Методическая статья

Выражение, очищение и липосома Связывание подающих надежды дрожжей SNX-BAR Heterodimers

DOI:

10.3791/60413

⸱

6 декабря 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Yale School of Medicine, 2Department of Biological Sciences, University of North Carolina at Charlotte

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем рабочий процесс для выражения, очищения и липосомы связывания гетеродимеров SNX-BAR в дрожжах.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белки SNX-BAR являются эволюционно сохраненным классом мембранных белков, которые играют ключевую роль в сортировке и обороте белков и липидов во время эндоцитоза, сортировки внутри эндосомальной системы и аутофагии. Центральное место в функции белка SNX-BAR является способность формировать гомодимеры или гетеродимеры, которые связывают мембраны с использованием высоко консивенных фокс-гомологии (PX) и BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) доменов. Кроме того, олигомеризация димеров SNX-BAR на мембранах может вызвать образование мембранных трубок и пузырьков, и эта деятельность, как полагают, отражает их функции в качестве белков пальто для эндосомного происхождения транспортных носителей. Исследователи уже давно используют in vitro связывающие исследования с использованием рекомбинантных белков SNX-BAR на синтетических липосомы хипоссомы или гигантские unilamellar пузырьки (GUVs), чтобы выявить точный состав липидов, необходимых для привода мембраны ремоделирования, тем самым раскрывая их механизм действия. Однако, из-за технических проблем с системами двойного выражения, токсичности экспрессии белка SNX-BAR в бактериях, и плохой растворимости отдельных белков SNX-BAR, большинство исследований на сегодняшний день изучили Гомодидеры SNX-BAR, в том числе нефизиологические димы, которые образуются во время выражения в бактериях. Недавно мы оптимизировали протокол для преодоления основных недостатков типичной бактериальной системы экспрессии. Используя этот рабочий процесс, мы демонстрируем, как успешно выражать и очищать большое количество гетеродимеров SNX-BAR и как восстановить их на синтетических липосомах для связывания и трубообразного анализов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мембранные органеллы, такие как плазменная мембрана, эндоплазмический ретикулум, аппарат Голги, лизосомы (дрожжи вакуола) и эндосомы, составляют эндомембранную систему эукариотической клетки. Большинств органеллы имеют способность связывать и обменивать материал с другими organelles через переносится везикулы. Как ячейка координирует упаковку и формирование везикуловых транспортных носителей в рамках эндомембранной системы, не очень понятно. Тем не менее, белки и липиды, которые составляют большую часть эндомембранной системы, как известно, происходят из интернализации эндоцитарных пузырьков из плазменной мембраны (PM). Эндосомя является основной органелью приема для этих пузырьков и состоит из нескольких взаимосвязанных наборов трубчатых органелл. Основная функция эндосомы заключается в содействии приобретению питательных веществ, регулировать оборот белка и липидов, защищать от патогенной инфекции, а также служить основным источником пополнения липидов для плазменной мембраны. Поскольку эндосома получает основную часть грузовых белков и липидов из плазменной мембраны, она действует как сортировочный отсек, изолируя грузы в трубчатые эндосомальные транспортные носители (ETC). Любые белки, не секвестрированные в ETCs, остаются деградированными через эндо-лисосомную систему. Дисрегуляция сортировки грузов в ETCs может привести к потере поглощения питательных веществ, текучесть белка или липидного гомеостаза, что приводит к многочисленным метаболическим, развития и неврологическим расстройствам1,2. Однако, несмотря на центральную роль ETCs в эндосоме, основной механизм того, как эндосома может выборочно координировать упаковку множества неоднородных грузов в трубчатые носители, неизвестен.

Сортировка nexin (SNX) семейство эволюционно сохраненный класс белков, которые были найдены, чтобы иметь решающее значение для многих реакций везикул транспорта в клетке3,4,5. Сортировка нэксинов набираются в эндосомную мембрану и помогают в захвате груза через характерный фаркс-гомологический (PX) домен, который связывает фосфатидинозиноситол-3-монофосфат (PtdIns(3)P), липид, обогащенный на эндосомной мембране. Млекопитающие кодируют тридцать три белка SNX, которые могут быть дополнительно разделены на несколько подсемейств, в зависимости от наличия других доменов1. Наиболее примечательно, что подсемейство SNX-BAR является крупнейшим подсемейством, состоящим из двенадцати человек, в то время как в подающих надежды дрожжах, Saccharomyces cerevisiae, подсемейство сводится всего до семи SNX-BARs. Белки SNX-BAR имеют как домен PX, так и домен Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR), который вызывает липидные резервуары для связывания положительных мембран кривизны. Следовательно, семья SNX-BAR имеет естественное сродство к эндосому и может посредничать образование ETC через их мембранные способности ремоделирования. В пробирке, ремоделирование свойства SNX-BARs может быть вызвано добавлением очищенных SNX-BARs к синтетическим липосомам и последующее образование узких, покрытых трубами могут быть визуализированы с помощью электронной микроскопии. Используя эти методы, исследователи определили, что как концентрация олигомеризации и прочность сужения, как представляется, различаются среди семьи SNX-BAR предполагая, что они могли бы помочь как в формировании и ножницы ETCs.

SNX-BARs могут быть дополнительно классифицированы по их эксклюзивным свойствам димеризации. В пробирке связывания анализы и структурные исследования показали, что SNX-BAR белки могут образовывать только конкретные homodimers или гетеродимы. Таким образом, в принципе, каждый потенциальный SNX-BAR димер-олигомер может обеспечить трубчатый слой для грузоперевозок, а также, ограниченная олигомеризация других протомеров SNX-BAR, может также определять различные пути экспорта. Однако, из-за большого количества SNX-BARs и разнообразия в семейство SNX, одна сортировка nexin-один грузовой гипотеза весьма маловероятно. Вместо этого более вероятно скоординированное усилие с использованием множества факторов, таких как SNX-BARs, груз, липидная специфичность и другие зависимости. Аналогичным образом, недавние исследования дрожжей семьи SNX4 показали доказательства для дополнительной липидной специфичности, за PtdIns (3)P, чтобы потенцировать эндосомы транспортных перевозчиков6. В этом исследовании, SNX-BAR гомодимер MVP1-MVP1 был очищен от бактерий и родной heterodimers Snx4-Atg20 и Vps5-Vps17 были выражены и очищены в высокой урожайности от дрожжей, в то время как только Snx4-Atg20 было установлено, что предпочтительно связывать фосфатидилсериин (PS) и узкая форма. В то время как другие в этой области выявили важные свойства SNX-BARs с использованием рекомбинантно очищенных SNX-BAR homodimers от бактерий, токсичность, связанная с выражением SNX-BAR гетеродимеров в аналогичных системах, препятствовала их родной характеристике7,8,9,10. Поэтому, без надежной системы получения чисто рекомбинантно выраженных местных гетеродимеров, исследователи должны отойти от этих направлений исследования. На рисунке 1, мы представляем четыре части рабочего процесса до 1) построить штамм дрожжей overexpressing SNX-BAR гетеродимеров для тандема сродство очистки, 2) выразить и очистить родной SNX-BAR гетеродимеров, 3) подготовить unilamellar синтетические липосомы, и 4) создать липосомы трубуляции или осадок исследует, обеспечивая жизненно важный инструмент для исследователей, чтобы исследовать растущий каталог сортировки nexins найти в природе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Дрожжи Штамм Строительство

  1. Начните с TVY614 (pep4'::LEU2 prb1::hisG prc1':HIS3)11 в качестве родительского штамма. Этот штамм является недостаточным для вакуолярных протеаз, которые способствуют большинству деградации белка после клеточного лиза, и, следовательно, позволяет более чистой и эффективной очистки.
  2. Дизайн праймеров12 и интегрировать тандем сродство очистки (TAP) тег на C-термина Atg20 (SNX-BAR ORF 1) с использованием гомологичных рекомбинации. Используйте полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для подтверждения интеграции(рисунок 2).
  3. Выполните западный пятно клеточного lysate против тега TAP, чтобы подтвердить правильную интеграцию13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем собирать 3 OD (1 OD - 1 х 107 ячеек) ячеек для проверки SDS-PAGE и западной помок. Обратите внимание, что интеграция тега TAP должна произойти до замены эндогенных промоутеров с промоутером GAL1, чтобы облегчить проверку тегов TAP через западный помарк.
  4. Замените эндогенных Промоутеров Snx4 (SNX-BAR ORF1) и Atg20 (SNX-BAR ORF 2) с немаркированным промоутером GAL1 с помощью последовательной гомологичной рекомбинации и трансформации каждого отдельного ORF14.
  5. Использование фланговых грунтовок за пределами интеграционных сайтов для PCR подтверждают успешную интеграцию(рисунок 2). Это приведет к нулю фенотип целевых SNX-BARs при отсутствии галактоза в среде роста.

2. Дрожжи индукции и SNX-BAR Димер очистки

ПРИМЕЧАНИЕ: Дрожжевые клетки могут распространяться на стандартных YPD (дрожжевой экстракт, пептон, и 2% глюкозы) агар пластины, как изменения хромосомно интегрированы.

  1. Прививать большой мазок клеток в 50 мл стандартного YP (дрожжевого экстракта и пептона) среды с 2% рафинозы и 0,1% глюкозы в качестве источника углерода в колбе по крайней мере 4x объем культуры и расти в одночасье в 30 C шейкер, чтобы обеспечить надлежащее аэрации. Ожидать, что рост в этой среде будет медленнее по сравнению со стандартным YPD.
  2. На следующее утро используйте прекультуру 50 мл, чтобы привить в 1 л стандартной среды YP с 2% рафиноза и 0,1% глюкозы и расти в течение 4-5 ч в 30 кс шейкер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем прекультуры, используемой для прививок 1 L культуры могут быть скорректированы в зависимости от OD600 из прекультуры. OD600 из 1 L культуры после прививки должно быть около 0,2, чтобы по крайней мере два удвоения во время 4-5 ч роста.
    1. Используйте озадачиваемую колбу Fernbach для роста, чтобы обеспечить надлежащее аэрации, 2,8 л объем колбы достаточно. Меньше аэрации может привести к более медленному росту и меньше клеточных гранул при сборе урожая.
  3. Проверьте OD600, чтобы убедиться, что культура находится в фазе журнала (0,5-1) после 4-5 ч роста. В зависимости от роста штамма, внести коррективы в время роста, чтобы по крайней мере два удвоения. Добавьте к 2% галактозы и расти на ночь в 30 кс шейкер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: OD600 после ночного роста может варьироваться, но культура должна быть насыщена. Обратите внимание, что клетки не должны быть удалены из 0,1% глюкозы до добавления 2% галактоза для этого протокола роста. Мы рекомендуем собирать 3 OD неиндуцированных и индуцированных клеток на этом этапе для SDS-PAGE и западной подись для проверки(рисунок 3A,B, переулок 1-2).
  4. Урожайные клетки центрифугированием при 4500 х г в течение 15 мин. Размахивая ротор ведро, который вмещает 1 L объем культуры могут быть использованы здесь.
  5. Перенесите дрожжевые гранулы в коническую трубку мощностью 50 мл; второй шаг центрифугации может быть выполнен по мере необходимости. Клетка гранулы, как правило, около 10-15 мл в объеме, как измеряется градации маркировки и могут быть использованы немедленно или храниться при -80 градусов по Цельсию.
    1. Resuspend гранулы в 15 мл очистки буфера (50 мм Tris pH 7,4, 300 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол (DTT), протеазы ингибитор коктейль), чтобы сделать окончательный объем около 30 мл.
  6. Охладите гомогенизатор 4 градусов по Цельсию перед использованием и уравновесите его с буфером очистки. Лисы клетки с помощью механических клеток разрушитель или гомогенизатор. Загрузите образец в гомогенизатор и лису на уровне 20 000-25 000 пси на 2-3 раунда; обратите внимание, что, как клетки становятся лизинировать, больше вхоза давления требуется для поддержания 20000-25000 пси. Соберите клеточный лисат в конической трубке 50 мл на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если дополнительные образцы должны быть лисицированы, гомогенизатор должен быть тщательно очищен и уравновешжен перед загрузкой следующего образца. Храните все клеточные лисаты на льду.
  7. Немедленно очистить лизат клетки на 35000 х г на 1 ч при 4 c. Аккуратно перенесите супернатант в новую трубку. Обратите внимание, что липиды от клеточного лиза будут плавать к вершине во время центрифугации и не повлияет на очищение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем экономить 0,5-1% лизата и гранул для образцов SDS-PAGE. Как правило, никаких серьезных различий не наблюдается, и дополнительная западная подавливость может быть сделано для подтверждения растворимости белка TAP(рисунок 4, переулки 1 и 2, соответственно).
  8. Равновесие 300 зл и сефарозных бусин IgG с буфером очищения. Добавить в очищенный лизат клетки и инкубировать в течение 2 ч, вращаясь при 4 градусах Цельсия.
  9. Соберите бисер в 10 мл хроматографии колонки и позволяют несвязанных lysate течь через.
  10. Вымойте бусины с использованием 10 мл буфера для мытья (50 мм Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1,5 мМ MgCl2, 1 мМ DTT), добавив 1 мл в то время, и позволяет ему течь через полностью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем экономить 2% от шариков bound-IgG для образца SDS-PAGE. Как правило, мы наблюдаем четыре основные полосы; два белка SNX-BAR и IgG Тяжелые и Легкие Цепи(Рисунок 4, переулок 3). Мы рекомендуем экономить эквивалентные количества "eluate" и "IgG бусы после TEV", чтобы сравнить для эффективности расщепления TEV.
  11. Собирайте бисер и перенесите их в микроцентрифугную трубку. Добавьте к 500 л общего объема со свежим буфером стирки и 2 qL 10 мг/мЛ TEV протеазы и инкубировать на ночь, вращаясь при 4 градусах Цельсия.
  12. На следующее утро, удалить супернатант полностью с помощью 27 G иглы и оценить чистоту белка на 10% полиакриламид SDS-PAGE(Рисунок 4 , переулок4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы получаем 500 л 0,5-1 мг/мл 95% чистого неосмысленности(рисунок 4, переулок 4). Дополнительная очистка с использованием calmodulin ресины также может быть сделано, однако мы обычно видим значительное снижение урожайности и рекомендуем остановиться здесь, если чистота составляет 90%. TEV не мешает липосомы связывания анализы, хотя TEV может быть дополнительно удаленс с помощью Ni-NTA агарозные бусы15.
  13. Чтобы сконцентрироваться, перенесите образец на центробежный фильтр 0,5 мл с 10 KDa отсечения и центрифуги в соответствии с инструкциями производителя до 50 л или меньше. Количественно концентрированных белков с помощью брэдфордпрова анализ. Храните при 4 градусах Цельсия и используйте в течение одной недели.

3. Липосомпрепарат

  1. Приобретите коммерчески доступные липиды: фосфатидилсерин (PS), PI3P, эргостерол и фосфатидилхолин (ПК). При необходимости, resuspend в рекомендуемых растворителя, чтобы сделать акции липидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Липиды переплетаются в метанол/хлороформную смесь в рекомендациях производителя. Убедитесь, что липидные запасы ясны и нагреваются до комнатной температуры перед использованием. Переплетные липиды могут храниться под аргоновым газом и герметиться с помощью восковой пленки (или эквивалента) при -20 градусов по Цельсию в течение 6-12 месяцев или до потери активности.
  2. Рассчитайте объем, необходимый для каждого липидного бульона, чтобы создать смесь с желаемым липидным составом (см. таблицу 1). Предположим, в общей сложности 1 моль липидов в липидной смеси.
  3. Выполните этот шаг в химическом капоте дыма. Очистите стеклянные шприцы, составив полный объем шприца хлороформа и выбросив его в мусорный контейнер. Повторите еще два раза. При передаче хлороформа используйте только стеклянные шприцы или пипетки. При составлении хлороформа, потяните на пробку медленно, чтобы предотвратить введение пузырьков газа в шприц.
  4. Используйте стеклянные шприцы для передачи запасов липидов, как рассчитывается в чистой стеклянной культуры трубки, чтобы сделать окончательный липидной смеси 1% PI3P, 20% эргостерол, 30% PS, PC (Таблица 1). В зависимости от растворителей каждый липид вновь, смесь может стать облачно при добавлении каждого липида.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для изменения концентраций PS (0-30%), регулировать объемы соответственно и компенсировать с различной PC (таблица 1).
  5. Тщательно высушите липидную смесь с помощью азотного газа, направленного на липидную смесь круговыми движениями, чтобы равномерно высушить липиды. Используйте низкий поток газа, чтобы держать липиды в нижней части стеклянной трубки во время процесса сушки. Оберните стеклянную трубку культуры с фольгой, оставляя отверстие нераскрытым, и дальнейшее обезвоживание в вакууме в течение 1 ч.
  6. Добавьте 400 qL связывающего буфера (50 мм Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1 мМ MgCl2),чтобы полностью обезвоживать липиды, чтобы сделать окончательную концентрацию липосом 2,5 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация липосом может быть скорректирована путем добавления более или менее связывающего буфера. Например, при необходимости может быть добавлен 200 связывающий буфер мл для получения липосомного концентрации 5 мМ (см. ниже).
    1. Resuspend липидов, встряхивая на средней скорости на вихре при комнатной температуре в течение 30 мин. Буфер должен появиться облачно, как липиды resuspended.
  7. Передача перепрословых липосом в микроцентрифугную трубку. С этого момента, пластиковые пипетки советы могут быть использованы в качестве липидов больше не resuspended в хлороформ. Обратите внимание, что липосома решение должно выглядеть облачно.
  8. Заморозить-оттепель липосомы семь-восемь раз, погружая микроцентрифугтрубки сначала в жидкий азот, а затем в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Липосомософная смесь должна казаться полностью замороженной и твердой на глаз перед оттаиванием.
  9. Выполните шаги с участием хлороформа в химическом капоте дыма. Очистите два 1 мл стеклянных шприцев, составление и отбрасывание полных объемов шприца хлороформа, в три раза каждый, чтобы удалить любые остаточные липиды. Уравновешивать каждый стеклянный шприц с ультрачистой водой, сооруя два объема шприца, затем уравновешивают с связывающим буфером, составив два объема шприца.
  10. Соберите мини-экструдер в соответствии с рекомендациями производителя. Уравновесите одну мембрану 200 нм и две части фильтра поддерживает (см. Таблица материалов), погрузив каждый в связывающий буфер.
  11. Сэндвич мембраны между фильтром поддерживает и место в мини-экструдер. Чтобы уменьшить мертвый объем в собранном мини-экструдере и убедиться, что сборка герметичная, пройдите объем связывающего буфера, сопоставимый с объемом липосомной смеси через мини-экструдер с помощью стеклянных шприцев 1 мл.
  12. Используйте один из 1 мл стеклянных шприцев и составить липосому смесь. Инвертировать микроцентрифуг трубки для сбора последнего из липосомного смеси в трубке крышка для составления в стеклянный шприц.
  13. Экструдировать липосомы, проходя через мембрану 200 нм 19-21 раз. Соберите экструдированные липосомы в новой микроцентрифуговой трубке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экструдированные липосомы должны выглядеть менее мутными, чем липосомы перед экструзией. Липосомы следует использовать в тот же день и хранить на льду. Последняя экструзия должна поместить липосомы в шприц, противоположный той, в которой она начиналась.

4. Липосомная связывание и трубация SNX-BAR

  1. Преклир очищенный белок при 100 000 х г в ультрацентрифуге в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия до проведения экспериментов по переплету липосом и осадок. Удалить супернатант и перенести его в новую микроцентрифугую трубку; не беспокоить гранулы, если есть один.
  2. Для выполнения липосомного связывания и трубоизоляции инкубировать 4 ММ очищенных Snx4-Atg20 и 2,5 мМ липосом в общем объеме реакции 20 Л, изменяя объем добавленных липосом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В том же эксперименте следует использовать тот же объем липосом.
  3. Инкубировать реакцию при 30 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы предлагаем максимально увеличить количество липосом 2,5 мм, добавленных к каждой реакции, используя не менее 10 липосом, чтобы обеспечить визуализацию во время осадка. Если при реакции 20 мл используется 10 мл липосом 2,5 мМ, то конечная концентрация липосом составит 1,25 мМ. Если очищенные белки разбавляются и требуется больший объем для белка 4 ММ, липиды могут быть повторно в 200 л во время шага регидратации, чтобы удвоить концентрацию липосом (см. Шаг 3.6); однако, это потребует знать концентрацию протеина до делать липосомы.
  4. Визуализируйте и количественно липосомного трубоуляции.
    1. Обработайте реакции связывания липосом немедленно для анализа электронной микроскопии. Пятно образцов на углеродное покрытие медной сетки сетки и отрицательное пятно с использованием 1% уранила ацетата(рисунок 5B)16.
    2. Анализ образцов на трансмиссионном электронном микроскопе (200 кВ).
    3. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для измерения и количественной оценки диаметра тубулы. Для точной количественной оценки диаметра тубулы одной трубки, возьмите три измерения диаметра по длине трубки и среднего(рисунок 5B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения статистической значимости(рисунок 5E)использовался двусторонний анализ дисперсии. Уранил ацетат является как радиоактивным, так и токсичным. Для выполнения этого шага требуется надлежащая сертификация безопасности лаборатории.
  5. Липосома связывания и осадка.
    1. Перенесите реакцию (20 кл., со ступени 4,3) в поликарбонатную центрифугу и используйте совместимый ротор, чтобы вращаться при 100 000 х г в ультрацентрифуге в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия. Аккуратно удалите супернатант и перенесите на новую микроцентрифуговую трубку. Обратите внимание, что гранулы должны оставаться нетронутыми.
    2. Повторное удаление гранул в SDS-PAGE 40 зл и перенос на новую микроцентрифуговую трубку. Добавьте 20 зл буфера образца к супернатану. Нагрузка эквивалентное количество гранул и супернатант в 10% полиакриламид SDS-PAGE гель и выполнять Coomassie окрашивания визуализировать SNX-BARs связаны с липосомами (Рисунок 5A).
    3. Чтобы количественно определить количество комплекса SNX-BAR в фракции гранул, количественно увеличить интенсивность полосы с помощью денситометрии и количественно определить долю белков SNX-BAR в фракции гранул.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения статистической значимости(рисунок 5С)был использован двусторонний анализ дисперсии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод для воспроизводимого и надежного производства эндогенных дрожжей SNX-BAR комплексов, которые могут быть использованы для вниз по течению мембраны ремоделирования анализы(рисунок 1). Конструкция дрожжевого штамма, используемого для очистки, использует эффективность гомологической рекомбинации в подающих надежды дрожжах, допуская модификации на геномных локусах целевых SNX-BARs (Рисунок 2). Эта констру...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы демонстрируем оптимизированный рабочий процесс для очистки димеров SNX-BAR в дрожжах и два анализа для оценки их биофизических свойств на синтетических липосомах. Основным преимуществом перед типичным рекомбинантным выражением белка в Escherichia coli или других системах является способность равномерно выражать белки SNX-BAR у местного хозяина, избегая тем самым проблем с токсичностью и неразрешимости при очистке SNX-BARs в других системах. Примечательно также, что наша система не требует молекулярного ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования, о которых сообщается в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером премии GM060221 и частично Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здоровья под номером премии T32GM007223. Р.К. была частично поддержана Программой грантов на научные гранты факультета КООН и Шарлотта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 μ m PC MembranesAvanti610006
10 мл Поли-Преп Хроматографическая колонка (Bio-Rad)Bio-Rad731-1550
27 G иглаBD Biosciences301629
Amicon Ultra Центробежный фильтр с отсечкой 10KАмиконUFC501024
Авестин EmulsiFlex-C3 ГомогенизаторAvestinEF-C3
BCAПирс23225
Beckman Optima MAX-XP УльтрацентрифугаBeckman Coulter393315
полный коктейль ингибиторов протеазыRoche4693116001
DOPCAvanti850375
DOPSAvanti840035
эргостеролом (Sigma)НаборSigma 47130-U
с Блок 0.2 μ L/1 млAvanti610000
FEI Tecnai F20 просвечивающий электронный микроскоп (200 кВ)
Стеклянные пробирки для культивирования VWR47729-570
Гефарозные шарики IgG (GE Healthcare)GE Healthcare17-0969-01
Стеклянные шприцы MicrolterHamilton7637-01
Нью-Брансуик Excella E25EppendorfM1353-0000или эквивалент встряхивания 30°°; C
Ni-NTA магнитные агарозные шарикиPierce78605
Optima XE-90 УльтрацентрифугаBeckman CoulterA94516
Парапленка MVWR52858-076
PI3PЭшелонP-3016или эквивалент эшелона
Поликарбонатная бутылка в сбореBeckman Coulter355622
TLA-100 Фиксированный угол РоторBeckman Coulter343840
Type 45 Ti РоторBeckman Coulter
Вакуумный десикатор, дно и крышка с раструбным клапаномVWR75871-436
Вакуумный насос Alcatel (Pascal 2005 C1)A & J ВакуумныйPN07050
Vortex с пенодержателемVWR10153-838
VWR KIT MICROTUBEVWR12620-880
экструдеров

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
  2. Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79(2018).
  3. Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
  4. Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
  5. Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
  6. Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
  7. van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
  8. Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
  9. Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
  10. Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
  11. Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
  12. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  13. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  14. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  15. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
  16. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
  17. Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SNX BAR HeterodimersYeast ExpressionProtein PurificationLiposome BindingMembrane RemodelingTransmission Electron MicroscopyUltracentrifugationLipid SpecificityProtein QuantificationExtruder Assembly

Похожие статьи