Методическая статья

Лазерно-индуцированное излучение флуоресценции (L.I.F.E.) как роман неинвазивный инструмент для измерения биомаркеров в Cryospheric Habitats

10K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60447

⸱

26 октября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Ecology, University of Innsbruck, 2Austrian Polar Research Institute, University of Vienna, 3BrainLinks-BrainTools, Bernstein Center Freiburg, 4Atom Science, Kasevich Lab, Stanford University, 5Institute of Experimental Physics, University of Innsbruck, 6Department of Physics, Extraterrestrial Vehicle Instruments Laboratory, Harvey Mudd College

В этой статье

Краткое содержание

Углеродные потоки в криосфере пока практически не оцениваются, но имеют решающее значение в отношении изменения климата. Здесь мы показываем новый прототип устройства, которое захватывает фототрофический потенциал в надрагляционных средах на основе лазерной индуцированной флуоресценции выбросов (L.I.F.E.) технологии, предлагающие высокие спектральные и пространственное разрешение данных в условиях situ.

Аннотация

Глобальное потепление затрагивает микробные сообщества в различных экосистемах, особенно в местах обитания криосферных. Тем не менее, мало что известно о микробных опосредовано углеродных флюсов в экстремальных условиях. Таким образом, методология приобретения выборки, описанная в весьма немногих имеющихся исследованиях, предполагает две основные проблемы: А) данные высокого разрешения требуют большого числа выборок, которые трудно получить в отдаленных районах; B) неизбежные манипуляции образца, такие как резки, распиловки и таяния кернов льда, что приводит к непониманию условий in situ. В этом исследовании представлен прототип устройства, не требующего ни подготовки образцов, ни разрушения образца. Устройство может быть использовано для измерения situ с высоким спектральным и пространственным разрешением в наземных и ледяных экосистемах и основано на l aser-Induced Fluorescence Eмиссии (L.I.F.E.)техники. Фотоавтотрофные супраглационные сообщества могут быть идентифицированы путем обнаружения подписей L.I.F.E. в фотопигментах. Показано калибровку прибора L.I.F.E. для порфирина, производной хлорофиллаa (chla)(405 нм лазерного возбуждения) и B-фикоэритрина (B-PE) (532 нм лазерного возбуждения). Для проверки этой методологии данные L.I.F.E. были ратифицированы обычным методом для хлколичественной оценки, которая включала экстракцию пигмента и последующую спектроскопию поглощения. Прототип применимости в полевых условиях был доказан в экстремальных полярных условиях. Дальнейшие испытания на наземных средах обитания проводились во время аналогового моделирования Марса в марокканском десерте и на австрийском леднике. Инструмент L.I.F.E. позволяет сканировать большие территории с приемлемым разрешением и способствует лучшему пониманию экологического потенциала надувных сообществ в контексте глобальных изменений.

Введение

Криосфера содержит морской лед, ледники, высокогорные озера, снежные районы, ледники озера, талые потоки воды и вечную мерзлоту. Эти области покрывают приблизительно 11% суши Земли1,2 и являются всеобъемлющими атмосферой как признанной криосферной средой. Недавние исследования показывают, что массивные участки криосферы быстро отступают3,4. Антарктические5,6,Альпы7,Арктика8,и другие регионы показывают отрицательные балансы ледяной массы. Отступление ледяных шапок и ледников приводит к истощению нашего крупнейшего пресноводного резервуара на Земле. В некоторых районах, отступление ледника остановить5.

Долгое время ледовые экосистемы считались стерильной средой. Однако, несмотря на суровые условия, наличие активной жизни в криосфере Земли очевидно9,10,11,12,13,14,15 . В связи с тенденцией к массовым потерям льда в результате таяния криосфера переживает сдвиг в биологической активности, затрагивая прилегающие места обитания. Чтобы понять эти частично необратимые изменения, нам требуются методы исследования биологической активности во льду в условиях ситу с высоким пространственным и временным разрешением.

В надувательных средах жизнь можно найти в криоконитных норах, снежных покровах, талой воде, ручьях и на голых ледяных поверхностях. Однако наиболее очевидными суфражистскими местами обитания являются криоконитовые отверстия. Они появляются глобально в оледенелых средах и были впервые описаны шведским исследователем Адольфом Эриком Норденшельдом во время экспедиции в Гренландию в 1870-х16,17. Название происходит от греческих слов "kryos" (холодный) и "konia" (пыль). Темный и неорганический мусор, полученный из эолийской, прикрепляются к поверхности льда и уменьшают альбедо локально. Солнечная радиация способствует таянию мусора в более глубокие слои льда, образуя цилиндрические бассейны с осадками (криоконит) в нижней9. Криоконитовые отверстия покрывают 0,1-10% зон оленей11.

Криоконитовые сообщества состоят из вирусов, грибков, бактерий, цианобактерий, микроводорослей и простейшей. В зависимости от региона, метазоановые организмы, такие как гнилые, нематоды, копеподы, tardigrades, и личинки насекомых также могут быть найдены. Эдвардс и другие18 описывают криоконитовые отверстия как «ледяные горячие точки». Они также прослеживают функциональные гены в криоконитных отверстиях, которые отвечают за N, Fe, S и P велоспорт. Мини-экосистемы озера respire и фотосинтезируют на тарифах найденных в очень более теплых и питательн-богатых habitats11. Эти выводы подчеркивают важную роль микробного секвестра в супраглакиальной среде. Помимо живых сообществ в криоконитных ямах, голые ледяные поверхности населены ледяными водорослями. Их физиология хорошо изучена19, но их пространственное распределение не было оценено20. Их присутствие в supraglacial средах уменьшает альбедо и, следовательно, способствует плавлению, что приводит к питательным outwash и питательных веществ ввода в местах обитания вниз по течению9. Повышение температуры и, следовательно, более высокая доступность жидкой воды влияет на чистую продуктивность экосистем в этих ледяных экосистемах.

В супраглационной среде фотосинтетически активные организмы превращают неорганический углерод и азот в органические, доступные источники микробной пищевой сети21,22. До сих пор Есть несколько исследований, которые оценивают supraglacial углеродныхколебаний 11,20,23. Расхождение в предлагаемых темпах углеродного потока обусловлено низким пространственным и временным разрешением данных. Кроме того, пространственное распределение свращенцев за пределами криоконитных отверстий практически не оценивается. Кук и другие20 предсказал в своих моделях, что supraglacial водорослей общин исправить до 11x больше углерода, чем современные криоконит отверстия из-за их большого покрытия поверхности. Обнаружение супраглациальных водорослей общин обеспечения целостности выборки по-прежнему препятствует из-за отсутствия инструментов для обнаружения на месте и количественной оценки.

В ответ на трудности в области логистики ледовые экосистемы изучаются реже, чем места обитания в районах с умеренным характером. Разрешение данных зависит от количества оцениваемых образцов и зависит от доступности исследуемых участков. Стандартные методы отбора проб, такие как распиливание, корирование и последующее таяние, включают манипуляции микробного сообщества. Например, оценка хлорофилла (chla)в образцах твердого льда невозможна стандартными методами без существенных помех. Таким образом, таяние вызванных изменениями температуры в исследуемых микробных сообществах неизбежны. В ответ на термоловость фотосистемы II и других клеточных структур у психофилов22,лабораторные анализы образцов растаяветого льда всегда приведут к фальсификации условий на месте.

Неразрушающие измерения на месте являются единственным разумным способом получения достоверных данных. Эта цель может быть достигнута с помощью методов, основанных на флуоресценции. Благодаря своей легкой функции сбора урожая, chla и B-phycoerythrin (B-PE) присутствуют в организмах, которые способствуют углеродному циклу в свраглачных средах, как это было доказано Anesio и другими11. Таким образом, эти флуоресцентные молекулы являются подходящими биомаркерами для количественной оценки опосредованных микробами углеродных колебаний в ледяных экосистемах.

В этом исследовании мы представляем разработку, калибровку и применимость нового неинвазивного инструмента для количественной оценки молекул chla и B-PE в наземных и ледяных экосистемах. Прототип устройства основан на лазерной индуцированной флуоресцентной эмиссии, также известной как L.I.F.E. Оптический прибор(рисунок 1) фиксирует флуоресцентные подписи биомаркеров после лазерного индуцированного флуоресценции возбуждения. Процедура неразрушительная и может быть выполнена на месте исследования или в лаборатории.

figure-introduction-1
Рисунок 1: прототип L.I.F.E. Слева: Фотография инструмента без защитной крышки. Справа: Схематическая иллюстрация инструмента. Общая масса - 5,4 кг (лазер и оптика - 4,025 кг, ноутбук - 1,37 кг). Алюминиевая рама 32,5 см х 20,3 см х 6,5 см. Оптическая трубка: 18,4 см х 4 см (диаметр). CCD: датчик bluefox mv220g; F: сервоуправляемые фильтры с длинным проходом (450 нм и 550 нм); L: оптические линзы; M1: зеркала; M2: дихроическое зеркало; MC: микроконтроллер; П: призма; PBS: поляризационный сплиттер пучка; S: щели диафрагмы из регулируемых лезвий бритвы. Шкала бар 70 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Портативный двухволновый комплект весит 4,5 кг и используется на штативе в сочетании с внешним компьютером. Установка поля быстрая и легкая. Инструмент крепится к штативу, а трубка объектива крепится к устройству вместе с USB-кабелем и кабелем камеры. Внешний компьютер подключен к инструменту с помощью USB-кабеля. Ноги штатива отрегулированы таким образом, что трубка объектива направлена на образец и покрывает его. Затем зеленый лазер размером 5 мВт попадает в образец после прохождения поляризационного сплиттера, который перенаправляет поляризованный свет к оптической оси спектрометра. Образец обладает флуоресцентным светом, иллюстрированным красным цветом на рисунке 1. Половина коллимированного света проходит поляризационный сплиттер луча и сосредоточена через сервоуправляемый фильтр с длинным проходом, который удаляет лазерные сигналы. Далее сигнал попадает в щель диафрагмы, состоящую из двух регулируемых лезвий бритвы. Призрак спектра отделяет тонкую линию света ортогонал к щели диафрагмы, прежде чем сигнал захвачен датчиком. Процедура повторяется с помощью синего лазера. Необработанные данные автоматически передаются на портативный компьютер, который также используется для работы программного обеспечения.

Инструмент управляется внешним компьютером с помощью среды LabVIEW, которая синхронизирует съемку с камерой CCD, включение/выключение лазеров и включение длиннопроходного фильтра. Графический пользовательский интерфейс (GUI) разделен на три основных раздела. Регулировка экспозиции выполняется вручную. Хотя коррекция между временем экспозиции и интенсивностью сигнала линейна(рисунок 2B),максимальное время экспозиции ограничено 10 с, поскольку более длительные сроки интеграции приводят к значительному снижению коэффициента сигнала к шуму. Поле комментариев используется для описания образца(рисунок 2A). В правом разделе, сырые изображения отображаются, как только измерения закончены. Эта функция имеет решающее значение для немедленной оценки данных в поле(рисунок 2C-E). Красные области указывают на переэкспонированные пиксели, которых можно избежать, сократив время экспозиции.

Последующий процесс сокращения необработанных данных отделяется от процедуры получения изображения и может быть выполнен в любое время после приобретения изображения.

figure-introduction-2
Рисунок 2: графический пользовательский интерфейс L.I.F.E. для сбора данных и оценки необработанных данных. (A) Программное обеспечение позволяет ручной ввод текста для описания образцов. (B) Время экспозиции может быть скорректировано до измерения. (СЕ) Необработанные изображения отображаются на правой стороне интерфейса. (E) Красные цвета указывают на насыщенность датчика. (F) Активация кнопки RUN MEASUREMENT запускает процесс получения данных. В массиве (G), отображаются все команды, выполняемые автоматически при получении данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-introduction-3
Рисунок 3: Пример необработанного изображения. Слева: Сырые данные chlстандарт в растворе ацетона, записанные с помощью инструмента L.I.F.E. Благодаря оптическим свойствам устройства сигнал отображается как искривленная линия. Справа: Интерпретация исходного изображения на пиксель (px). Спектральная ось (разрешение 5 нм/px) построена на фоне пространственной оси (разрешение 30 мкм/px). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

12-битные серые необработанные изображения показывают пространственный компонент из-за одномерной щели диафрагмы и спектрального компонента из-за призмы перед CCD (Рисунок 3). В ответ на оптические ограничения необработанные изображения искажаются. Поэтому их необходимо обрезать и обезображить, применяя код, признающий степень искажения. Это делается с мастером программного обеспечения(Рисунок 4). Далее калибровка длины волны осуществляется с помощью лазера 532 нм. Зеленый свет производится путем удвоения частоты инфракрасного лазера на 1064 нм. Обе длины волн могут быть обнаружены CCD и, следовательно, спектральное положение каждого пикселя может быть рассчитано в dewarped изображения автоматически (Рисунок 4).

Затем картинка обрезается до заданного диапазона длин волн (550-1000 нм для измерений зеленого лазера и 400-1000 для синих лазерных измерений). Серые значения от каждого пикселя в выбранной строке пикселей подсчитываются и суммируются. Серое значение может варьироваться от 0 до 255. После этого каждая строка пикселей приходится на одно число. Дальнейшие инструкции по программному обеспечению на экране приводят к генерации сюжета, показывающего, что серое значение отсчитывается от каждой строки пикселей, построенной на основе пространственных координат. Это позволяет одновременно обеспечить количественную пространственную дискриминацию chla и B-PE в выборке. Кроме того, спектральные свойства образца могут быть построены из выбранных пиксельных линий автоматически.

figure-introduction-4
Рисунок 4: Развенчивая необработанные изображения. Слева: Сырое изображение, снятое зеленым лазером. Фильтр не использовался. Сигналы отображаются на 532 нм и 1064 нм. Время экспозиции 0,015 с. Центр: обрезанный сигнал 532 нм используется в качестве эталонной линии для раздува набора изображений. Справа: Dewarped изображение из исходного источника изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Протокол

1. Калибровка и проверка

ПРИМЕЧАНИЕ: Для калибровки пигмента, подготовить разбавления строки из запасов решений chla и B-PE. Раствор хлбульона разбавляют ацетоном, а B-PE разбавляют дистиллированной стерильной водой. Позже потребуется 15 мл каждого шага разбавления. Защитите пигменты от света, обернув их алюминиевой фольгой. Храните chla в морозильной камере и B-PE в холодильнике до дальнейшего использования. Подробный протокол для строки разбавления следует в разделах 1.1 для chla и 1.2 для B-PE. Ниже описанакак кхлная и лабораторная калибровка B-PE для обнаружения пигмента и количественной оценки с помощью прибора L.I.F.E. Предыдущая калибровка24 была сделана с теми же пигментами, что и в данном исследовании.

  1. Хлорофилл разбавления строки
    1. Растворите 1 мг хлa (очищенного от водорослей A. nidulans) с ацетоном в 50 мл пробной трубки и разбавьте этот хлбульонный раствор с ацетоном до следующих конечных концентраций: 1000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5; 1; и 0,5 нг/мл.
    2. Перенесите 15 мл каждого разбавления в 50 мл пробных трубок и накройте их алюминиевой фольгой из-за светочувствительности. Храните трубки в морозильной камере -20 градусов до тех пор, пока не будут проведены измерения калибровки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть прерван здесь.
    3. Измерьтефункции поглощения chl от каждого разбавления в двухлучевом спектрофотометре в виде триплетатов и вычислитесодержание chl, описанное Лоренценом25, который будет подробно описан в разделе 2.2.2.
  2. Строка разбавления PE
    1. Разбавить 4 мг/мл бульонного раствора B-PE стерильной фильтрованной водой (pH no 7) до следующих конечных концентраций: 1000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; и 5 нг/мл B-PE. Перенесите 15 мл каждого разбавления в 50 мл пробной трубки и накройте его алюминиевой фольгой. Хранить при 4 градусах по Цельсию до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть прерван здесь.
  3. Настройка для калибровки
    1. Постройте стойку, как показано на рисунке 5, чтобы установить три измерительные платформы, каждая из которых на 1,5 см выше следующей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высота стойки и столбца играют важную роль для измерений, поскольку поверхность жидкостей должна оставаться в координационном центре прибора L.I.F.E., указанного на рисунке 5.
    2. Добавьте 5 мл самого высокого концентрированного разбавления в полицинтилляционный пластиковый флакон и положите его на самую высокую точку стойки. Измерьте интенсивность флуоресценции.
    3. Поместите флакон в среднее положение стойки и добавьте еще 5 мл (10 мл общего объема). Измерьте интенсивность флуоресценции. Повторите процедуру в самом низком положении на стойке с другой 5 мл (15 мл общий объем; в общей сложности 45 мм в высоту колонны).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптировать время экспозиции для каждого шага разбавления, чтобы предотвратить насыщение детектора (серые значения более 255 на 12-битных изображениях) и для достаточного соотношения сигнала к шуму слабых сигналов флуоресценции.
    4. Повторите шаги 1.3.2 и 1.3.3 со всеми разбавлениями (шаги 1.1.1 и 1.2.1) chla и B-PE.
    5. Загрузите генерируемые файлы данных в мастер сокращения данных, чтобы автоматически подсчитать и суммировать серые значения от каждой пиксельной линии вдоль Y-оси (пространственное распределение).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение времени экспозиции компенсируется автоматически путем нормализации интенсивности флуоресценции до времени интеграции 1 с.
    6. Рассчитайте плотность пигмента с помощью регрессионного анализа Пуассона, используя известные концентрации из серии разбавления и нормализованную интенсивность флуоресценции, которые были рассчитаны. Затем нормализовать количество флуоресценции с трех различных высот столбца до 1,5 см (5 мл) путем умножения отсчетов с каждой высоты столбца с коэффициентом (факторы 1, 0,5 и 0,33, для 5 мл, 10 мл и 15 мл концентрационных растворов соответственно).

figure-protocol-1
Рисунок 5: Настройка для калибровки L.I.F.E. с кхльюa и B-PE в лабораторных условиях.
(A) Ленс трубки инструмента. (B) Зеленый лазер для возбуждения B-PE. (C) Синий лазер дляchl возбуждение. (D) Scintillation флакон. (E) Координационный центр l.I.F.E. инструмент. (F) B-PE/вода или chla/acetone раствор с 5 мл, 10 мл и 15 мл. (G) Космические ракеты, которые держат поверхность каждого раствора в фокусной плоскости в течение трех различных томов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

2. Отбор проб и обработка проб

  1. Коллекция снега и льда
    1. Собирайте снег и надраглациальный лед из ледника в стерильные полиэтиленовые пакеты и храните их замороженными до дальнейшей обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования, образцы были собраны в Мидтре Lovenbreen (MLB), политермальный ледник вблизи исследовательской деревни Ny-Олесунд в высоком Арктическом архипелаге Шпицберген (78'53 'N, 12'03' E).
    2. Пример бактериальных ковриков из ледникового поля в стерильные полиэтиленовые пакеты и транспортировать все образцы в лабораторию для дальнейшей обработки.
    3. Растопить замороженный материал медленно в темноте при температуре 4 градусов по Цельсию. Фильтруй жидкие образцы на фильтрах GF/F (диаметр 47 мм) и обратите внимание на отфильтрованный объем. Держите фильтры замороженными до дальнейшей обработки.
  2. Хлорофилл измерения
    1. Используя инструмент L.I.F.E., измерьте фильтр в четырех случайных областях, каждый в трипликисах с помощью зеленого и синего лазера. Рассчитайте общую концентрацию пигмента, умножая плотность области с отфильтрованной областью и отфильтрованным объемом. Нормализовать концентрацию пигмента (мкг/л) до объема 1 л.
    2. Оценитесодержание chl фильтров GF/F с лабораторным стандартом в соответствии с протоколом Лоренцена25. Для этого поместите каждый из фильтров во флакон с 13 мл ацетона и храните их в темноте при 4 градусах Цельсия на ночь. Далее возьмите флакон и поместите его на лед до звуков в течение 2 минут при 50% мощности в непрерывном режиме. Сожмите и удалите фильтр с флакона.
    3. Прикрепите тигоновые трубки к шприцу и удалитеиз флакона смесь экстракции-ацетона. Замените трубку тигона на держатель фильтра GF-5. Перенесите раствор в кварцевый кювет.
    4. После калибровки спектрометра абсорбции для ацетона поместите образец в кювет в спектрометр и измерьте абсорбционные объекты между 400–750 нм. Затем снимите квет из спектрометра и добавьте в образец 200 кл 2 М ЛК. Затем повторите измерение абсорбции для измерения содержания фаеофитина в образце.
  3. Измерение микробной активности с помощью радиомаркированных маркеров и влияние интенсивности лазеров и времени воздействия на производительность
    ВНИМАНИЕ: Остерегайтесь маркерной радиоактивности (яп. Используйте лабораторное пальто, перчатки и очки, и работать под дымом капот в лицензированной лаборатории изотопов.
    1. Для бактериального производства перенесите пять аликотов бактериальных ковриков в стерильные полиэтиленовые пакеты. Инактивируйте элементы управления формальдегидом до 4% конечной концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Три aliquots используются для 3H-маркированных лейцинов поглощения и два aliquots используются в качестве элементов управления.
    2. Вынатите коврики с помощью синего лазера (405 нм, 5 мВт) и зеленого лазера (532 нм, 5 мВт) по 10 с и 30 с каждый. Повторите процедуру с помощью лазеров 50 мВт. Затем инактивируйте образцы, которые не были обработаны формальдегидом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Один коврик используется только для одного лазерного воздействия. Используйте неподвергающиеся микробным коврикам в качестве элементов управления.
    3. После лазерной обработки, оценить бактериальной и первичной продукции путем включения 3H-лейцин и14CO3, соответственно. Для измерений производства бактерий используйте пять аликвот на образец (20 мл) и добавьте формалин (4% конечной концентрации) к двум параллелям, которые служат в качестве контроля для абиотического включения маркера. Добавьте 3H-лейцина (40 нм) во все образцы различных методов лечения и инкубировать их в течение 4 ч при условии на месте (0,1 градуса по Цельсию). Прекратите реакцию, добавив формалин к оставшимся живым образцам.
    4. Для бактериального производства бактериальных ковриков, передача помеченных образцов в криовиалы. Извлекайте клетки с 5% трихлороацетической кислотой и центрифугой при 10 000 х г в течение 5 мин в соответствии с протоколами Кирхмана26 и Bell27. Добавить сцинтилляционную жидкость и положить криовиальный в флакон пополнительности. Проанализируйте образцы с помощью счетчика жидкостного сцинтилляции и вычислите скорость поглощения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Три aliquots используются для 3H-маркированных лейцина поглощения, два aliquots используются в качестве элементов управления.
    5. Для первичного производства, подготовить пять реплик различных процедур (100 мл), обернуть два из них в алюминиевую фольгу, чтобы имитировать темные образцы, и добавить14CO3 (1 Ci) для всех. Инкубировать 4 ч в освещении окружающей среды и температуре на месте (0,1 градуса по Цельсию). Прекратите реакцию, затемнив оставшиеся три репликации и процедите образец на фильтры GF/F (диаметр 25 мм).
    6. Добавьте 100 кЛ 2 N HCl к фильтрам для того чтобы извлечь весь сверхнормальный углерод и препятствовать ему вне под капотом дыма. Высушите образцы на нагревательной пластине при 80 градусах Цельсия и поместите образцы в флаконы по полицинтилляции.
    7. Для измерения радиоактивных дезинтеграций в минуту (dpm) всех методов лечения первичного и бактериального производства, поместите криовиалы в флаконы пополнители и добавьте 5 мл сцинтилляционного коктейля. Измерьте dpm с жидким счетчиком сцинтилляции и вычислите тарифы поглощения.

Результаты

Лабораторная калибровка для B-PE
Сигналы реакции b-PE разбавления были измерены с прибором L.I.F.E. в темной комнате на 20 c(рисунок 6). Скорость подсчета зависела как от концентрации, так и от высоты столбца измеренного образца. Низкая концентрация и низкая высота колонны B-PE образца флуоресцентный сильнее по сравнению с образцами той же концентрации и более высокой высоты столбца.

figure-results-1
Рисунок 6: лабораторная калибровка B-PE. Показано содержание B-PE и калибровка плотности столбцов. Нормализованные ставки подсчета были рассчитаны для колонны высотой 1,5 см. Перепечатка с разрешения28. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Регрессия Пуассона была использована для окончательной линии калибровки. Существовала линейная корреляция между плотностью области и пиксельсерым серым значением. Функция кривой была y 81.04x(Рисунок 7),что означает, что серая скорость подсчета значений 8104 в 1 с открытой выборке равна плотности области 100 нг/см2 B-PE. Калибровка chl настроена аналогом. Функция была у 8.94x.

figure-results-2
Рисунок 7: Окончательная кривая калибровки для B-PE. Серые значения были нормализованы до времени экспозиции 1 с и построены против плотности области. Перепечатка с разрешения28. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Применение криоконита образцов Шпицбергена и лабораторная проверка данных
Средние значения измерений L.I.F.E. и одиночные измерения одних и тех же образцов, полученных из обычной добычи с использованием ацетона и последующего анализа с помощью спектрофотометра, иллюстрируются на рисунке 8.

figure-results-3
Рисунок 8: Проверка данных с натуральными образцами. Образцы (MLB) ранжируются посодержанию chl, на основе результатов лабораторного спектрофотометра (одиночные значения) и сравниваются скхли данных флуоресценции, измеренных на четырех случайных областях на фильтр. Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение измерений L.I.F.E. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Хлсодержимое в диапазоне от 48 мкг/L-67 мкг/л были недооценены, а более низкоесодержание chl от 0,7 мкг/Л-7 мкг/л было переоценено прототипом L.I.F.E. Стандартные отклонения от измерений L.I.F.E. были низкими.

Сравнение спектральных данных измерений на месте с лабораторными стандартами
Chlспектра были сопоставимы между криоконит образцов и те, очищенных от водорослей A. nidulans. Пики флуоресценции во всех образцах были расположены на уровне 700 нм-710 нм. Тем не менее, спектры, полученные из криоконит образцов показали более высокие шумовые сигналы между 400 нм-650 нм и от 800 нм-1000 нм по сравнению с спектрамиКХЛ пигмента стандарта (Рисунок 9).

figure-results-4
Рисунок 9: Интерпретация спектральных данных. Измерения четырех гранул криоконита (синий) и хлстандартный пигментный раствор (красный) после возбуждения с 405 нм лазеров. Спектры были записаны через год после сбора образцов. Образцы были заморожены и не подвергались воздействию света до начала измерения. В ответ на вопросы калибровки длинволн пик флуоресценции расположен на уровне 700 нм-710 нм вместо 680 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Автоматизированный анализ криоконитного зерна
В примере автоматизированного анализа криоконитного отверстия(рисунок 10),самая высокая плотность пигментной области наблюдалась на пиксельной линии 50. Спектр образца после возбуждения с лазером 532 нм показал пик с отрезанным на сером значении 255 в ответ на перенасыщение датчика. Этот пик получен от зеленого лазера, а не от флуоресцентного сигнала.

figure-results-5
Рисунок 10: Автоматизированный анализ данных одного криоконитного гранулы диаметром 1 мм. Образец был собран в Вестре Брюггербрене (VBB) и измерен в пределах 4 ч после взятия проб в темной лабораторной комнате на объекте Арктической станции (ГБ) в Ню-Олесунде. Левая колонка показывает измерения B-PE, а правая колонка представляетданные chl. Необработанные изображения отображаются сверху. Лазерно-индуцированные флуоресценции ответы отображаются в серый цвет. Красные области указывают на реакцию стандартных пигментов. Средний раздел иллюстрирует пространственное распределение целевых пигментов. Спектральные свойства флуоресценции сигнала отображаются в нижних изображениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Влияние лазерного возбуждения на производительность в бактериальных ковриках
Ни первичной, ни бактериальной производительности не были затронуты при увеличении мощности лазера и / или время воздействия(рисунок 11). При лазерном лечении с повышенной мощностью не было обнаружено существенных различий.

figure-results-6
Рисунок 11: Измерения производительности образцов со Шпицбергена. Бактериальные коврики были выставлены с зелеными и синими лазерами различной интенсивности лазера и времени экспозиции. Данные окрашены в соответствии с источником длины волны лазера (зеленый и синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обсуждение

Калибровки
Существовала линейная корреляция между концентрацией пигмента и интенсивностью флуоресценции после нормализации количества фотонов до времени экспозиции 1 с. Образцы с низкой высотой столбца и низкой концентрацией пигмента привели к завышению целевых пигментов, по сравнению с более высокими высотами столбцов с той же концентрацией пигмента. Кроме того, слабые сигналы флуоресценции требует длительного времени экспозиции для достаточного количества фотонов на датчике. Однако длительное время интеграции также увеличило количество рассеянного света на датчике, что привело к снижению соотношения сигнала к шуму. В своей текущей версии программное обеспечение не может различать шум и сигнал в процессе сокращения данных. Таким образом, низкие измерения интенсивности флуоресценции привели к переоценке пигмента, поскольку шум считался сигналом, полученным из целевых пигментов. Кроме того, интенсивность флуоресценции от более концентрированных пигментных растворов показала большую изменчивость, чем растворы низкой концентрации. Этот эффект можно объяснить процессами поглощения в пигментных растворах, которые использовались для кривой калибровки.

Проверка данных для хлорофиллаколичественной оценки
После фильтрации образцов льда и снега трехмерные образцы почти появились в виде двухмерного образца на фильтре. Это оправдывало прямое сравнение L.I.F.E (плотность области) и спектрофотометрических данных (объемные измерения).

Набор данных(рисунок 8) указывает на то, что высокая концентрация пигмента приводит к недооценке, в то время как низкая концентрация пигмента приводит к завышению фактического значения. Этот эффект можно объяснить толщиной фильтровального торта и, следовательно, объемным характером образца. Глубина проникновения лазера зависела от оптической плотности и толщины образца. Высокое содержание пигмента было недооценено, потому что лазер не мог вызвать пигментную флуоресценцию в более глубоких слоях. Однако, в тонких тортах фильтра, низкие сигналы флуоресценции были захвачены из-за низкой плотности области пигментов. По-видимому, сам фильтр показал лазерно-индуцированных сигналов после прохождения 450 нм длиннопроходной фильтр(рисунок 12). Этот сигнал был ошибочно засчитан как сигнал флуоресценции, полученный из chla. Таким образом, тонкие и слишком толстые фильтры торты трудно измерить с помощью инструмента L.I.F.E.

figure-discussion-1
Рисунок 12: Fluorescence сигналы от толстых (A) и тонких (B) фильтр торты на фильтре GF / F. (A) Самозатевание предотвращает лазерную флуоресценцию из более глубоких слоев, что приводит к недооценке фактической концентрации пигмента. (B) Fluorescence из-за фильтра торт с наложением на фильтр отражения. (C) Сырые данные показывают отражение фильтра (серый). Спектральное свойство лабораторного chl флуоресценции иллюстрируется красным цветом. Шкала бар 45 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Ограничения прототипа L.I.F.E.
Во время сокращения данных закодированное программное обеспечение MATLAB интерпретировало необработанные изображения, подводя итоги пиксельных линий в пределах заданного диапазона длин волн. В текущей версии программного обеспечения не проводится различия между органическими и неорганическими производными сигналами. Наличие нескольких сигналов может привести к завышению фактического содержания пигмента. Длительное время экспозиции из-за низкой интенсивности флуоресценции привело к снижению соотношения сигнала к шуму, способствуя эффекту, как описано выше (см. рисунок 8 и рисунок 12).

Геодовые породы, показанные на рисунке 13, продемонстрировали красный флуоресцентный свет при воздействии зеленым и синим светом. В настоящее время не ясно, является ли флуоресценция результатом минералов или из порфирина на основе молекул. Таким образом, наложение биологических и небиологических сигналов может ограничить применение этого метода и потребовать создания базы данных флуоресценции, специально созданной для прототипа L.I.F.E.

figure-discussion-2
Рисунок 13: Минеральная флуоресценция из геодовой породы, найденной в Ню-Олесунде. Скала была возбуждена с 532 Нм 50 мВт лазера (A) и 405 нм 50 мВт лазера (B). Обе фотографии были сняты с помощью фильтра поляризации, прикрепленного на объективе, что привело к фальсификации фактических цветов флуоресценции. (C) Истинное цветное изображение без использования фильтра поляризации в условиях дневного света. Шкала бар 40 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Баутлер и другие29 пришли к выводу, что характерные спектры выбросов цианобактерий в морских экосистемах зависят от условий окружающей среды. Также метаболическое состояние влияет на флуоресценцию в фототрофических организмах30. Инструмент L.I.F.E может различать водоросли и цианобактериальную флуоресценцию с помощью библиотек био-отпечатков пальцев, содержащих спектральную информацию о образце, коррелируете с условиями окружающей среды.

В темных адаптированных chl молекул, все центры реакции полноо окислены и доступны для фотохимии и не урожайность флуоресценции угасает31. Используя процедуру L.I.F.E., образец сначала возбуждается лазером 532 нм (зеленый), а затем лазером 405 нм (синий). Во время второго возбуждения синим лазером, chla может показать снижение реакции флуоресценции из-за предварительного возбуждения зеленым лазером. Chla поглощает энергию на длине волны 532 нм, несмотря на ее расстояние от его поглощения максимальной длины волны32. Передфактическим хл измерения на 405 нм, зеленый лазер может вызвать фотохимические реакции, активации механизмов закалки в целевых пигментов. Кроме того, предварительное освещение морских фототрофических организмов не привело к изменению кривых спектральной нормы между 450 нм-600 нм, в то время как стандартное отклонение в интенсивности флуоресценции увеличилось на 25%29. В зависимости от вида, интенсивность флуоресценции даже увеличилась в ответ на предыдущее возбуждение. Эта тема требует дальнейшего изучения.

Применимость
Мы протестировали прибор L.I.F.E. в различных средах обитания с акцентом на криоконитные отверстия. Лазер был успешно применен в почве и биопленки обитания из-за отсутствия окружающего света во время измерения. Криоконит гранулы могут быть измерены, когда осадок слоев заблокирован свет из-под отверстия(Рисунок 14A,C). Тонкие отложенные криоконитовые отверстия проницаемы для бродячего света снизу(рисунок 14B). Бродячий свет мешает измерению. Таким образом, концентрация пигмента в голых ледяных поверхностях пока не поддается измерению при дневном свете. В настоящее время ведутся усилия по обработке сигналов, с тем чтобы обеспечить работу системы в условиях высокой окружающей среды.

figure-discussion-3
Рисунок 14: Криоконитовое отверстие с жидкой водой сверху. (A) Криоконит на леднике с l.I.F.E. трубка объектива. Шкала бар 70 мм. (B) Слой осадка (красный) очень тонкий. Бродячий свет кровоточит через криоконитный слой. (C) Слой осадка достаточно толстый, чтобы блокировать бродячий свет снизу. Этот тип криоконитного отверстия поддается измерению с помощью инструмента L.I.F.E. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

В заключение, наш прибор L.I.F.E. обнаружил фотоавтотрофные организмы в наземных средах обитания, таких как почвы, бактериальные коврики, биопленки, а также в криоконитных отверстиях на ледниковых поверхностях. Молекулы-мишени были chla и B-PE. Пространственное разрешение составляло 30 мкм/пхс. Предел обнаружения chla составлял 250 пг/мл и 2 нг/мл для B-PE. После лабораторной калибровки мы смогли количественно определить содержание пигмента в образцах, которые были собраны на нашем учебном полигоне в Арктике. Мы применили самозапрограммированное программное обеспечение для автоматизированного процесса сокращения данных. Последствия присутствия минералов и изменяющиеся условия освещения во время измерений требуют дальнейшего изучения.

С потеплением климата повышение температуры приводит к повышению доступности жидкой воды, что приводит к повышению биологической активности на ледяных поверхностях автотрофического и гетеротрофного характера. Следует приложить энергичные усилия для выявления гетеротрофных организмов на месте, чтобы дать полную картину активной жизни в криосфере. Это может быть проверено с другими пигментами цели и соответствующие длины волн лазерного возбуждения. Таким образом, L.I.F.E. обеспечивает подходящую систему мониторинга, обеспечивающую высокое временное и пространственное разрешение для препонных условий в контексте глобальных изменений, а также возможных астробиологических применений.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы с благодарностью благодарят полковника (IL) J.N. Pritzker, Фонд Тавани, США, Австрийское федеральное министерство науки, исследований и экономики (Sparkling Science SPA04-149 и SPA05-201), Alpine Forschungsstelle Obergurgl (AFO), Австрийский космический форум ( Роман Эрлер из Hintertuxer Natur Eis Palast, австрийский федеральный менеджер лесного хозяйства и базы Ник Кокс с арктической станции в Ню-Алесунде (Шпицберген). Мы также в долгу перед Сабриной Обвегезер, Кариной Рофер и Фабианом Дрюза за помощь во время съемок. Наконец, мы хотим поблагодарить Джеймса Брэдли за предоставление голоса для сопутствующего видео.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ацетонMerck67-64-1
B-фикоэритрининвиртрогенP6305
хлорофилл стандартныйSigma-AldrichC6144-1MG
формалинMerckHT501128фильтры 36%
GF/CватманWHA1822025диаметром 25 мм
HClMerckH175836,5-38%
L.I.F.E. ПрототипУниверситет Инсбрукапостроен по запросу
LabViewNational InstrumentsПрограммное обеспечение, лаборатория виртуального приборостроения Рабочий стол
Leucine, L-[4,5-3H], 1 мКиPerkin ElmerNET1166001MCрадиоактивный
жидкий сцинтилляционный коктейль Beckman Ready UseBeckmanбольше не доступен, может быть компенсирован Ultra Gold, Packard
жидкий сцинтилляционный счетчикBeckmanотсутствует в наличииLSC 6000 IC
NaH14CO3 (4 & микро; Ci/ml)DHI Дания4 μ Ci/мл, 1 млрадиоактивные
фильтры из поликарбонатаDHI DenmarkPCTEдиаметр 25 мм, 0,2&микро; m размер пор
Полисцинтилляционные флаконыPerkin ElmerWHA182504720 мл
пробиркидля образцов Sigma AldrichT2318-500EAGreiner центрифужные пробирки, 50 мл
СпектрофотометрHitachiNAModel U2001, любой фотометр для абсорбционной спектроскопии с измерением на 664 нм и 750 нм будет подходящим
трихлоруксусной кислотой (TCA)MerckT6399100%
ультразвуковой зонднанолабораторияQS1T-2

Ссылки

  1. Boyd, E. S., Skidmore, M., Mitchell, A. C., Bakermans, C., Peters, J. W. Methanogenesis in subglacial sediments. Environmental Microbiology Reports. 2, 685-692 (2010).
  2. Sattler, B., Puxbaum, H., Psenner, R. Bacterial growth in supercooled cloud droplets. Geophysical Research Letters. 28, 239-242 (2001).
  3. Good, P., et al. A review of recent developments in climate change science. Part I: Understanding of future change in the large-scale climate system. Progress in Physical Geography. 35, 281-296 (2011).
  4. Fountain, A. G., et al. The Disappearing Cryosphere: Impacts and Ecosystem Responses to Rapid Cryosphere Loss. BioScience. 62, 405-415 (2012).
  5. Rignot, E., Mouginot, J., Morlighem, M., Seroussi, H., Scheuchl, B. Widespread, rapid grounding line retreat of Pine Island, Thwaites, Smith, and Kohler glaciers, West Antarctica, from 1992 to 2011. Geophysical Research Letters. 41, 3502-3509 (2014).
  6. McMillan, M., et al. Increased ice losses from Antarctica detected by CryoSat-2. Geophysical Research Letters. 41, 3899-3905 (2014).
  7. Barletta, V. R., et al. Glacier shrinkage and modeled uplift of the Alps. Geophysical Research Letters. 33, 14307(2006).
  8. Nuth, C., et al. Decadal changes from a multi-temporal glacier inventory of Svalbard. The Cryosphere. 7, 1603-1621 (2013).
  9. Takeuchi, N., Kohshima, S., Seko, K. Structure, formation, and darkening process of albedo-reducing material (cryoconite) on a Himalayan glacier: A granular algal mat growing on the glacier. Arctic Antarctic and Alpine Research. 33, 115-122 (2001).
  10. Takeuchi, N. Optical characteristics of cryoconite (surface dust) on glaciers: the relationship between light absorbency and the property of organic matter contained in the cryoconite. Annals of Glaciology. 34, 409-414 (2002).
  11. Anesio, A. M., Hodson, A. J., Fritz, A., Psenner, R., Sattler, B. High microbial activity on glaciers: importance to the global carbon cycle. Global Change Biology. 15, 955-960 (2009).
  12. Anesio, A. M., et al. Carbon fluxes through bacterial communities on glacier surfaces. Annals of Glaciology. 51, 32-40 (2010).
  13. Storrie-Lombardi, M. C., Sattler, B. Laser-Induced Fluorescence Emission (L.I.F.E): In Situ Nondestructive Detection of Microbial Life in the Ice Covers of Antarctic Lakes. Astrobiology. 9, 659-672 (2009).
  14. Murray, A. E., et al. Microbial life at -13 °C in the brine of an ice-sealed Antarctic lake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20626-20631 (2012).
  15. Edwards, A., et al. A distinctive fungal community inhabiting cryoconite holes on glaciers in Svalbard. Fungal Ecology. 6, 168-176 (2013).
  16. Miteva, V. Bacteria in Snow and Glacier Ice. Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology. Margesin, R., Schinner, F., Marx, J. C., Gerday, C. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin/Heidelberg, Germany. 31-50 (2008).
  17. Yallop, M. L., et al. Photophysiology and albedo-changing potential of the ice algal community on the surface of the Greenland ice sheet. The ISME Journal. 6, 2302-2313 (2012).
  18. Edwards, A., et al. A metagenomic snapshot of taxonomic and functional diversity in an alpine glacier cryoconite ecosystem. Environmental Research Letters. 8, 035003(2013).
  19. Remias, D., et al. Characterization of an UV-and VIS-absorbing, purpurogallin-derived secondary pigment new to algae and highly abundant in Mesotaenium berggrenii (Zygnematophyceae, Chlorophyta), an extremophyte living on glaciers. FEMS Microbiology Ecology. 79, 638-648 (2012).
  20. Cook, J., et al. An improved estimate of microbially mediated carbon fluxes from the Greenland ice sheet. Journal of Glaciology. 58, 1098-1108 (2012).
  21. Mueller, D. R., Vincent, W. F., Pollard, W. H., Fritsen, C. H. Glacial cryoconite ecosystems: a bipolar comparison of algal communities and habitats. Nova Hedwigia Beiheft. 123, 173-198 (2001).
  22. Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. C., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., Huner, N. P. A. Adaptation and Acclimation of Photosynthetic Microorganisms to Permanently Cold Environments. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70, 222-252 (2006).
  23. Hodson, A., et al. The cryoconite ecosystem on the Greenland ice sheet. Annals of Glaciology. 51, 123-129 (2010).
  24. Tilg, M., et al. L.I.F.E.: laser induced fluorescence emission, a non-invasive tool to detect photosynthetic pigments in glacial ecosystems. Proceedings SPIE. 8152, Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology XIV, 81520I. , (2011).
  25. Lorenzen, C. J. Determination of chlorophyll and pheo-pigments: spectrophotometric equations. Limnology & Oceanography. 12, 343-346 (1967).
  26. Kirchman, D. Measuring bacterial biomass production and growth rates from leucine incorporation in natural aquatic environments. Methods in Microbiology. , 227-238 (2001).
  27. Bell, R. T. Estimating production of heterotrophic bacterioplankton via incorporation of tritiated thymidine. Handbook of methods in aquatic microbial ecology. Edited by. Kemp, P. F., Cole, J. J., Sherr, B. F., Sherr, E. B. , CRC press. Boca Raton, FL. 495-503 (1993).
  28. Groemer, G., et al. Field trial of a dual-wavelength fluorescent emission (L.I.F.E.) instrument and the Magma White rover during the MARS2013 Mars analog mission. Astrobiology. 14, 391-405 (2014).
  29. Beutler, M. Spectral fluorescence of chlorophyll and phycobilins as an in situ tool of phytoplankton analysis-models, algorithms and instruments. , Christian-Albrechts Universität Kiel. Doctoral dissertation (2003).
  30. Krogmann, K. D. Discoveries in Oxygenic Photosynthesis (1727-2003): A Perspective. Photosynthesis Research. 80, 15-57 (2004).
  31. Corrêa, D. S., et al. Reverse saturable absorption in chlorophyll A solutions. Journal of Applied Physics B. 74, 559-561 (2002).
  32. Kaňa, R., et al. The slow S to M fluorescence rise in cyanobacteria is due to a state 2 to state 1 transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1817, 1237-1247 (2012).

Перепечатки и разрешения

Теги

Метод LIFEопределение биомаркеровколичественное определение хлорофилла Аанализ фикоэритринанеинвазивный методспектральный анализпространственное разрешение
Лазерно-индуцированное излучение флуоресценции (L.I.F.E.) как роман неинвазивный инструмент для измерения биомаркеров в Cryospheric Habitats
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.