Здесь мы описываем новый метод выявления успешного установления общего кровообращения двух парабионтов через инъекцию caudal вен глюкозы, которая вызывает минимальный ущерб и не является фатальной для парабионтов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение создания общего кровоснабжения у парабиотических мышей путем инъекции глюкозы Caudal Vein
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Парабиоз является экспериментальным методом хирургического объединения двух параллельных животных вдоль продольной оси тела. Мы представляем протокол для обнаружения успешного установления химеризма крови в парабионтах путем инъекции caudal вен глюкозы. Были построены парабиотические мыши. Глюкоза вводилась в донорскую мышь через хвостовую вену, и колебания уровня глюкозы в крови измерялись у обеих мышей с помощью глюкометра крови в разное время. Наши результаты показали, что после инъекции глюкозы уровень глюкозы в крови у мышей-доноров резко повысился после 1 мин и медленно снизился после этого. Между тем, уровень глюкозы в крови мышей-реципиентов достиг 15 мин после инъекции. Аналогичные результаты были получены с Эванс синий, используется в качестве положительного контроля для глюкозы. Синхронные колебания уровня глюкозы в крови свидетельствуют о том, что кровоток между двумя мышами был успешно установлен.
Введение
Парабиоз является методом моделирования, в котором два живых организма соединяются хирургическим путем и развиваются как единая физиологическая система с общей системой кровообращения1. Такие модели широко используются для изучения физиологии, что объясняется тем преимуществом, что вещества, производимые одним человеком, могут действовать на обоих животных одновременно через общую систему кровообращения. С середины 1800-х годов, когда парабиотические эксперименты были впервые Пол Берт2, методы для построения парабиотических моделей стали стандартизированы. Однако простого и удобного метода проверки успешного создания кровного химеризма не хватает. Было сообщено, что перекрестный оборот может быть успешно оцененин интраперитонеально инъекционных 0,5% Эванс синий краситель в одном из парабионтов следуют измерения абсорбции Эванс синий в крови обоих парабионтов с микроплитой читателя3. Другой метод требует определенной породы мышей, которая содержит CD45.1-и CD45.2-помеченные моноциты в каждом парабионте. Клеточная цитометрия затем используется для определения химеризма крови путем измерения частоты двух маркеров в моноцитах из селезенки или крови4. Тем не менее, эти методы часто являются смертельными или громоздкими для животных, и безопасный и простой метод для быстрой и надежной проверки парабиотических моделей является весьма желательным. В этом исследовании мы создали новый метод для этой цели, который был проверен в мышиной модели парабиоза. Концентрация глюкозы в образцах крови, взятых из хвостовой вены, измеряется с помощью глюкометра, а модель изменений уровня глюкозы у мышей-доноров и реципиентов считается признаком циркуляции химеризма. Мы назвали этот метод «методом колебаний глюкозы». Применение этого метода проверки не ограничивается мышами, но может быть распространено на различные патологические модели, за исключением тех, с серьезнымдисрегрецией метаболизма глюкозы. Процедура проста, экономия времени и безопасна.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры, связанные с животными и их уходом, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Харбинского медицинского университета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты и оборудование, необходимые для метода,перечислены в таблице материалов.
1. Подготовка материалов и животных
- Закажите C57BL/6 мышей мужского пола весом от 20 г-25 г у стандартного поставщика лабораторных животных.
- Дом мышей в цикле 12 ч света: 12 ч темноты при 24'26 C с ad libitum доступ к воде и пище.
2. Парабиоз
- Анестезия мышей путем интраперитонеальной инъекции 20 г/л 2,2,2-трибромоэтанола в концентрации 0,1 мл/10 г. Подтвердите правильное обезболивание, о чем свидетельствует расслабление мышц, медленное и устойчивое дыхание, потеря рефлектора стимуляции кожи и исчезновение рефлектора роговицы.
- Нанесите офтальмологическую мазь с помощью наконечника, чтобы предотвратить сухость глаз.
- Выполните процедуру парабиоза, как ранее описано5.
- Поместите мышей в положение лежа. Тщательно побрить левую сторону одной мыши и правую сторону другой мыши, начиная примерно на 1 см выше локтя до 1 см ниже колена с электрической бритвой. Используйте крем для депилатория, чтобы полностью очистить мех на бритой коже.
- Протрите бритые участки с йодофоном. Поместите мышей на подогрев омытой подушечки, покрытую стерильной подушечкой.
- Создавайте продольные разрезы кожи, начиная с 0,5 см выше локтя до 0,5 см ниже коленного сустава, используя с помощью острых ножниц на бритой стороне каждого животного.
- Отсоедините кожу от подкожной фасции осторожно после разреза.
- Соедините олекранон и колено парабионта с 3-0 шов.
- Шов побрился на коже с непрерывным 5-0 швом.
- Вводят 0,5 мл 0,9% NaCl подкожно каждой мыши для предотвращения обезвоживания.
- Вводят трамадол (10 мг/25 г/день) к каждой мыши, чтобы облегчить боль.
3. Проверка циркуляции химеризма
- Метод колебаний глюкозы
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте успешное построение циркуляции химеризма между парабионтами с помощью метода колебаний глюкозы (без голодания) на 10-й день после операции на парабиозе.- Анестезия парабионтов путем интраперитонеальной инъекции 20 г/л 2,2,2-трибромоэтанола для каждой мыши в концентрации 0,1 мл/10 г.
- Исправить донора мышей в венозной визуально-мыши хвост фиксатор.
- Натрите хвостовые вены на фланге хвоста одного из парабионтов ватным тампоном, пропитанным 70–75% алкоголя, чтобы очистить хвост и раскидывать кровеносные сосуды.
- Держите 1,0 мл шприца, содержащего глюкозу в правой руке и держать иглу параллельно вены (менее 15 " ).
- Вставьте иглу в положении примерно 2'4 см от кончика хвоста.
- Впрыските донору 100 кл. глюкозы (1,2 г/кг) в течение 10 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Термин донор относится к парабионт, который получает инъекцию глюкозы через хвост вены. Получателем является другой парабионт, который не получает глюкозу напрямую. - Очистите носы с помощью йодофора. Отрежьте ножницами носовые части ног донора и реципиента и соберите каплю крови в разное время после инъекции глюкозы (1 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 30 мин, 40 мин, 50 мин и 60 мин). Удалите сгусток крови в каждом моменте сбора времени, чтобы избежать большего ущерба.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем собранной крови составил 10-25 ул для одного теста, и 90-225 ул в общей сложности. - Капать кровь в центр глюкометра тест-полоски для обнаружения уровня глюкозы.
- Используйте синий counterstain Эвана в качестве положительного контроля3.
- Впрыските 200 л синего противозатоста Эвана в донорскую мышь.
- 2 ч спустя, эвтаназии парабионтов путем интраперитонеальной инъекции 20 г / l 2,2,2-трибромотанола для каждой мыши в концентрации 0,2 мл/10 г, и собирать кровь из обоих парабионтов путем пробива.
- Центрифуг и образцы крови на 916 х г в течение 15 мин.
- Соберите сыворотку от супернатанта.
- Разбавить сыворотку с 0,9% NaCl в 1:50.
- Измерьте абсорбцию разбавленных образцов сыворотки на уровне 620 нм с помощью спектрофотометра.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
У шести мышей-доноров уровень глюкозы в крови резко повысился до 26,5 мкм/л (173% при увеличении) в среднем на 1 мин после инъекции 100 кЛ глюкозы (1,2 г/кг) через хвостовую вену, а затем постепенно снижался до 13,3 мкм/л при 60 мин. У мышей-реципиентов уровень глюкозы в крови медленно увеличивался после инъекции и достиг первого пикового уровня на уровне 15 мин (увеличение на 47%, 12,2 моль/л). На основе вышеуказанных результатов, стандарт для циркуляции химеризма был установлен следующи...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Парабиоз относится к хирургической технике соединения двух живых животных для создания общей сосудистой системы экспериментальными средствами6,7,8. Преимущество этой модели заключается в том, что вещества, производимые одним человеком, могут действовать на обоих животных одновременно. Таким образом, модель парабиоза может быть использована для изучения роли вещества или фактора в связанном с ним заболевании, производя много знач...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальным фондом науки о природе Китая (81570399 и 817737335), Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая - Научно-исследовательским проектом модернизации традиционной китайской медицины (2017YFC1702003) и Хэй Лонг Цзян Выдающийся молодежный научный фонд (JC2017020).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| изогнутые щипцы | JZ хирургические инструменты, Китай | J31340 | |
| тонкие ножницы | JZ хирургические инструменты, Китай | WA1030 | |
| игольчатый щипец | JZ хирургические инструменты, Китай | 60017961 | |
| 2,5 мл шприцы | Agilent, США | 5182-9642 | |
| Tribromoethano | Sigma-Aldrich, США | T48402-5G | |
| пенициллин | Solarbio, Китай | IP0150 | |
| трамадол | Yijishiye, Китай | YJT712520 | |
| глюкометр | Roche Diabetes Care, Индиана | Accu-Chek Active тест-полоски | |
| Evan's blue Counterstain | Solarbio, Китай | G1810 | |
| крем для депиляции | Nair, США | LL9161 | |
| Warming Blanket ( Грелка) | Kent Scientific Corp, США | TP-22G | |
| Электробритва | Codos, Китай | CP-5000 | |
| 3-0,5-0 хирургический шовный материал | Шанхайская фабрика медицинских шовных игл, Китай | SYZ 3-0#, SYZ 5-0# |
Ссылки
- Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Torres, M., et al. Parabiotic model for differentiating local and systemic effects of continuous and intermittent hypoxia. Journal of Applied Physiology (1985). 118 (1), 42-47 (2015).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153 (4), 828-839 (2013).
- Kamran, P., et al. Parabiosis in mice: a detailed protocol. Journal of Visualized Experiments. (80), e50556(2013).
- Conboy, M. J., Conboy, I. M., Rando, T. A. Heterochronic parabiosis: historical perspective and methodological considerations for studies of aging and longevity. Aging Cell. 12 (3), 525-530 (2013).
- Eggel, A., Wyss-Coray, T. A revival of parabiosis in biomedical research. Swiss Medical Weekly. 144, w13914(2014).
- Brack, A. S. Ageing of the heart reversed by youthful systemic factors! EMBO Journal. 32 (16), 2189-2190 (2013).
- Wu, J. M., et al. Circulating cells contribute to cardiomyocyte regeneration after injury. Circulation Research. 116 (4), 633-641 (2015).
- Kaiser, J. 'Rejuvenation factor' in blood turns back the clock in old mice. Science. 344 (6184), 570-571 (2014).
- Rando, T. A., Finkel, T. Cardiac aging and rejuvenation--a sense of humors? New England Journal of Medicine. 369 (6), 575-576 (2013).
- Heidt, T., et al. Differential contribution of monocytes to heart macrophages in steady-state and after myocardial infarction. Circulation Research. 115 (2), 284-295 (2014).
- McPherron, A. C. Through thick and thin: a circulating growth factor inhibits age-related cardiac hypertrophy. Circulation Research. 113 (5), 487-491 (2013).
- Villeda, S. A., et al. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nature Medicine. 20 (6), 659-663 (2014).
- Katsimpardi, L., et al. Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors. Science. 344 (6184), 630-634 (2014).
- Starzl, T. E., et al. The lost chord: microchimerism and allograft survival. Immunology Today. 17 (12), 577-584 (1996).
- Coleman, D. L. A historical perspective on leptin. Nature Medicine. 16 (10), 1097-1099 (2010).
- Salpeter, S. J., et al. Systemic regulation of the age-related decline of pancreatic beta-cell replication. Diabetes. 62 (8), 2843-2848 (2013).
- Sheldon, R. D., et al. Gestational exercise protects adult male offspring from high-fat diet-induced hepatic steatosis. Journal of Hepatology. 64 (1), 171-178 (2016).
- Martineau, M. G., et al. The metabolic profile of intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and increased fetal growth. Diabetes Care. 38 (2), 243-248 (2015).
- Wang, F., Liu, Y., Yuan, J., Yang, W., Mo, Z. Compound C Protects Mice from HFD-Induced Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. International Journal of Endocrinology. 2019, 3206587(2019).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
