Method Article

Изготовление и внедрение платформы микроскопии безсправочной тяговой силы

DOI:

10.3791/60383

⸱

October 6th, 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science & Engineering, University of Delaware, 3Delaware Biotechnology Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол содержит инструкции по внедрению мультифотонной литографии для изготовления трехмерных массивов флуоресцентных фидуциальных маркеров, встроенных в поли (этиленгликоль) на основе гидрогелей для использования в качестве эталонной, свободной от тяги, микроскопии силы тяги Платформ. Используя эти инструкции, измерение напряжения 3D-материала и расчет клеточных тягу упрощается для содействия измерениям силы тяги с высокой пропускной связью.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количественная деформация материала, вызванная клетками, дает полезную информацию о том, как клетки чувствуют и реагируют на физические свойства своей микросреды. Хотя существует много подходов для измерения клеточного штамма материала, здесь мы предоставляем методологию мониторинга штамма с суб-микроном резолюции в безсправочной манере. Используя двухфотонный активированный процесс фотолитографического узора, мы демонстрируем, как генерировать механически и биоактивно настраиваемые синтетические субстраты, содержащие встроенные массивы флуоресцентных фидуциальных маркеров, чтобы легко измерить трехмерные ( 3D) профили деформации материала в ответ на поверхностные тяги. Используя эти субстраты, профили натяжения ячеек можно отобразить с помощью одного 3D-изображения, стек ячейки интереса. Наша цель с этой методологией, чтобы сделать тяговую силовую микроскопию более доступным и легким для реализации инструмента для исследователей, изучающих процессы клеточного механотрансдукции, особенно новичков в этой области.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроскопия силы тяги (TFM) процесс приближения клеточных тяг с использованием интерполированных полей смещения фидуциальных маркеров, генерируемых адептом и сократительной клеткой. Использование TFM, влияние механических сигналов в внеклеточной среде на важные клеточные процессы, такие как пролиферация, дифференциация и миграция могут быть исследованы1,2,3,4 ,5,6,7,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Фотополимеризация базового гидрогеля PEGDA

  1. Сбор реагентов
    1. Соберите финил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат (LAP), 3,4 kDa поли (этилен) гликол диакрилат (PEGDA), n-виниловый пи Рролидон (NVP), AlexaFluor 488 помечены PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 помечены PEGDA (PEG-633), и PEGylated RGDS пептид ( PEG-RGDS) из соответствующих морозильных ящиков и довести каждый до комнатной температуры.
    2. В отдельных янтарных микроцентрифуговых трубках измеряйте 3 мг LAP, 10 мг ПЕГДА, 5 мг ПЭГ-488, 20 мг ПЕГ-633 и 6 мг пептида RGDS.
  2. Подготовка дополимерного раствора
    1. Растворите LAP в 1 мл....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На протяжении всего протокола существует ряд контрольно-пропускных пунктов, обеспечивающих обратную связь для оценки качества процедуры шаблонирования. Чтобы дать некоторое представление о том, как оценить прогресс на каждом из этих контрольно-пропускных пунктов, мы предоставляем репрезентативные результаты фактического эксперимента. Результаты подчеркивают применение этого протокола, выполненного на фотопаттерированном гидрогеле, подготовленном для анализа TFM эндотелиальных клеток пуповины человека (HUVECs). Результаты.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью этого протокола является предоставление рабочего процесса, который значительно облегчает трудности, связанные с генерацией и анализом данных TFM. После подготовки гидрогели с фотопаттерированными являются простыми в использовании, требующими только знания стандартных методов культуры тканей и флуоресценции микроскопии. Безсправочный аспект обеспечивает беззаботную навигацию по гидрогелям, нагруженным ячейками, и устраняет громоздкие шаги обработки изображений, такие как регистрация изображений между ссылками и дефо.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

О. А. Банда была поддержана финансированием из NSF IGERT SBE2 стипендий (1144726), запуск средств, предоставленных Университетом Штата Делавэр, и Национальные институты здравоохранения / Национальный институт рака ИМАТ программы (R21CA214299). JHS поддерживается за счет финансирования со стороны Национальных институтов здравоохранения / Национальный институт рака IMAT программы (R21CA214299) и Национальный научный фонд CAREER Award Program (1751797). Доступ к микроскопии был поддержан грантами NIH-NIGMS (P20 GM103446), NSF (IIA-1301765) и штата Делавэр. Структурированный подсветка микроскоп был приобретен на средства из штата Делавэр Федеральной программы исследований....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Шприцевой фильтр Acrodisc, 0,2 шт; m Supor Membrane, Pall с низким связыванием белковPallPN 4602Позволяет фильтровать растворы макромеров перед синтезом базового геля и последующими этапами литографии.
Акрилатно-силановый функционализированный #1.5 Coverslipsin-house<em>in-houseАкрилаты позволяют связывать базовый гидрогель с поверхностью стекла для иммобилизации гидрогелей. Смотрите справку: 21-24
Axio-Observer Z1 с широкоугольным микроскопом ApotomeZeissс модулем структурированного освещения, используемым для захвата изображений для TFM.
Хамелеон Вижн IIКогерент Инк.Оснащен лазерно-сканирующим микроскопом, используемым для многофотонной литографии.
Лента с двойным покрытием, 9500 шт., 6,0 мил3MСвязывает акрилатно-силановые функциональные покровные стекла с чашками Петри.
Flexmark90 PFW LinerFLEXconFLX000620Позволяет прокладывать ленту с двойным покрытием, что позволяет подавать ленту в плоттер.
LSM-880Zeiss,используемый для многофотонной литографии.
MATLABMathworksR2018aЗапускает пользовательские скрипты для генерации инструкций по литографии для микроскопа и для анализа данных TFM.
Модель SC PlotterUSCutterSC631EРазрезает ленту с двойным покрытием на кольца, чтобы прикрепить покровные стекла к чашкам Петри.
Объектив C-Apochromat 40x/1,20 Вт Corr M27ZeissОснащен как широкопольным микроскопом, так и лазерным сканирующим микроскопом для использования как для литографии, так и для TFM.
PEG-AF633in-housein-houseФлуорофорный меченый акрилатный вариант PEG для создания реперных точек. Смотрите ссылку: 21
PEG-DAem>in-housein-houseБазовый материал для гидрогелей. См. ссылку: 21
PEG-RGDSem>in-houseemin-houseRGDSмеченый пептидом моноакрилатный вариант PEG для стимулирования клеточной адгезии. Смотрите справку: 21
чашка ПетриCELLTREAT229638В центре каждой посуды с помощью сверла для отбора керна вырезаются отверстия диаметром 8 мм, чтобы они поместились в гидрогели на основе.
Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеровDow Corning3097358-1004Для создания прокладок для контроля толщины базового гидрогеля (также известного как PDMS).
Шприц, Leur-Lok, 1 млBD309628Позволяет фильтровать растворы макромеров перед синтезом базового геля и последующими этапами литографии.
УФ-лампаУВПBlak-Ray® B-100APПолимеризует базовую гидрогелевую основу.
1-винил-2-пирролидинон (NVP)Sigma-AldrichV3409-5GРадикальный ускоритель и сомономер. Улучшает встраивание пегилированного флуорофора при литографии.
Лазерный сканирующий микроскоп <<

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex. Cell. 158 (1), 143-156 (2014).
  2. Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Traction Force MicroscopyReference Free PlatformMultiphoton LithographyHydrogel FabricationFluorescent Fiducial Markers3D Material DeformationCell Tension MappingTwo Photon PatterningZ Stack ImagingDisplacement Analysis

Related Articles