Method Article

Изготовление и внедрение платформы микроскопии безсправочной тяговой силы

DOI:

10.3791/60383

⸱

October 6th, 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Department of Materials Science & Engineering, University of Delaware, 3Delaware Biotechnology Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол содержит инструкции по внедрению мультифотонной литографии для изготовления трехмерных массивов флуоресцентных фидуциальных маркеров, встроенных в поли (этиленгликоль) на основе гидрогелей для использования в качестве эталонной, свободной от тяги, микроскопии силы тяги Платформ. Используя эти инструкции, измерение напряжения 3D-материала и расчет клеточных тягу упрощается для содействия измерениям силы тяги с высокой пропускной связью.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количественная деформация материала, вызванная клетками, дает полезную информацию о том, как клетки чувствуют и реагируют на физические свойства своей микросреды. Хотя существует много подходов для измерения клеточного штамма материала, здесь мы предоставляем методологию мониторинга штамма с суб-микроном резолюции в безсправочной манере. Используя двухфотонный активированный процесс фотолитографического узора, мы демонстрируем, как генерировать механически и биоактивно настраиваемые синтетические субстраты, содержащие встроенные массивы флуоресцентных фидуциальных маркеров, чтобы легко измерить трехмерные ( 3D) профили деформации материала в ответ на поверхностные тяги. Используя эти субстраты, профили натяжения ячеек можно отобразить с помощью одного 3D-изображения, стек ячейки интереса. Наша цель с этой методологией, чтобы сделать тяговую силовую микроскопию более доступным и легким для реализации инструмента для исследователей, изучающих процессы клеточного механотрансдукции, особенно новичков в этой области.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроскопия силы тяги (TFM) процесс приближения клеточных тяг с использованием интерполированных полей смещения фидуциальных маркеров, генерируемых адептом и сократительной клеткой. Использование TFM, влияние механических сигналов в внеклеточной среде на важные клеточные процессы, такие как пролиферация, дифференциация и миграция могут быть исследованы1,2,3,4 ,5,6,7,9,10,11,12. К сожалению, многие существующие подходы могут быть трудными для реализации или требуют знакомства с узкоспециализированными аналитическими и вычислительными инструментами, что затрудняет использование TFM неопытным исследователям. Мы описываем методологию создания платформы TFM, которая устраняет некоторые трудности в анализе, а также обеспечивает высокопроизводительные данные.

Из существующих подходов TFM, наиболее часто используемых для количественной нагрузки материала включает в себя включение небольших флуоресцентных маркеров (обычно нано- или микрометрового флуоресцентного бисера) в деформируемый гидрогель, такие как полиакриламид (PAA) или поли (этиленгликоль) диакрилат (PEGDA)13,14,15. Эти подходы на основе бисера обеспечивают возможность плотно кластерного кластера фидуциальных маркеров вокруг ячейки, представляющие интерес для максимального смещения выборки. К сожалению, распространение бисера по всему гидрогелю не может быть непосредственно контролируется, поэтому пространственная организация является случайной. Это случайное размещение приводит к таким проблемам, как бусы, которые находятся слишком близко друг к другу, чтобы точно решить, или так распространения, что патчи субстрата дают низкое качество данных. Неспособность предсказать, где фидуциальные маркеры лежат в отсутствие клеток также создает ограничение, что для каждого собранного набора данных тяги клетки, дополнительное эталонное изображение основных маркеров в расслабленном состоянии также должны быть захвачены. Эталонное изображение необходимо для того, чтобы смещение в подчеркнутом изображении можно было приблизить как различие между подчеркнутыми и неподчеркнутыми изображениями. Для достижения расслабленного состояния, измеряемые клетки либо химически расслаблены, либо полностью удалены. Этот процесс часто препятствует приобретению дальнейших экспериментальных измерений, тормозит долгосрочные исследования клеток и ограничивает пропускную стоимость. Ссылка на изображение также требует методов регистрации изображений для размещения для дрейфа, которые могут иметь место во время экспериментов, часто приводит к громоздким ручное сопоставление изображений состояния стресса для ссылки изображений.

Другие методы TFM считается ссылка бесплатно, осуществлять ту или иную форму контроля над распределением фидуциальных маркеров, либо с высоким разрешением литографии, микроконтактной печати, или микромолдинг16,17,18 ,19,20. Безсправочный TFM достигается за счет предположения, что расслабленное состояние для каждого фидуциального маркера может быть предсказано на основе того, как маркер позиции были предписаны в процессе изготовления. Эти методы позволяют полностью зафиксировать состояние напряжения ячейки в пределах одного захвата изображения, в котором фидуциальные смещения маркера измеряются по сравнению с подразумеваемой ссылкой, чем можно сделать вывод из фидуциальной геометрии маркера. Хотя согласованность в размещении маркеров обычно достигается с помощью этих платформ, они, как правило, страдают от собственных недостатков по сравнению с широко используемыми подходами на основе биса, включая: 1) снижение разрешения тяги; 2) снижение точности перемещений вне плана (в некоторых случаях полная неспособность измерить); и 3) снижение настраиваемости субстратов и материалов платформы (например, презентация лиганда, механические свойства).

Для устранения этих недостатков мы разработали новую платформу TFM без справочных данных. Платформа использует мультифотонный активированный химию, чтобы перекрестно перекрестно небольшой объем фторофора в конкретные 3D места в гидрогеле, которые служат фидуциальными маркерами для измерения напряжения материала. Таким образом, мы разработали платформу, которая работает так же, как бис основе подходов, но со значительным преимуществом, что фидуциальные маркеры организованы в сетчатые массивы, позволяющие для ссылки свободной отслеживания штамма материала. Эта безсправочная собственность дает много преимуществ. В первую очередь, он позволяет неинтрузивный мониторинг клеточных состояний тяги (т.е. обойти необходимость расслабиться или удалить клетки для получения эталонных позиций смещенных фидуциальных маркеров). Это было нашей главной целью в разработке этой системы, поскольку мы намеревались включить другие аналитические методы вниз по течению в тандеме с TFM, что может быть трудно с разрушительными подходами ТФМ. Во-вторых, использование подразумеваемой ссылки, основанной на сетчатых массивах, позволяет практически полностью автоматизировать анализ смещения. Регулярность массивов создает предсказуемый рабочий процесс, в котором возникновение исключительных случаев (т.е. данные ячейки образца, содержащие непредвиденные артефакты, такие как неоптимальный интервал между маркером или несоответствия регистрации) могут быть сохранены как минимум. В-третьих, отсутствие необходимости получения эталонного изображения обеспечивает свободу мониторинга многих ячеек на одном образце в течение длительных периодов времени. Это контрастирует с традиционными подходами на основе биса, где, в зависимости от точности автоматизированных этапных движений микроскопа, ошибки в позиционировании могут накапливаться и увеличивать сложность правильной регистрации эталонных изображений на напряжение клеток Изображения. В целом, эта платформа облегчает более высокую пропускную связь в сборе данных о сотовой напряженности.

С помощью этого протокола, мы надеемся ознакомить читателей с двумя фотона, лазерное сканирование литографии техники, которые мы реализовали для создания этой эталонной платформы TFM для измерения в плоскости и вне плоскости тяги компонентов, генерируемых клетками посеяны на поверхности. Не охваченный в этом протоколе синтез некоторых мономерных компонентов. В целом, эти реакции включают почти идентичные "один горшок" синтеза схемы реакции, описанные ранее21, и альтернативы этим продуктам также могут быть приобретены. Мы также стремимся ознакомить читателей с программными средствами, которые мы создали для содействия использованию коммерчески доступных лазерных сканирующих микроскопов в качестве инструментов 3D-печати и для облегчения анализа фидуциальных смещений маркеров.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Фотополимеризация базового гидрогеля PEGDA

  1. Сбор реагентов
    1. Соберите финил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат (LAP), 3,4 kDa поли (этилен) гликол диакрилат (PEGDA), n-виниловый пи Рролидон (NVP), AlexaFluor 488 помечены PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 помечены PEGDA (PEG-633), и PEGylated RGDS пептид ( PEG-RGDS) из соответствующих морозильных ящиков и довести каждый до комнатной температуры.
    2. В отдельных янтарных микроцентрифуговых трубках измеряйте 3 мг LAP, 10 мг ПЕГДА, 5 мг ПЭГ-488, 20 мг ПЕГ-633 и 6 мг пептида RGDS.
  2. Подготовка дополимерного раствора
    1. Растворите LAP в 1 мл фосфатного буферного солья (PBS, рН 7.4). Используйте 200 л растворенного растворенного раствора LAP для растворения PEGDA. Затем используйте 200 зл раствора PEGDA для растворения PEG-RGDS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если контроль формы клетки желательно, опустить растворения PEG-RGDS в базовом растворе гидрогеля до полимерного, так как он будет добавлен через два фотона, лазерное сканирование литографии позже в протоколе.
    2. Используйте 80 л PBS для растворения PEG-488. Добавьте 2,5 л этого раствора в предполимерный раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PEG-488 даст окончательный гидрогель флуоресцентный сигнал, который может быть использован для навигации во время шаблона и концентрация может быть изменена, чтобы изменить интенсивность сигнала.
    3. Фильтр полный дополимерный раствор через 0,2 мкм политетрафтороэтилен (PTFE) фильтр для удаления любых частиц, которые могут присутствовать в растворе. Если реагенты должным образом синтезированы, фильтр не должен засоряться.
  3. Фотополимеризация базового гидрогеля
    1. Поместите 3 злитрополийного раствора на тонкий плоский лист алканеперов перфтороалкoxy (PFA). Поместите плоские 150 мкм толщиной полидиметилсилоксана (PDMS) полосы окружающих, но не в контакте с, падение дополимерного раствора. Поместите акрилат-силанизированный coverslip21,22,23,24 на PDMS-с предполимерной каплей, по центру под крышкой, чтобы сгладить дополинюю каплю до толщины Прокладки PDMS.
    2. Вынаняйте зажатый дополиновый раствор в ультрафиолетовом свете до полного образования гидрогеля (примерно 1 мин при 14 мВт/см2 из 370-400ннн).
    3. Тщательно отделите крышку от прокладок PDMS и прикрепите к блюду Петри с открытым дном с помощью высокопроизводительного, двустороннего акрилового клея. Нанесите давление на клейую контактную поверхность, чтобы создать полное уплотнение между крышкой, клеем и блюдом Петри – с осторожностью, чтобы не треснуть стекло.
    4. Промыть гидрогель в чашке Петри с помощью стерильной фильтрованные PBS, чтобы свести к минимуму биологические и твердые частицы загрязняющих веществ.
    5. Повторите шаги 1.3.1-1.3.4 по мере необходимости для создания нужного количества гидрогелей.
    6. Добавьте 8 Зл NVP к оставшимся 800 злюец решения LAP и сохраните это решение, а также нерастворенный PEG-633 до готовности к шаблону.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Решение LAP с NVP очень чувствительно к свету и будет полимеризировать, если не храниться в темноте. Упаковка трубки в алюминиевую фольгу может помочь улучшить срок годности.

2. Создание инструкций по шаблонам

  1. Разработка двоичного изображения
    1. Чтобы создать виртуальную маску для назначения фидуциальных маркерных массивов, используйте программное обеспечение для обработки изображений или рисования для создания изображения с соотношением сторон 100:1 (например, 2000 пикселей длиной х 20 пикселей в ширину).
    2. Создайте ряд из 100 равномерно расположенных белых пикселей на черном фоне, центрированном вдоль длинной оси изображения.
    3. Сохраните это изображение в виде файла q.tif.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если контроль формы клетки желательно21,25,26,27,28, создать дополнительную виртуальную маску. Используйте холст изображения квадратной формы и создайте положительные белые характеристики на черном фоне. Для приближения соответствующего размера для белых объектов (которые в конечном итоге будут поддерживать сливки клеток) предполагают, что общий размер изображения эквивалентен размеру поля зрения микроскопа, используемого для лазерного сканирования литографии.
  2. Преобразование двоичного изображения в цифровую маску
    1. Скачать функции LSM-ROI-Generator, доступные бесплатно в репозитории программного обеспечения29.
    2. Откройте Matlab и найдите каталог загруженных файлов функций. После того, как в каталоге, откройте сценарий run'script.m Matlab и запустите сценарий.
    3. Выберите двоичный файл q.tif для преобразования. Затем выберите папку для сохранения файлов регионов.
    4. Ввейте желаемый окончательный размер, в микронах, выбранного изображения. Вхотоновое изображение будет масштабироваться и размерироваться в соответствии с этими параметрами. Для того чтобы все изображение вписывалось в поле зрения микроскопа, общий размер изображения должен быть меньше или равен размеру поля обзора микроскопа.
    5. При создании одного массива пикселей, в ROI-Generator Options, убедитесь, что отоверьте отчеканите тикбокс Удалить под малыми регионами / однопикселями,чтобы проверить тикбокс помечены квадратов, и, чтобы отменить Использование под Горизонтальные линии разрыва. Затем нажмите OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При создании файла регионов для создания шаблонов одной ячейки возможны параметры по умолчанию.
    6. В полученном файле з.ovl в ранее указанной папке. Этот файл должен быть доставлен в микроскоп для загрузки нужных областей, которые контролируют лазерный затвор во время двухфотонной лазерной сканирующей литографии.

3. Изготовление фидуциальных маркерных массивов

  1. Замачивание базового гидрогеля
    1. При условиях низкой освещенности добавьте 200 кЛ раствора LAP/NVP к AF633 (оба подготовлены в шаге 1). Тщательно перемешайте, защищая от света.
    2. Удалите все растворPBS из блюда Петри, содержащего гидрогель PEGDA со ступени 1.
    3. Добавьте растворенный PEG-633 в гидрогель, чтобы сформировать капельку, которая полностью включает в себя базовый гидрогель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если отверстие в чашке Петри лишь немного больше гидрогеля, оно может служить колодцем для удержания узорного раствора. В противном случае, убедитесь, что coverslip полностью сухой перед добавлением шаблона решение или он может убежать гидрогель вызывает гидрогель обезвоживать во время узора.
    4. Загрузите чашку Петри на держатель образца на сцене микроскопа и поместите крышку на чашку Петри. Разрешить узорной раствор, чтобы впитаться в гидрогель, по крайней мере 30 минут в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскоп может быть включен и настроен в течение этого времени замочить. Использование 488 нм лазер для изображения гидрогеля во время замачивания штрафа.
  2. Настройка микроскопа
    1. Используя лазерную линию 488 нм и фильтры, соответствующие изображению AlexaFluor 488, найдите гидрогель с помощью сигнала PEG-488. Блок сбора более длинных длин выбросов волн от детектора, поскольку они будут насыщены сигналом от PEG-633.
    2. Найти центр гидрогеля в плоскости XY с помощью вертикального и горизонтального сканирования плитки и нуля сценическое положение здесь.
    3. Найдите поверхность гидрогеля с помощью сканирования линий и функции z-stack. Нулевой фокус позиции здесь. Уровень гидрогеля, повторяя эти линейные сканирования от центра XY для определения положения поверхности и регулировки набор винтов для микроскопа этапе.
    4. В рабочей области программного обеспечения микроскопа создайте отдельный файл эксперимента для фотопаттернинга. Установите мультифотонную мощность до 1,8% (15,5 мВт при 740 нм, как измеряется при задней диафрагме цели), а скорость сканирования - до 6 (0,1 м/с). Отрегулируйте размер кадра изображения в пикселях, чтобы достичь размера пикселя 0,1 мкм на пиксель и соотношения сторон 100:1.
    5. Загрузите файл регионов (з.ovl), созданный в шаге 2.2 в вкладку регионов. Используйте макрос, чтобы установить все регионы для приобретения.
    6. Включите функцию z-stack и установите расстояние до 3,5 мкм на общую глубину 28 мкм и общее количество z-ломтиков 9.
    7. Используйте функцию позиций, чтобы установить определенные местоположения на гидрогеле, где фидуциальные маркерные массивы будут фотопаттернированы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: z-расположение этих позиций будет диктовать центральное положение каждого z-стека; при размещении позиций убедитесь, что каждая позиция гарантирует, что узорчатый объем будет перекрываться с гидрогелем во всех поверхностных местах.
    8. Используйте функцию плитки, чтобы указать дополнительные строки и столбцы в каждом положении. Будьте осторожны, чтобы избежать перекрывающихся узорчатых регионов. В идеале убедитесь, что узорчатые области находятся достаточно близко, чтобы удалить пустые и непригодные для употребления места между позициями.
  3. Фотопаттернирование фидуциальных маркерных массивов
    1. По мере приближения времени замочиания отметки в 30 минут, сдавайте последовательные сканирование линии z-stack поверхности гидрогеля каждые 5 минут, чтобы проверить наличие отеков на основе изменений в расположении поверхности относительно нулевого положения фокусировки.
    2. Если изменение положения поверхности происходит в течение 5-минутного интервала, загрузите и запустите настройки шаблона, созданные в шаге 3.2.4
    3. После того, как эксперимент по моделируза закончился, используйте лазер 488 нм, чтобы убедиться, что поверхность гидрогеля не двигалась во время узора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если поверхность гидрогеля не находится в том же положении, что и до шаблонирования, существует несколько сценариев. Гидрогель не достиг равновесия отеков до узора, гидрогель начал высыхать во время узора, или микроскоп опытных z-дрифт. Источник этого поверхностного перевода должен быть идентифицирован и исправлен в последующих трассах шаблонирования.
    4. Снимите гидрогель с микроскопа и снимите раствор PEG-633 с блюда Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрогель по-прежнему чрезвычайно чувствителен к свету. Сохранение гидрогеля в темноте очень важно, пока все промывки завершена.
    5. Промыть гидрогель 3 раза с стерильным фильтром PBS, убедившись, чтобы полностью удалить промыть между каждым последовательным промыть. Повторите это тройное промыть каждые 15 минут в течение 1 ч.
    6. Разрешить гидрогель для промывки в PBS на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
    7. Тройной промыть гидрогель с PBS. Затем быстро тройной промыть гидрогель с 200-доказательство этанола раствор, а затем еще один тройной промыть PBS. Не позволяйте гидрогелю сидеть в 200 доказательство этанола в течение длительных периодов времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые компоненты узорного раствора могут выйти из раствора и выйти на поверхность гидрогеля и появиться в виде твердого слоя флуоресценции (толщиной 1-5 мкм) под освещением 633 нм. Промывка с 200 доказательств этанола должны удалить эти нежелательные компоненты.
  4. Использование последовательных фотопаттернов для генерации одноклеточных шаблонов (необязательно)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если контроль над областью распространения ячейки и формы желательно, несколько раундов узора могут быть выполнены. Базовый гель должен иметь PEG-RGDS, опущенный из его первоначальной формулировки. Рекомендуется, чтобы узор фидуциальных маркерных массивов быть выполнены в последнюю сторону, чтобы избежать отбеливания флуоресцентных фидуциальных маркеров.
    1. Растворите 20 мг PEG-RGDS в растворе LAP/NVP, подготовленном в шаге 1.
    2. Повторите шаги 3.1 – 3.3 с помощью решения PEG-RGDS вместо решения PEG-633. Используйте файл соответствующих регионов, определяющий шаблоны одной ячейки (см. шаг 2 для инструкций).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы визуализировать массивы шаблонов PEG-RGDS, существует несколько вариантов. Флуоресцентный вариант PEG-RGDS можно использовать21,30 или PEG-RGDS можно управлять флуоресцентным PEG. Рекомендуем: Кроме того, 488 нм лазерная линия может быть запущена в тандеме с многофотонной модельящий лазер для отбеливания сигнала PEG-488 в базовом гидрогеле, создавая нефлуоресцентные области, которые совпадают с включением RGDS.

4. Визуализация фидуциальных маркерных массивов

  1. Приобретение изображения z-стека сфабрикованный массив
    1. Замените PBS в чашке Петри с сотовыми носителями, используемыми для клеточной культуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фенол красный свободные носители рекомендуется для использования во время приобретения изображения для предотвращения фототоксичности.
    2. После 1 ч времени замочить, используйте широкоугольный флуоресцентный микроскоп, оснащенный структурированным модулем освещения и объективом объективного погружения воды с высоким увеличением, чтобы визуализировать гидрогели с помощью фильтра, подходящего для флуоресцентных фидуциальных маркеров.
    3. Соберите изображения с высоким разрешением z-stack (расставленные 0,4 мкм в q), охватывающие не менее 20 мкм глубины от поверхности гидрогеля в гидрогель в узорчатой области, убедившись, что верхний предел z-стек включает по крайней мере 1-2 изображения физически выше узорчатой области (т.е. где флуоресцентные фидуциальные маркеры больше не видны и присутствует только шум).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приобретение этого стека изображений необходимо для проверки правильности всех параметров шаблонирования и может быть проанализировано наряду с данными ячеек в шаге 5.3.

5. Выполнение TFM с использованием фотопаттернированных гидрогелей

  1. Посевные клетки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания бесплодия, следуйте всем стандартным практикам культуры тканей.
    1. До посева клеток следуйте стандартным протоколам соответствующей клеточной линии для клеточной культуры и обслуживания.
    2. (Необязательно) Если стерильность гидрогеля является проблемой, инкубировать гидрогель для 24 ч в средствах массовой информации, содержащих антибиотики, а затем полоскания с нормальными средствами массовой информации.
    3. Для семенных клеток, сначала повторно приостановить трипсинизированные клетки в конечном объеме носителей, которые будут использоваться в гидрогель Петри блюдо.
    4. Удалите все растворы из гидрогеля блюдо и заменить с клетками нагруженные средства массовой информации.
    5. Разрешить гидрогель сидеть спокойно в клетках груженых носителей в течение 10 минут.
    6. Аккуратно переместите чашку Петри в инкубатор. Поддерживайте клетки в инкубаторе в течение 4 ч или до тех пор, пока клетки не будут заметно соблюдены.
    7. Замените нагруженные ячейками носители с помощью средств массовой информации, свободных от клеток, для удаления непристычных ячеек.
  2. Получение изображений клеток и фидуциальных маркеров
    1. Установите температуру для инкубационной камеры на микроскопе до 37 градусов по Цельсию и COот 2 до 5% и позвольте камере достичь установленных точек.
    2. Поместите чашку Петри на держатель образца и найдите узорчатые области.
    3. Найдите интересуемую ячейку (COI) и приобретите передаваемое или флуоресцентное изображение COI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это изображение будет использоваться для сегмента границы ячейки во время анализа, так что изображение должно четко визуализировать ячейки границы.
    4. Приобретите z-стек узорного массива под COI, как в шаге 4.1.4.
    5. Приобретите второй набор передаваемых или флуоресцентных изображений клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сравните второй набор изображений с первым, чтобы определить, наблюдается ли повреждение клеток из-за фототоксичности и нужно ли корректировать параметры приобретения изображения. Клетки, которые сокращаются после воздействия, вероятно, пострадали значительные фототоксические эффекты, которые могут повлиять на результаты.
    6. Повторите шаги 5.2.3-5.2.5 для каждого COI.

6. Анализ изображений

  1. Подготовка файлов изображений к анализу
    1. Используя данные, собранные в шаге 5.2, подготовьте обрезанный стек изображения области вокруг COI таким образом, чтобы нижнее изображение (первое изображение) стека представляет собой первый кадр, где: (1) 80% узорчатых маркеров видны, (2) верхнее изображение (последнее изображение) в стеке больше не содержит видимых фидуциальных маркеров (т.е. над поверхностью гидрогеля), и (3) есть по крайней мере 20 мкм ненапряженных фидуциальных маркеров, окружающих COI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обрезка изображений значительно сокращает вычислительное время во время анализа. Код анализа в последующих шагах может быть запущен без обрезки изображений, но это не рекомендуется.
    2. Создайте обрезанное изображение передаваемого и/или флуоресцентного изображения в соответствии с XY обрезкой стека на предыдущем этапе.
    3. Используйте либо обрезанное передаваемое, либо флуоресцентное изображение , в зависимости от того, что является более репрезентативным для формы клетки, чтобы отрезком изображения вручную (проследить границу ячейки) или с помощью инструментов обработки изображений.
    4. Преобразуйте это изображение в двоичное изображение, где внутренняя часть ячейки черная (т.е. интенсивность No 0), а область, окружающая ячейку, белая (т.е. интенсивность 0). Сохранить это изображение как двоичные Mask.tif.
    5. Для каждого COI соберите файл стека изображений, переданный файл изображения и файл двоичной маски в одной папке.
  2. Запуск сценариев анализа изображений
    1. Клон или скачать функции анализа TFM доступны бесплатно в хранилище программного обеспечения29. Весь репозиторий должен быть загружен, поскольку в субфолиателях имеется значительное количество зависимостей.
    2. Откройте Matlab и добавьте каталог и все субфалеры локального клона репозитория кода в путь.
    3. Установите каталог в рабочей области Matlab к месту папки, где хранились подготовленные изображения в шаге 6.1.
    4. Откройте и запустите сценарий tracking.m. При запросе следуйте инструкциям по загрузке соответствующих изображений, выполнению первоначальных этапов предварительной обработки и проверке алгоритма отслеживания объектов.
    5. После завершения скрипта откройте и запустите функцию dispShear.m. Этот скрипт не должен требовать ввода от пользователя.
    6. После того, как dispShear.m сценарий завершен, открыть и запустить disp3D.m. Если предлагается открыть любые изображения, следуйте инструкциям.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время выполнения скрипт может попросить пользователя нарисовать линию на изображении узорчатого массива. Эта линия должна представлять основную ось движения сканирующего лазера во время узора и должна выстраиваться в ряд узорчатых фидуциальных маркеров. Этот процесс инструктирует код о том, в каком направлении (т.е. строки или столбцы фидуциальных маркеров), вероятно, дает наиболее выровненные строки фидуциальных маркеров.
    7. После завершения работы кода dispShear.m запустите код dispSurface.m с последующим кодом interpFinal3D.m. Эти скрипты не должны требовать входных данных от пользователя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипт interpFinal3D'2.m преобразует данные о смещении в поверхностные тяги с помощью программного обеспечения, полученного извне, которое ранее было описано31. Чтобы применить эти внешние функции, interpFinal3D'2.m интерполирует данные о перемещении в единые сетки, чтобы служить в качестве входных данных для функций преобразования. При использовании другого метода преобразования, или если tractions не требуется, этот шаг может быть пропущен.
    8. После запуска всех скриптов убедитесь, что все данные и выходы можно найти в исходном каталоге.
    9. Повторите шаги 6.2.3 - 6.2.8 для каждого COI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В репозитории кода есть папка, содержащая скрипты, которые позволяют автоматически запускать каждый из скриптов в списке каталогов. Для получения инструкций по их использованию например, смотов автоматизации (т.е. в комментариях в коде) —см.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На протяжении всего протокола существует ряд контрольно-пропускных пунктов, обеспечивающих обратную связь для оценки качества процедуры шаблонирования. Чтобы дать некоторое представление о том, как оценить прогресс на каждом из этих контрольно-пропускных пунктов, мы предоставляем репрезентативные результаты фактического эксперимента. Результаты подчеркивают применение этого протокола, выполненного на фотопаттерированном гидрогеле, подготовленном для анализа TFM эндотелиальных клеток пуповины человека (HUVECs). Результаты...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью этого протокола является предоставление рабочего процесса, который значительно облегчает трудности, связанные с генерацией и анализом данных TFM. После подготовки гидрогели с фотопаттерированными являются простыми в использовании, требующими только знания стандартных методов культуры тканей и флуоресценции микроскопии. Безсправочный аспект обеспечивает беззаботную навигацию по гидрогелям, нагруженным ячейками, и устраняет громоздкие шаги обработки изображений, такие как регистрация изображений между ссылками и дефо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

О. А. Банда была поддержана финансированием из NSF IGERT SBE2 стипендий (1144726), запуск средств, предоставленных Университетом Штата Делавэр, и Национальные институты здравоохранения / Национальный институт рака ИМАТ программы (R21CA214299). JHS поддерживается за счет финансирования со стороны Национальных институтов здравоохранения / Национальный институт рака IMAT программы (R21CA214299) и Национальный научный фонд CAREER Award Program (1751797). Доступ к микроскопии был поддержан грантами NIH-NIGMS (P20 GM103446), NSF (IIA-1301765) и штата Делавэр. Структурированный подсветка микроскоп был приобретен на средства из штата Делавэр Федеральной программы исследований и разработок Грант (16A00471). Конфокальный микроскоп LSM880, используемый для двухфотонного лазерного сканирования литографии, был приобретен с помощью общего приборного гранта (S10 OD016361).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Шприцевой фильтр Acrodisc, 0,2 шт; m Supor Membrane, Pall с низким связыванием белковPallPN 4602Позволяет фильтровать растворы макромеров перед синтезом базового геля и последующими этапами литографии.
Акрилатно-силановый функционализированный #1.5 Coverslipsin-house<em>in-houseАкрилаты позволяют связывать базовый гидрогель с поверхностью стекла для иммобилизации гидрогелей. Смотрите справку: 21-24
Axio-Observer Z1 с широкоугольным микроскопом ApotomeZeissс модулем структурированного освещения, используемым для захвата изображений для TFM.
Хамелеон Вижн IIКогерент Инк.Оснащен лазерно-сканирующим микроскопом, используемым для многофотонной литографии.
Лента с двойным покрытием, 9500 шт., 6,0 мил3MСвязывает акрилатно-силановые функциональные покровные стекла с чашками Петри.
Flexmark90 PFW LinerFLEXconFLX000620Позволяет прокладывать ленту с двойным покрытием, что позволяет подавать ленту в плоттер.
LSM-880Zeiss,используемый для многофотонной литографии.
MATLABMathworksR2018aЗапускает пользовательские скрипты для генерации инструкций по литографии для микроскопа и для анализа данных TFM.
Модель SC PlotterUSCutterSC631EРазрезает ленту с двойным покрытием на кольца, чтобы прикрепить покровные стекла к чашкам Петри.
Объектив C-Apochromat 40x/1,20 Вт Corr M27ZeissОснащен как широкопольным микроскопом, так и лазерным сканирующим микроскопом для использования как для литографии, так и для TFM.
PEG-AF633in-housein-houseФлуорофорный меченый акрилатный вариант PEG для создания реперных точек. Смотрите ссылку: 21
PEG-DAem>in-housein-houseБазовый материал для гидрогелей. См. ссылку: 21
PEG-RGDSem>in-houseemin-houseRGDSмеченый пептидом моноакрилатный вариант PEG для стимулирования клеточной адгезии. Смотрите справку: 21
чашка ПетриCELLTREAT229638В центре каждой посуды с помощью сверла для отбора керна вырезаются отверстия диаметром 8 мм, чтобы они поместились в гидрогели на основе.
Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеровDow Corning3097358-1004Для создания прокладок для контроля толщины базового гидрогеля (также известного как PDMS).
Шприц, Leur-Lok, 1 млBD309628Позволяет фильтровать растворы макромеров перед синтезом базового геля и последующими этапами литографии.
УФ-лампаУВПBlak-Ray® B-100APПолимеризует базовую гидрогелевую основу.
1-винил-2-пирролидинон (NVP)Sigma-AldrichV3409-5GРадикальный ускоритель и сомономер. Улучшает встраивание пегилированного флуорофора при литографии.
Лазерный сканирующий микроскоп <<

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex. Cell. 158 (1), 143-156 (2014).
  2. Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension. Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).
  3. Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
  4. Álvarez-González, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del Álamo, J. C. Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration. Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).
  5. Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
  6. Reilly, G. C., Engler, A. J. Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation. Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).
  7. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).
  8. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  9. Steward, A. J., Kelly, D. J. Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).
  10. Lv, H., et al. Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 103(2015).
  11. Tijore, A., et al. Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).
  12. Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement. Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).
  13. Legant, W. R., et al. Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).
  14. Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).
  15. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  16. Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).
  17. Bergert, M., et al. Confocal reference free traction force microscopy. Nature Communications. 7, (2016).
  18. Schwarz, U. S., et al. Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates. Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).
  19. Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  20. Desai, R. a, Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. Journal of Visualized Experiments. (0), 1-5 (2007).
  21. Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).
  22. Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow. Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).
  23. Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).
  24. Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).
  25. Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography. Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).
  26. Slater, J. H., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
  27. Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).
  28. Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. Biomimetic Surfaces for Cell Engineering. Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).
  29. Banda, O. A., Slater, J. H. Slater Lab Code Repositories. , Available from: https://github.com/SlaterLab (2019).
  30. Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization. Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).
  31. Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., López-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. High resolution, large deformation 3D traction force microscopy. PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).
  32. Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).
  33. Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels. Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Traction Force MicroscopyReference Free PlatformMultiphoton LithographyHydrogel FabricationFluorescent Fiducial Markers3D Material DeformationCell Tension MappingTwo Photon PatterningZ Stack ImagingDisplacement Analysis

Related Articles