны подвала (например, 40 л) для 24 хорошо настроенной пластины(таблица 3).
2. Pipette вверх и вниз нежно для того чтобы обеспечить что клетки re-suspended наилучшим образом в мемне подвала.
3. Pipette соотвествующее тома (Таблица 3) смеси мембраны клетки-подвала (и факультативного 10 l adDMEM вполне средств) в центр pre-warmed плиты культуры ткани.
4. Перевернуть пластину и сразу же поместите пластину вверх дном в инкубатор культуры CO_2, установленный на уровне 5% CO_2,37 градусов по Цельсию в течение 15 мин. Это предотвращает клетки от урегулирования и прилипания к нижней пластины, позволяя мембраны подвала затвердеть.
5. Pipette соответствующий объем(Таблица 3) предварительно подогретой среды, содержащей 10 МКм Y-27632 дигидрохлорид в каждой скважине.
6. Поместите тарелку правой стороной внутри инкубатора культуры CO₂ (5% CO_2,37 градусов по Цельсию).
7. Меняйте носители каждые 3-4 дня. После 5-7 дней, использовать среду культуры без 10 ММ Y-27632 дигидрохлорид для поддержания культур.

4. Формирование плавающего купола из прилагаемого круглого купола на плите

1. После шага 3.7 отсоедините купол с помощью клеточного скребока.

5. Формирование плавающих бусин

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол назван как плавающие бусы, так как смесь мембраны подвала, носителей и органоидов выглядят как бисер.

1. Вырезать 2 дюйма х 4 дюйма кусок парафиновой пленки.
2. Поместите парафина пленка на верхней части divots пустой наконечник-держащий стойку из 1000 л пластиковых пипетки наконечник поле.
3. Аккуратно нажмите на парафина фильм проследить divots с помощью перчаточного указательного пальца, но не пробивая парафина пленки.
4. Спрей парафина пленка с 70% этанола и включите УФ лампы в клеточной культуре капот стерилизовать подготовленную пленку парафина, по крайней мере 30 минут.
5. Приготовьте смесь клеток и 20 зл и мембраны подвала. Плотность посевов может сосена 50 000 - 250 000 клеток на купол.
6. Пипетка смесь клеток, обработанных от шага 1 или 2, и 20 зл и л подвальной мембраны в форму divot формируется в подготовленной парафина пленки.
7. Resuspend клетки гранулы в подвале мембраны и пипетки клеточной подвески в подготовленных парафин снимали divots.
8. Поместите затвердевные бусы и парафина пленки в 6-колодец пластины. Один колодец в 6-хорошей пластине может поместиться до 5 шариков.
9. Пипетка 3-5 мл предварительно подогретой среды, содержащей 10 мкм Y-27632 дигидрохлорид в каждом колодце в то время как мягко щеткой бисер от парафина пленки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В минимальном объеме рекомендуется 3 мл. Для максимального количества бусин (N-5) на скважину рекомендуется 5 мл среднего.
10. Поместите тарелку в инкубатор CO₂ (5% CO_2,37 градусов по Цельсию).
11. Меняйте органоидные носители каждые 3-4 дня. После 5-7 дней, использовать среду культуры без 10 ММ Y-27632 дигидрохлорид для поддержания культур.

6. In vivo органоидов изображение сшивания с помощью микроскопа⁸

ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые микроскопы не могут достичь внешнего периметра клеточной пластины (краевая стена); Поэтому мы предлагаем использовать скважины, расположенные по периметру клеточной пластины, при сшивке изображения.

1. Поместите пластину культуры клеток в восходящем положении в держатель пластины в микроскоп Keyence.
2. Поместите объектив в центр ею.
3. Настройте процесс автоматического сшивания, выбрав количество кадров. Например, 3 х 3 или 5 х 5 могут быть выбраны для создания 9 изображений или 25 изображений в общей сложности.
4. Нажмите кнопку захвата, чтобы инициировать процесс визуализации.
5. Откройте программное обеспечение для просмотра изображений и загрузите группу изображений, сделанных шагом 4.
6. Нажмите на сшивание изображения, чтобы создать сшитое изображение с высоким разрешением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Захват серийных 9 или 25 изображений может быть выполнен либо вручную, либо автоматически настроить, чтобы фокусировать ячейки.

7. Органоидная обработка гистологии: метод спин-дауна агарозы

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из предыдущей публикации Vlachogiannis и др.⁷. Мы добавили шаг с участием агарозы встраивания успешно вставлять все популяции органоидов.

1. Удалите существующие носители из скважины. Будьте осторожны, чтобы не аспирировать подвальные мембранные купола.
2. Добавьте равный (равный объем множеству носителей, удаленный со ступени 1) объема раствора восстановления клеток и инкубируйте в течение 60 мин при 4 градусах Цельсия.
3. Выбить подвал мембранный купол с помощью пипетки и раздавить подвал мембранный купол с помощью трубчатого наконечника. Соберите разобщенный купол и раствор восстановления клеток в трубке длиной 1,5 мл.
4. Центрифуга при 300 х г и 4 кв 5 мин.
5. Удалите супернатант (решение восстановления клеток). Сохранить все супернацианты в отдельных трубах до конца, когда присутствие органоидов подтверждается в заключительном шаге гранулирования.
6. Добавить желаемый объем (Таблица 3) холодной PBS и мягко пипетка вверх и вниз, чтобы механически беспокоить гранулы.
7. Центрифуга при 300 х г и 4 кв 5 мин.
8. Удалите супернатант (PBS).
9. Исправьте гранулы в соответствующем объеме (например, 500 л для одной гранулы из 24 хорошо пластины культуры состоянии, Таблица 3) 4% ПФА в течение 60 минут при комнатной температуре.
10. После фиксации, центрифуга на 300 х г и 4 кв кв в течение 5 мин.
11. Удалите супернатант (PFA).
12. Вымойте с соответствующим объемом (например, 500 л на одну гранулу из 24 хорошо пластины состояние культуры, Таблица 3) PBS и центрифуги на 300 х г и 4 КК в течение 5 мин.
13. Подготовка теплой агарозы (2% агарозы в PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, пеллеты клетки для замороженных разделов можно сразу повторно приостановить в 200 ЗЛ соединения OCT без дальнейших шагов в Протоколе 7.
14. Повторно приостановить клеточные гранулы в 200 зл агарозы (2% в PBS).
    1. Сразу же после добавления агарозы, осторожно отсоедините клеточные гранулы от стенки трубки 1,5 мл, используя 25 G иглу, прикрепленную к шприцу 1 мл. Как показано на рисунке 3, если клетка гранулы физически не отделены от стены 1,5 мл трубки, то есть риск потери всех или части клеточной гранулы во время процесса встраивания агарозы.
15. Подождите, пока 2% агарозы в PBS полностью затвердевает.
16. Отсоедините затвердеваемый блок агарозы из трубки 1,5 мл, используя 25 G иглу, прикрепленную к шприцу 1 мл.
17. Перенесите отсоединенный блок агарозы, содержащий клеточные гранулы, в новую трубку 1,5 мл.
18. Заполните трубку с 70% EtOH и продолжить работу с использованием обычного протокола для обезвоживания тканей и встраивания парафина.

8. Гистология и иммунофлооресцентная цитохимия (МФК) органоидов

1. Выберите слайд (ы) для гистологии или МФК.
2. Прежде чем начать процесс окрашивания, выяснить, где клетки расположены на слайде и нарисовать круг вокруг клеток на слайде с помощью маркера.
3. Нарисуйте периметр вокруг края или бордера слайда и где круги расположены на слайде в лабораторном блокноте, чтобы записать их местоположение.
4. Выполните желаемое окрашивание.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого процесса, отмеченные круги исчезают, так как регулярный производитель не устойчив к химическим веществам. Даже некоторые гистологии постоянные маркеры могут быть стерты во время процесса окрашивания.
5. После процесса окрашивания поместите слайд над рисунком в лабораторном блокноте, чтобы найти расположение клеток на слайде.

3D органоиды были успешно созданы из пациента производных ксенотрансплантат (PDX) модель метастатического рака предстательной железы (BMPC), а также непосредственно из метастатического рака предстательной железы пациента(рисунок 4). Короче говоря, наши модели PDX BMPC были созданы путем внутри-бедренной (IF) инъекции опухолевых клеток в мужской Rag2-/- c-/- мышей, а затем PDX опухоли были собраны и обработаны, как описано в этой рукописи. Как показано на рисунке 4, PDX опухолевых тканей из серии PCSD привело к 3D органоидов с дифференциальными фенотипами, которые проявляются как кисты, сфероиды и более высокой сложности органоидов, которые образуются с помощью этого протокола.

Сшитое изображение с 25 изображений с высоким разрешением 10x увеличение показало весь купол мембраны подвала и органоидов(рисунок 5). Используя программное обеспечение для анализа изображений, можно сортировать ячейки или клеточные кластеры, которые больше определенного размера или вручную выбрать сфероиды или кисты.

Шаги для агарозы встраивания органоидных культур и советы по обозначения расположения разделенных органоидов на слайде увеличивают успех выполнения МФЦ на органоидах, особенно когда образцы органоидов имеют более низкую плотность клеток, чем хотелось бы. На рисунке 6 показан пример МФК на секции парафина толщиной 5 мкм органоидов, нацеленных на цитокератин 5 (CK5, базальный эпителиальный маркер), цитокератин 8 (CK8, светящийся эпителиальный маркер) и DAPI.

Рисунок 1: Создание и характеристика для 3D культурных органоидов, полученных либо из тканей опухоли пациента или пациента производного ксенотрансплантата (PDX) опухолевых тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Методологии для формирования смеси клеточных гранул и мембраны подвала. Прилагаемый купол(a),плавающий купол(b)и плавающие бусы(c). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Ключевой шаг для успешного встраивания агарозы. Процесс отсоединения клеточной гранулы от стенки трубки 1,5 мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Дифференциальные фенотипы органоидов из серии опухолей PCSD PDX, которая включает в себя одиночные клетки, кисты, сфероиды и органоиды более высокой сложности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Пример сырого сшитого изображения из общего числа 25 изображений с высоким разрешением и его применение для последующего анализа для подсчета количества ячеек или измерения площади клеток/клеточных кластеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 6: Изображение, показывающее CK5 и CK8 IFC окрашенных органов PCSD1 (5 мкм толщиной парафиновой секции). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1: AdMEM/F12 //- Подготовка. Эта таблица была ранее опубликована Drost et al.5.

Таблица 2: Компоненты для C/S Human Media - 10% FBS. Эта таблица была ранее опубликована Drost et al.5.

Таблица 3: Плотность посева, объем мембраны в подвале и средний объем, необходимый для одного купола. Эта таблица изменена из предыдущей публикации Drost et al.5.

Санги Ли и Кристина А.М. Джеймисон являются приглашенными редакторами коллекции Методов JoVE.