Здесь мы представляем протокол, описывающий, как i) собрать самовоспроизводящий вектор с помощью модульного инструментария клонирования CyanoGate, ii) ввести вектор в цианобактериальный хост путем спряжения, и iii) характеризуют трансгенные штаммы цианобактерий с помощью плита читателя или потока цитометрии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генетическая модификация цианобактерий путем конъюгации с помощью цианогейтмодульного клонирования Toolkit
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Цианобактерии представляют собой разнообразную группу прокариотических фотосинтетических организмов, которые могут быть генетически модифицированы для возобновляемого производства полезных промышленных товаров. Последние достижения в области синтетической биологии привели к разработке нескольких наборов инструментов клонирования, таких как CyanoGate, стандартизированная модульная система клонирования для построения векторов плазмида для последующей трансформации или супружеской передачи в цианобактерии. Здесь мы намечаем детальный метод для сборки самовоспроизводящегося вектора (например, проведение флуоресцентной маркерной экспрессии) и супружеской передачи вектора в цианобактериальные штаммы Synechocystis sp. PCC 6803 или Synechococcus эллонгат UTEX 2973. Кроме того, мы описываем, как охарактеризовать производительность генетической части (например, промоутер) с помощью считывателя пластин или цитометрии потока.
Введение
Цианобактерии являются аутотрофными бактериями, которые могут быть использованы для биосинтеза широкого спектра природных и гетерологических продуктов высокой стоимости метаболических1,2,3,4,5 6. Несколько препятствий еще предстоит преодолеть, чтобы расширить свою коммерческую жизнеспособность, прежде всего, относительно низкие урожаи по сравнению с гетеротрофной био-платформ (например, Escherichia coli и дрожжей)7. Недавнее расширение дос....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Векторная сборка с использованием инструментариев Plant MoClo и CyanoGate
ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем приступить к векторной сборке, настоятельно рекомендуется, чтобы пользователи ознакомились с структурами уровня переносчиков систем завода и CyanoGate MoCloсистем 12,15.
- Строительство частей уровня 0
ПРИМЕЧАНИЕ: Части уровня 0 могут быть синтезированы в виде полных векторов или в виде линейных последовательностей для сборки с приемщиками уровня 0 (например, gBlocks, IDT). Кроме того, последовательности могут быть усилены из исходного шаблона (например, вектор или очищенна....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для демонстрации рабочего процесса сборки Золотых Ворот в векторе приемки 1-го уровня (Forward) (pICH47732) была собрана экспресс-кассета, содержащая следующие части уровня 0: промоутер C-фикоцианина оперона Pcpc560 (pC0.005), последовательность кодирования для eYFP (pC0.008) и двойной терминатор TrrnB (pC0.082)12. После преобразования реакции сборки, успешные сборки были определены с помощью стандартного сине-белого скрининг.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Сборка Золотых ворот имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами векторной сборки, особенно с точки зрения масштабируемости20,21. Тем не менее, настройка системы «Золотые ворота» в лаборатории требует времени для того, чтобы ознакомиться с различными частями и векторными библиотеками и общими процессами сборки. Тщательное планирование часто необходимо для более сложных сборок или при параллельном выполнении большого количества сложных сборок (например, .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы признательны Сети БИОтехнологии и биологических наук PHYCONET (BBSRC) в области промышленной биотехнологии и биоэнергетики (NIBB) и Центру инноваций в области промышленной биотехнологии (IBioIC) за финансовую поддержку. GARG, AASO и AP признают финансовую поддержку программы BBSRC EASTBIO CASE PhD (грант bb/M010996/1), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) PhD программы, а также программы совместного обучения IBioIC-BBSRC (CTP) Соответственно. Мы благодарим Конрада Маллино (Лондонский университет Королевы Марии) и Поула Эрика Дженсена и Джули Аннемари Зита Зедлер (Копенгагенский университет) за плазмидный вектор и протокольные вклады и советы.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 5-бром-4-хлор-3-индолил-&бета;-D-галактопиранозид (X-Gal) | Thermo Fisher Scientific | R0404 | использованный в 2.1.3. |
| Аденозин 5&прайм;-трифосфат (АТФ) динатриевая соль | Sigma-Aldrich | A2383 | используется в таблице 2. |
| Агар (микробиологическое тестирование) | Sigma-Aldrich | A1296-500g | Используется в 8.3. |
| Agarose | Bioline | BIO-41026 | используется в 6. |
| Проточный цитометр Attune NxT | Thermo Fisher Scientific | используется в версии 4.3.1. | |
| Сывороточный альбумин крупного рогатого скота (БСА) | Sigma-Aldrich | A2153 | использованный в таблице 2. |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | используется в таблице 2. |
| BSAI (Eco31I) | Thermo Fisher Scientific | ER0291 | используется в таблице 2. |
| Карбенициллин динатрий | VWR International | A1491.0005 | Используется в 2.1.3. |
| Corning Costar TC-обработанные плоскодонные 24-луночные пластины | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Используется в 4.1.3. |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | используется в 3.6.2. |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | Набор для экстракции ДНК. Используется в 5. |
| Считыватель микропланшетов FLUOstar Omega | BMG Labtech | - | используется в 4.2.2. |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Набор для очистки плазмид. Используется в шаге 2.3.2. |
| Стеклянные бусины (диаметр 0,5 мм) | Продукты BioSpec | 11079105 | Используется в 5.2. |
| Глицерин | Thermo Fisher Scientific | 10021083 | используется в 2.3.1, 3.6.2. |
| Изопропил-бета-D-тиогалактопиранизид (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | 10356553 | использован в 2.1.3. |
| Канамицина сульфат (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11815-024 | Используется в 2.1.3. |
| Мембранные фильтры (0,45 мкм; m) | MF-Millipore | HAWP02500 | используется в микропланшетах 3.3.7 |
| , 96-луночных, плоскодонных (дымоход) и микро; CLEAR | Greiner Bio-One | 655096 | использоваться в версии 4.2.1. |
| Набор для экстракции геля ДНК Monarch | New England Biolabs | T1020S | использовался в 1.1.2.2. |
| Набор для очистки ДНК Monarch PCR Набор для очистки ДНК | New England Biolabs | T1030 | . Используется в пункте 1.1.2.3. |
| Инкубатор Multitron Pro со светодиодами | Infors | HT-Shaking | инкубатор с белой светодиодной подсветкой. Используется в версии 4.1.4. |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21108 | используется в 7.1. |
| NanoDrop One | Thermo Fisher | Scientific ND-ONE-W | используется в версии 2.3.3. |
| One Shot TOP10 химически компетентный E. coli | Thermo Fisher Scientific | C404010 | использован в версии 2.1.1. |
| Фосфатный буферный солевой раствор (PBS) (концентрат 10X) | VWR International | K813 | Используется в 4.3.2. |
| Q5Высокоточная ДНК-полимераза | New England Biolabs | M0491S | , используемая в 1.1.2.1. |
| Быстрозарядная ДНК-лестница 1 кб | New England Biolabs | N0468S | использована на рисунке 4. |
| Пробирки с винтовой крышкой (1,5 мл) | Starstedt | 72.692.210 | Используется в 3.6.3 |
| Пентагидрат дигидрохлорида спектиномицина | VWR | International J61820.06 | Используется в 2.1.3. |
| Стерилиновый прозрачный микротитр круглодонный 96-луночные планшеты | Thermo Fisher Scientific | 612U96 | Используется в 4.3.1. |
| Т4 ДНК-лигаза | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | используется в таблице 2. |
| ТканьLyser II | Qiagen | 85300 | . Используется в версии 5.2. |
Ссылки
- Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
- Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering m....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
