Методическая статья

Повышение долговечности диссоциированных культур нервных клеток с использованием биологически активного кораллового матрикса

DOI:

10.3791/60443

⸱

3 июня 2020 г.

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Ariel University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Диссоциированная культура клеток гиппокампа является ключевым экспериментальным инструментом в нейробиологии. Выживание и функция нервных клеток в культуре улучшаются, когда коралловые скелеты используются в качестве матриц из-за их нейропротекторной и нейромодулирующей роли. Следовательно, нервные клетки, выращенные на коралловом матриксе, демонстрируют более высокую прочность и, следовательно, более пригодны для культивирования.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Культуры диссоциированных нейрональных и глиальных клеток гиппокампа являются ценной экспериментальной моделью для изучения роста и функции нейронов, обеспечивая высокую изоляцию клеток и контролируемую среду. Однако выживание клеток гиппокампа in vitro находится под угрозой: большинство клеток умирают в течение первой недели культивирования. Поэтому большое значение имеет определение путей повышения долговечности нервных клеток в культуре.

Карбонат кальция в форме кристаллического арагонита, полученного из скелета кораллов, может быть использован в качестве превосходной, активной матрицы для нейронных культур. Питая, защищая и активируя глиальные клетки, коралловый скелет улучшает выживание и рост этих клеток in vitro лучше, чем другие матрицы.

Этот протокол описывает метод культивирования клеток гиппокампа на коралловой матрице. Эта матрица генерируется путем прикрепления зерен коралловых скелетов к культуральным чашкам, колбам и стеклянным покровным стеклам. Зерна помогают улучшить среду клеток, вводя их в тонкую трехмерную (3D) среду для роста и формирования тканеподобных структур. 3D-среда, введенная коралловым скелетом, может быть оптимизирована для клеток путем измельчения, что позволяет контролировать размер и плотность зерен (т.е. шероховатость матрицы), свойство, которое, как было установлено, влияет на активность глиальных клеток. Кроме того, использование зерен облегчает наблюдение и анализ культур, особенно при использовании световой микроскопии. Следовательно, протокол включает процедуры генерации и оптимизации коралловой матрицы в качестве инструмента для улучшения поддержания и функциональности нервных клеток in vitro.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Культуры диссоциированных нервных клеток, в данном случае клеток гиппокампа, являются ценной экспериментальной моделью для изучения роста и функции нейронов, обеспечивая высокую изоляцию и доступность клеток 1,2,3. Этот тип культуры часто используется в неврологии, разработке лекарств и тканевой инженерии из-за большого количества информации, которая может быть собрана, такой как скорость роста и жизнеспособности, нейротоксичность, рост нейритов и создание сетей, синаптическая связь и пластичность, морфологические модификации, организация и проводка нейритов и т. д.1,4,5,6,7.

Несмотря на значимость культур, культивируемые клетки обычно вынуждены расти на стеклянных покровных стеклах в двумерном монослое. Эти строгие изменения окружающей среды значительно снижают способность нервных клеток выживать с течением времени, поскольку стеклянные покровные стекла являются непитательными субстратами с низкой адгезионной прочностью, демонстрирующими меньшую способность поддерживать рост клеток 8,9,10,11.

Поскольку культивируемые нервные клетки вынуждены расти в сложных условиях, важным подходом к повышению их выживаемости было бы максимально возможное имитирование их естественной средыобитания 12,13. Это может быть достигнуто с помощью биоматериалов, которые будут действовать как матрицы и имитировать внеклеточный матрикс клеток, позволяя им формировать тканеподобную структуру и помогать в их питании14.

Использование биоматериалов является перспективным подходом в улучшении клеточных культур, поскольку они действуют как биосовместимые каркасы, обеспечивая механическую стабильность и усиливая различные свойства клеток, включая адгезию, выживаемость, пролиферацию, миграцию, морфогенез и дифференцировку15,16,17. Для улучшения состояния клеток in vitro используется несколько видов биоматериалов. Среди них есть биополимеры, или биологические компоненты, которые обычно входят в состав внеклеточного матрикса клеток. Эти биоматериалы в основном используются в виде полимеризованных покрывающих агентов или гидрогелей18,19,20. С одной стороны, упомянутые выше матрицы дают клеткам знакомую 3D-среду для роста, стимулируют их адгезию к тарелке и дают им механическую поддержку21,22. С другой стороны, их полимеризованная форма и удержание клеток в гидрогелях нарушают доступ клеток к питательным компонентам, присутствующим в питательных средах, а также затрудняют наблюдение за клетками микроскопическими методами23.

Коралловые экзоскелеты представляют собой биологические матрицы морского происхождения. Они изготовлены из карбоната кальция, обладают механической стабильностью и являются биоразлагаемыми. Предыдущие исследования с использованием кораллового скелета в качестве матрицы для выращивания нервных клеток в культуре показали гораздо большую адгезию по сравнению со стеклянными покровными стеклами24,25. Кроме того, нервные клетки, выращенные на скелете коралла, продемонстрировали свою способность поглощать кальций, из которого состоит скелет, который защищает нервные клетки в условиях дефицита питательных веществ26. Кроме того, коралловый скелет является поддерживающей и питающей матрицей, которая увеличивает выживаемость нервных клеток, стимулирует образование нейронных сетей, повышает скорость синаптической связи и позволяет формировать тканеподобные структуры27,28. Недавние исследования также показали, что топография поверхности матрицы кораллового скелета играет решающую роль в распределении и активации глиальных клеток 8,29. Кроме того, коралловый скелет эффективен в качестве матрицы для культивирования других типов клеток, таких как остеоциты30,31, гепатоциты и кардиомиоциты в культуре (неопубликованные данные).

Таким образом, скелет коралла является перспективной матрицей для культивирования клеток in vitro. Таким образом, протокол, подробно описанный ниже, описывает технику культивирования нервных клеток на коралловом скелете для получения более стабильных и процветающих нейронных культур, чем те, которые достигаются существующими методами. Этот протокол также может быть полезен для культивирования кардиомиоцитов, гепатоцитов и других типов клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование животных в этом протоколе было одобрено Национальным комитетом по уходу за животными и их использованию.

ПРИМЕЧАНИЕ: Скелеты кораллов, покрытые карбонатом кальция, следует использовать в кристаллической форме арагонита. Типы кораллов, протестированные до сих пор для нейронных культур, - это Porites Lutea, Stylophora pistillata и Trachyphyllia Geoffroyi. Скелеты можно приобрести целиком или наземно.

1. Очистка частей кораллового скелета

ВНИМАНИЕ: Следующие шаги следует выполнять в химическом шкафу при комнатной температуре, поскольку описанные ниже растворы опасны и могут вызвать ожоги и раздражение.

  1. С помощью молотка разбейте скелет коралла и разделите его на фрагменты по 0,5–2 см. Чтобы растворить органические и неорганические остатки, замочите фрагменты скелета коралла в 10% растворе гипохлорита натрия на 10 мин, затем один раз промойте двойной дистиллированной водой (DDW).
  2. Чтобы удалить оставшиеся органические остатки, замочите фрагменты в растворе NaOH 1M на 5 минут, затем один раз промойте DDW. Продолжайте удаление органических отложений, замачивая фрагменты в 30% растворе H 2 O2в течение 10 минут, затем промойте фрагменты 3 раза DDW.
  3. Удалите как можно больше излишков DDW и оставьте фрагменты кораллов в капюшоне для высыхания (1–8 часов).

2. Очистка покровных стекол

  1. Переложите стеклянные покровные стекла в стеклянную чашку Петри диаметром 100 мм. Добавьте 10 мл 95% этанола в течение 15 мин.
  2. Удалите этанол и промойте DDW 3x, ожидая 10 минут между каждой стиркой. Поставьте блюдо на предварительно разогретую нагревательную пластину с температурой 80 °C, пока DDW не испарится. Аккуратно перемешайте покровные стекла на тарелке несколько раз во время сушки, чтобы они не прилипали друг к другу.
  3. Автоклавируйте покровные стекла.

3. Подготовка коралловых скелетных зерен

  1. Измельчите фрагменты кораллового скелета с помощью ступки и пестика (ручная шлифовка) до полного разрушения. В результате получается смесь зерен размером от 20 мкм до 200 мкм.
  2. В качестве альтернативы можно измельчить фрагменты кораллового скелета с помощью электрического шлифовального станка со скоростью 1000 об/мин в течение 30 с (длина лезвия = 6 см; ширина = 0,5–1,0 см). Результирующий размер зерна аналогичен размерному диапазону, полученному при ручном измельчении.

4. Очистка зерен определенного размерного ряда

ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется контроль над размером зерен в матрице, используйте следующую процедуру очистки зерна на основе фильтрации.

  1. Перенесите зерна на ручной или электрический сетчатый фильтр размером 40 мкм.
  2. Разделите зерна на два конкретных диапазона, просеивая зерна через сетчатое фильтр (при использовании электрического ситечка рекомендуются следующие условия: встряхивание = 600 амплитуд / мин, подпрыгивание = 6 / с). В результате этой процедуры получаются две группы размеров зерна: одна <40 мкм, а вторая >40 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Два размера могут быть определены с помощью сетчатых фильтров с различными ячейками. Если требуется более ограниченный диапазон, то повторно просейте каждую группу, начиная с шага 4.2, через сетчатые фильтры с различными сетками.
  3. Автоклавируйте зерна.

5. Приготовление посуды с коралловым зернистым покрытием или покровных стекол

  1. Для покрытия колб, тарелок или чашек Петри
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги следует выполнять в стерильных условиях.
    1. Добавьте зерна кораллового скелета в раствор поли-D-лизина (PDL) 20 мкг / мл, растворенный в растворе Хэнкса. Рекомендуемая концентрация составляет 5 мг/10 мг зерен на 1 мл раствора PDL.
    2. Раствор разлить по колбам и посуде (примерно 2 мл/25 см2 ) и выдержать в течение ночи при температуре 4 °C. Зерна опускаются и прикрепляются ко дну.
    3. На следующий день вымойте колбы и посуду один раз стерильным DDW. Дайте колбам и посуде высохнуть в вытяжке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно использовать фляги и посуду со свежей оболочкой. Колбы и посуду с покрытием можно использовать в течение недели после нанесения покрытия, если они хранятся при температуре 4 °C. Однако эффективность матрицы может быть поставлена под угрозу.
  2. Покрытие стеклянных покровов (диаметр 12 мм, толщина 0,17 мм)
    1. Добавьте зерна кораллового скелета в DDW в любой желаемой концентрации. Общие плотности, используемые для нервных клеток, составляют 5 мг / мл и 10 мг / мл. Налейте 40 мкл зернового раствора на центр покровного стекла (рис. 4).
    2. Поместите покровные стекла на нагревательную плиту, предварительно разогретую до 80 °C, и дождитесь полного испарения (обычно 15 минут). В этих условиях зерна прилипают к покровному стеколю. Автоклав покровные стекла с покрытием. Хранить в стерильных условиях.
    3. За сутки до культивирования поместите покровные стекла на крышку стерильной 24-луночной пластины. Добавьте 100 мкл 20 мкг/мл раствора PDL к каждому покровному стеклу. Используйте наконечник, чтобы убедиться, что жидкость покрывает всю зерновую область и остальную поверхность покровного стекла.
    4. Накройте крышкой нижнюю часть тарелки. Оберните боковые стороны тарелок парафиновой пленкой. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C.
    5. На следующий день один раз постирайте с DDW и высушите в вытяжке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно использовать свежепокрытые покровные стекла.

6. Культивирование диссоциированных клеток гиппокампа на стеклянных покровных стеклах кораллового скелета с зернистым покрытием

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод культивирования диссоциированных клеток гиппокампа был модифицирован по сравнению с ранее опубликованными процедурами24,27. Описана подготовка культуры для четырех детенышей крысы. Ожидаемый выход из каждого гиппокампа составляет 1–1,5 х 106 клеток.

  1. Настройка
    1. Приготовьте пустую 60-миллиметровую чашку Петри. Налейте 2 мл минимально необходимой среды (MEM) в чашку Петри диаметром 60 мм и положите на лед.
    2. Налейте 2 мл МЭМ в посуду диаметром 35 мм и поставьте в инкубатор при температуре 37 °C, 5–10%CO2. Налейте 2 мл MEM в пробирку объемом 15 мл и держите ее при температуре 4 ° C.
    3. Налейте 1 мл First Day Medium в пробирку объемом 15 мл и поместите ее в инкубатор при температуре 37 °C, 5-10% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состав Среды первого дня описан в Таблице материалов.
    4. Разморозьте 200 мкл 2,5% раствора трипсина и инкубируйте при 37 °C.
    5. Подготовьте три стеклянные пипетки Пастера с головками диаметром 0,5 мм, 0,75 мм и 1,0 мм с помощью пламени.
    6. Подготовьте соответствующие хирургические инструменты: одни большие ножницы, два маленьких ножницы, один большой пинцет, четыре маленьких пинцета и один скальпель.
    7. Подготовьте стереомикроскоп в вытяжке.
  2. Используя большие ножницы, принесите в жертву 0–3-дневных детенышей крысы Sprague Dawley, отделив их головы от тела в пустую 60-миллиметровую чашку Петри (шаг 6.1.1). Утилизируйте тела.
  3. Поднимите головку, вынеся ее изо рта большим пинцетом. Срежьте кожей, покрывающую череп, маленькими ножницами.
  4. Чистыми ножницами войдите под череп (со стороны мозжечка) и разрежьте череп справа и слева, чтобы его можно было удалить. С помощью небольшого пинцета отделите череп от мозга.
  5. Чистым пинцетом отделите мозг от головы и поместите его в чашку Петри диаметром 60 мм, содержащую 2 мл холодного MEM (см. шаг 6.1.2).
  6. С помощью двух маленьких пинцетов препарируйте гиппокамп под стереомикроскопом. Переложите гиппокамп в подготовленную 35-миллиметровую посуду (из шага 6.1.2), содержащую МЭМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 6.3–6.6 следует повторять для каждого щенка.
  7. Разрежьте гиппокамп примерно на 1 мм с помощью скальпеля. Добавляют 200 мкл раствора трипсина (разбавленного до конечной концентрации 0,25%). Аккуратно перемешать и инкубировать при 37 °C, 5–10%CO2 в течение 30 мин.
  8. После инкубации добавьте 2 мл холодного МЭМ (этап 6.1.2) в чашку, чтобы дезактивировать трипсин. Перенесите трипсинизированную ткань в пробирку объемом 15 мл, содержащую 1 мл среды первого дня, предварительно нагретой до 37 °C (этап 6.1.3), с помощью стеклянной пипетки Пастера с наибольшим диаметром (этап 6.1.5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшее соотношение среды и ткани (v: v) для дальнейшей обработки ткани составляет 1 мл / 8 гиппокамп. По возможности избегайте переноса среды с тканью.
  9. Тритуруйте ткань, пропустив ее через стеклянную пипетку наибольшего диаметра 10–15 раз. Затем повторите этот процесс с помощью стеклянной пипетки со средним диаметром. Продолжайте растирание пипеткой наименьшего диаметра. Избегайте пузырей, чтобы уменьшить гибель клеток.
  10. Дайте оставшимся кусочкам ткани впитаться в течение 2–5 минут, затем перенесите надосадочную жидкость в другую пробирку объемом 15 мл. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительная плотность клеток составляет 200 000–400 000 клеток/мл. Используйте First Day Medium для разбавления или центрифугирования в 470 x g для концентрации клеток.
  11. Затравите 100 мкл клеток на каждое стекло. Во время посева обязательно покройте все покровное стекло ячейками. Инкубировать при 37 °C, 5–10%CO2.
  12. На следующий день добавьте в лунки 500 мкл питательной среды для нейронов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав питательной среды для нейронов описан в таблице материалов.
  13. Аккуратно переложите каждое покровное стекло в соответствующее углубление с помощью пинцета, снимая средство первого дня, наклоняя покровное стекло. Отсосите оставшуюся среду от крышки.
  14. Инкубировать при 37 °C, 5–10%CO2. Избегайте замены среды во время инкубации. Культуры можно выдерживать в этих условиях до 1 месяца. Основной проблемой является влажность. Поэтому следите за тем, чтобы инкубатор был максимально увлажнен.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы подготовить матрицу кораллового скелета, весь коралловый скелет (рис. 1А) был разбит на фрагменты размером 0,5–2 см с помощью молотка (рис. 1В) и тщательно очищен от органических остатков в три этапа (шаг 1 в протоколе) с использованием 10% раствора гипохлорита, 1М раствора NaOH и 30% раствора H 2 O2(рис. 1C). Фрагменты кораллов были хорошо очищены, когда цвет скелета изменился с коричневого (рис. 1D) на ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методика, представленная здесь, описывает способ улучшения поддержания и функциональности нервных клеток в культуре. Это достигается путем присоединения клеток к матрице из коралловых скелетных зерен, которая питает клетки и способствует их росту и активности. Использование этого метода увеличивает способность модели нейронной культуры имитировать среду клеток в головном мозге.

Введение матрицы в качестве культурального субстрата имеет ряд преимуществ по сравнению с другими субстратами, исполь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась программой KAMIN Министерства торговли и труда Израиля и компанией Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, США.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24-луночные планшетыGreiner#60-662160
B-27Gibco#17504-044
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma#A4503
D– глюкозаSigma#G8769
Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM)Sigma#D5796
Электрическое ситоAri Levy#3700
Фетальный бычий (FBS)Biological Industries#04-007-1A
First Day Medium85.1% Минимальный Эссенциальный Орлик' В ней содержится 11,5% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки, 1,2% L-глютамина и 2,2% D-глюкозы.
КолбыGreiner#60-69016025cm^2, Тканевая культура обработана
фтордезоксиуридиномSigma#F0503
Стеклянные покровные стеклаMenzel-Glaser#BNCB00120RA1
H2O2Romical#007130-72-19Опасная
смесь питательных веществ Ham's F-12Sigma#N4888
Раствор HANK'SSigma#H6648
Кинуреновая кислотаSigma#K3375
L - глутаминSigma#G7513
Ручное ситечко (40&микро; m)VWR#10199-654
Minimun Essential Eagle (MEM)Sigma#M2279
Ступка и пестикDe-Groot4-P090
NaClO (гипохлорит натрия)Sigma#425044Опасный
NaOHSigma#S8045Опасная
средадля роста нейронов45% MEM, 40% модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM), 10% смесь питательных веществ F-12 Ham, 0,25% (w/v) бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,75% D-глюкозы, 0,25% L-глутамина, 0,5% добавки B-27, 0,1% кинуреновой кислоты, 0,01% 70% уридина и 30% фтордезокси-уридина.
Чашка ПетриGreiner#60-628160, #60-62716060мм, 35мм соответственно.
Poly D – ЛизинСигма#P7280
умный измельчитель дентинаKometaBio#GR101
трипсинGibco#15-090-046
уридинсигма#U3750
,

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32(2015).
  2. Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
  3. Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
  4. Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
  5. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
  6. Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
  7. Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
  8. Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
  9. Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
  10. Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
  11. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
  12. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
  13. Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
  14. Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
  15. Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
  16. Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R. Biomaterials for Brain Tissue Engineering. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1143-1154 (2010).
  17. Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
  18. Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
  19. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  20. Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
  21. Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
  22. Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  23. George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
  24. Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
  25. Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
  26. Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
  27. Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
  28. Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
  29. Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), Bristol, England. 045005(2019).
  30. Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
  31. Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
  32. Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
  33. Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019).
  34. Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
  35. Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
  36. Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
  37. Morad, T. CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , Ariel University. Doctoral thesis (2019).
  38. Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Coral Skeleton MatrixHippocampal Cell CultureNeural Cell DurabilityGrain Size OptimizationSterile Coating ProcedureTrypsin Dissociation MethodHemocytometer Cell CountingPhase Contrast MicroscopyGlial Fibrillary Acidic ProteinMicrotubule Associated Protein Two

Похожие статьи