Method Article

Платформа Lab-on-a-CD для генерации многоклеточных трехмерных сфероидов

DOI:

10.3791/60399

⸱

November 7th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Graduate School, Chung-Ang University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Medicine, Seoul National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем моторное центробежное микрофлюидное устройство, которое может культивировать клеточные сфероиды. С помощью этого устройства, сфероиды одного или нескольких типов клеток могут быть легко сконкультурированы в условиях высокой гравитации.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трехмерная культура сфероидных клеток может получить более полезные результаты в клеточных экспериментах, поскольку она может лучше имитировать клеточную микросреду живого тела, чем двухмерную клеточную культуру. В этом исследовании мы изготовили электромоторную платформу Lab-on-a-CD (compact disc), называемую центробежной микрофлюидной системой культуры сфероидов (CMS), чтобы создать трехмерные (3D) клеточные сфероиды, реализующие высокую центробежную силу. Это устройство может варьировать скорость вращения для создания условий гравитации от 1 х г до 521 х г. Система CMS имеет 6 см в диаметре, имеет сто 400 мкм микроуэллов, и производится путем литья с полидиметилсилоксаном в поликарбонатной плесени, сделанной компьютерным аппаратом управления числом. Барьерная стена на входе канала системы CMS использует центробежную силу для равномерного равномерного распределения клеток внутри чипа. В конце канала есть область слайда, которая позволяет клеткам входить в микроколодцы. В качестве демонстрации, сфероиды были созданы монокультуры и кокультуры человеческих жиров полученных стволовых клеток и легких фибробластов человека в условиях высокой гравитации с помощью системы. Система CMS использовала простую схему работы для производства сфероидов кокультуры различных структур концентрических, Янус, и сэндвич. Система CMS будет полезна в клеточной биологии и исследованиях тканей, которые требуют сфероидов и органоидной культуры одного или нескольких типов клеток.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Легче моделировать биологические микросреды in vivo с трехмерной (3D) культурой сфероидных клеток, чем с двухмерной (2D) клеточной культурой (например, обычной культурой клеток петри) для получения более физиологически реалистичного экспериментального результаты1. В настоящее время доступны методы формирования сфероидов включают висячие капли техники2, жидкая накладка техника3, carboxymethyl целлюлозы техники4, магнитной силы на основе микрофлюидной техники5, и использование биореакторы6. Хотя каждый метод имеет свои преимущества, необходимо дальнейшее улучшение воспроизводимости, производительности и генерации сфероидов кокультуры. Например, в то время как микрофлюидная техника5 на основе магнитной силы является относительно недорогой, влияние сильных магнитных полей на живые клетки необходимо тщательно рассмотреть. Преимущества сфероидной культуры, особенно в изучении мезенхимальной дифференциации стволовых клеток и распространения, были зарегистрированы в нескольких исследованиях7,8,9.

Центробежная микрофлюидная система, также известная как lab-on-a-CD (компактный диск), полезна для легкого контроля жидкости внутри и использования вращения субстрата и, таким образом, была использована в биомедицинских приложениях, таких как иммуноанализы 10, колорометрические анализы для обнаружения биохимических маркеров11,усиление нуклеиновой кислоты (ПЦР), автоматизированные системы анализа крови12и все-в-одном центробежные микрофлюидные устройства13. Движущей силой, контролирующей жидкость, является центростремительная сила, создаваемый вращением. Кроме того, несколько функций смешивания, вальвинга и разделения образцов можно сделать просто в этой единственной платформе компакт-диска. Однако, по сравнению с вышеупомянутыми методами биохимического анализа, было меньше испытаний, применяющих CD-платформы к культурным клеткам, особенно сфероидам14.

В этом исследовании мы показываем производительность центробежной микрофлюидной сфероидной системы (CMS) путем монокультуры или кокультуры стволовых клеток человека, полученных из жиров (hASC) и фибробластов легких человека (MRC-5). В этой статье подробно описывается методология исследования нашей группы15. Таким образом, платформа сфероидной культуры-на-CD может быть легко воспроизведена. Представлена система генерации CMS, включающая чип культуры CMS, держатель чипа, двигатель постоянного тока, моторную установку и вращающуюся платформу. Моторная крепление напечатано 3D с акрилонитрилом бутадиена стирола (ABS). Держатель чипа и вращающаяся платформа cNC (компьютерный цифровой контроль) отражаются с ПК (поликарбонат). Скорость вращения двигателя контролируется от 200 до 4500 об/мин путем кодирования PID (пропорционально-интегрально-производной) алгоритма на основе импульсно-ширинной модуляции. Его габариты 100 мм х 100 мм х 150 мм и вес 860 г, что делает его легким в обращении. Используя систему CMS, сфероиды могут быть созданы в различных условиях гравитации от 1 х г до 521 х г,поэтому изучение содействия дифференциации клеток в условиях высокой гравитации может быть продлено с 2D-клеток16,17 до 3D Сфероида. Кокультура различных типов клеток также является ключевой технологией для эффективного имитирования среды in vivo18. Система CMS может легко генерировать монокультурные сфероиды, а также сфероиды кокультуры различных типов структур (например, концентрические, янус ы, и сэндвич). Система CMS может быть использована не только в простых сфероидных исследованиях, но и в 3D органоидных исследованиях, для рассмотрения структур органов человека.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Центробежная микрофлюидная сфероидная (CMS) культура изготовления чипов

  1. Сделать ПК формы для верхнего и нижнего слоев чипа культуры CMS по ч. 00 м. Подробные размеры чипа приведены на рисунке 1.
  2. Смешайте базу PDMS и отвержение PDMS в соотношении 10:1 (w/w) в течение 5 мин и поместите в дешикатор на 1 ч для удаления пузырьков воздуха.
  3. После заливки смеси PDMS в формы чипа культуры CMS, удалить пузырьки воздуха на 1 ч больше и вылечить в тепловой камере при температуре камеры при температуре в 80 градусов по Цельсию в течение 2 ч.
  4. Поместите их в пылесосом плазменный очиститель с поверхностями, которые будут связаны вверх и подвергать их воздух-помощь плазмы на мощность 18 Вт для 30 с.
  5. Скрепите два слоя чипа культуры CMS и поместите его в тепловую камеру при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы увеличить прочность стыкания.
  6. Стерилизовать чип культуры CMS в автоклавном стерилизаторе при 121 кв. и 15 пси.

2. Подготовка клеток

  1. Оттепели 1 мл флакона, содержащего 5 и 105-1 х 106 hASCs или клетки MRC-5s в водяной бане при 36,5 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
  2. Добавьте 1 мл модифицированного орла Dulbecco Medium (DMEM) в флакон и аккуратно смешайте с 1000-м пипеткой.
  3. Положите 15 мл DMEM предварительно нагревается до 36,5 градусов по Цельсию в 150 мм диаметром Петри блюдо с помощью пипетки и добавить клетки из флакона.
  4. После 1 дня, аспирация DMEM и заменить на 15 мл свежего DMEM. Впоследствии, изменить средства массовой информации каждые 2 или 3 дня.
  5. Чтобы отделить клетки от чашки Петри, добавьте 4 мл трипсина в блюда Петри и поместите их в инкубатор при 36,5 градуса х и 5% CO2 в течение 4 мин.

3. Монокультурное формирование сфероидов

  1. Положите 2,5 мл 4% (w/v) pluronic F-127 раствор в входе отверстие чипа культуры CMS(Рисунок 2A) при вращении чипа на 500-1000 об/ ч, а затем повернуть чип на 4000 об/мин в течение 3 минут с помощью системы CMS (Рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: плюроное покрытие предотвращает вложение клеток в порт входе во время вращения чипа. Убедитесь, что воздух не в ловушке в микроколодцах.
  2. Инкубировать чип культуры CMS заполнены с pluronic раствор ночь на 36,5 градусов по Цельсию в 5% CO2.
  3. Снимите плюронический раствор, промойте оставшийся плюронический раствор DMEM и высушите чип на 12 ч на чистой скамейке.
  4. Добавьте 2,5 мл DMEM в чип культуры CMS и поверните чип на 4000 об/мин в течение 3 минут для предварительного промотирования внутри чипа.
  5. Остановить вращение и вытащить 100 Зл DMEM, чтобы освободить место для введения подвески клетки.
  6. Добавьте 100 зЛ клеточных суспензий, которые содержат либо 5 х 10hASCs или 8 '105 MRC-5s путем pipetting Равномерно распространять клетки путем pipetting 3-5x для повторной приостановки.
  7. Поверните чип при 3000 об/мин в течение 3 минут для ловушки клеток в каждом микроколодце центробежной силой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерная скорость вращения может привести к побегу клеток через отверстия выброса раствора.
  8. Культура клеток в течение 3 дней в инкубаторе при 36,5 градуса цельсия, влажности и 5% CO2, вращаясь при 1000-2000 об/мин. Меняйте среду культуры каждый день.

4. Формирование сфероидов кокультуры

  1. Формирование концентрических сфероидов
    1. Добавьте первые ячейки, 2,5 и 105 hASCs, и поверните чип на 3000 об/мин. После 3 мин, добавить вторые клетки, 4 и 105 MRC-5s, и повернуть чип на 3000 об/ в минуту в течение 3 мин. Введите в общей сложности 100 qL клеточных суспензий путем pipetting. При введении клеток сдвинйте скорость вращения до 500-1000 об/мин.
    2. Культура клеток в инкубаторе при 36,5 градуса цельсия, йgt;95% влажности%, и 5% CO2 при повороте при 1000-2000 об/мин. Концентрические сфероиды создаются в пределах 24 ч. Для долгосрочной культуры, изменить культуру среды каждый день.
  2. Янус сфероидное образование
    1. Добавьте 100 кЛ клеточных суспензий, содержащих первые ячейки, 2,5 и 105 hASCs, путем пайпетирования, в то время как чип вращается при 500-1000 об/мин. Затем поверните чип при 3000 об/мин в течение 3 мин.
    2. Инкубировать чип при 36,5 градуса х с, влажности и 5% CO2 при повороте при 1000-2000 об/мин в течение 3 ч.
    3. Добавьте 100 qL клеточных суспензий, содержащих второй набор ячеек, 4 и 105 MRC-5, путем пайпетирования, в то время как чип вращается при 500-1000 об/мин. Затем поверните чип при 3000 об/мин в течение 3 мин.
    4. Культура клеток в инкубаторе при 36,5 градуса Цельсия, йgt;95% влажности, и 5% CO2 при повороте на 1000-2000 об/мин. Сфероиды Janus создаются в пределах 24 ч. Для долгосрочной культуры, изменить культуру среды каждый день.
  3. Формирование сфероидов сэндвича
    1. Добавьте 100 кЛ клеточных суспензий, содержащих первые ячейки, 1,5 и 105 hASCs, путем пайпетирования, в то время как чип вращается при 500-1000 об/мин. Затем поверните чип при 3000 об/мин в течение 3 мин.
    2. Инкубировать чип при 36,5 градуса х с, влажности и 5% CO2 при повороте при 1000-2000 об/мин в течение 3 ч.
    3. Добавьте 100 кЛ клеточных суспензий, содержащих вторые клетки, 3 х 105 MRC-5s, путем трубоукладки, в то время как чип вращается при 500-1000 об/мин. Затем поверните чип при 3000 об/мин в течение 3 мин.
    4. Инкубировать чип при 36,5 градусах Цельсия, йgt;95% влажности%, и 5% CO2 при повороте при 1000-2000 об/мин в течение 3 ч.
    5. Добавьте 100 кЛ клеточных суспензий, содержащих третьи клетки, 1,5 и 105 hASCs, путем пайпетирования, в то время как чип вращается при 500-1000 об/мин. Затем поверните чип при 3000 об/мин в течение 3 мин.
    6. Культура клеток в инкубаторе при 36,5 градуса цельсия, йgt;95% влажности%, и 5% CO2 при повороте при 1000-2000 об/мин. Сэндвич сфероиды создаются в пределах 12 ч. Для долгосрочной культуры, изменить культуру среды каждый день.

5. Окрашивание клеток

  1. Разогрейте краситель флуоресценции до комнатной температуры (20 градусов по Цельсию).
  2. Добавьте 20 зл. ангидроусдийульфоксида (DMSO) на флакон, чтобы сделать раствор 1 мМ.
  3. Разбавить флуоресценцию до конечной рабочей концентрации в 1 км с помощью DMEM.
  4. Добавьте флуоресценцию в суспензию клетки и аккуратно применяйте с помощью пипетки.
  5. Инкубировать 20 мин при 36,5 градусах Цельсия, влажности в размере 95%, и 5% CO2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чип культуры CMS диаметром 6 см(рисунок 2)был успешно изготовлен по вышеуказанному протоколу. Во-первых, чип был сделан отдельно от верхнего слоя и нижнего слоя, а затем связаны друг с другом плазменной связи. В результате сфероиды могут быть легко собраны путем отсоединения чипа. Канал чипа культуры CMS включает в себя входной порт и центральные, слайдовые и микроколодцы(рисунок 3). Клеточные, средние и плюронические растворы вводятся через впускное отверстие д...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CMS является закрытой системой, в которой все инъекционные клетки попадают в микроскважину без отходов, что делает его более эффективным и экономичным, чем обычные методы генерации сфероидов на основе микроскважин. В системе CMS, средства массовой информации заменяется каждые 12-24 ч через всасывающее отверстие, предназначенное для удаления носителя в чипе(рисунок 3A). Во время процесса всасывания средств массовой информации, едва ли какие-либо средства массовой информации ускользает изнутри...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Программой фундаментальных научных исследований (2016R1D1A1B03934418) и Программой развития био- и медицинских технологий (2018M3A9H1023141) NRF и финансируется корейским правительством, MSIT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3D-принтерCubicon3DP-210F
Жировые мезенхимальные стволовые клетки (hASC)ATCCPCS-500-011
Антибиотик-антимикотикGibco15240-062Содержит 1% готовой среды и буфера
CellTracker Green CMFDAThermo Fisher ScientificC292510 мМ
CellTracker Red CMTPXThermo Fisher ScientificC3455210 мМ
Компьютер с числовым программным управлением (ЧПУ) роторный граверRoland DGAEGX-350
DC моторNurielectricity Inc.MB-4385E
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma AldrichD2650
Модифицированная среда Дульбекко (DMEM)ATCC30-2002
Фосфатный буферный раствор Дульбекко (D-PBS)ATCC30-2200
Фетальная бычья сывороткаATCC30-2020Содержит 10% готовых
средних фибробластов легких человека (МРК-5)ATCCCCL-171
Inventor 2019Autodesk3D программа автоматизированного проектирования
чашка Петри Φ 150 ммJetBiofillCAD010150Поверхностно обработанный
плазменный очистительHarrick PlasmaPDC-32G
Pluronic F-127Sigma Aldrich11/6/9003Разбавить фосфатным буферным раствором до 4% (w/v) раствор
Поликарбонат (ПК)AcrylmallAC15PC200 x 200 x 15 мм
Полидиметилсилоксан (PDMS)DowcorningSylgard 184
TrypsinGibco12604021

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
  2. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  3. Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).
  4. Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
  5. Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
  6. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  7. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
  8. Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
  9. Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105(2014).
  10. Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
  11. Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
  12. Park, Y. -S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1(2016).
  13. Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
  14. Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
  15. Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
  16. Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
  17. Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
  18. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lab on a CD PlatformCentrifugal Microfluidic System3D Cell SpheroidsHuman Adipose Stem CellsHuman Lung FibroblastsPDMS MoldingCNC MachiningPlasma BondingCentrifugal Force DepositionMicrowell Array Culture

Related Articles