Повторяя сосание к отнятию Переход в пробирке с использованием плода кишечных органоидов

У многих видов млекопитающих, втом есть мыши и мужчины, неонатальный кишечник имеет несколько особенностей, которые отличаются от полностью зрелого эпителия кишечника. Эти функции облегчают неонатальный энтероцитов для переваривания и поглощения молока, которое содержит высокие жиры и низкие углеводы, с лактозой в качестве основного углевода. Кисть границы неонатальных кишечных эпителиальных клеток выразить disaccharidase лактазы-флоризина гидролазы (Lct)¹ переварить молоко дисахарида лактозы. После периода сосания, энтероциты адаптироваться к переваривания твердой пищи, которая богата сложными углеводами и низким содержанием жира. Это проявляется переключатель в кисти границы disaccharidase выражение от лактазасы к sucrase-изомальтазы (Sis) и trehalase (Treh), который может переварить более сложные углеводы, присутствующие в твердой пищи². Другой метаболический переключатель связан с низкой концентрацией аргинина в молоке. Чтобы обеспечить потребность в аргинине, неонатальные энтероциты выражают скорость ограничения фермента в биосинтезе аргинина, аргиносуцинат синтаза-1 (Ass1), синтезировать аргинин³. В отличие от взрослых энтероцитов экспресс аргиназы 2 (Arg2), фермент, способный катаболизации аргинин, который в изобилии в твердой пищи. Кроме того, неонатальный кишечный эпителий выражает неонатальный рецептор FC для иммуноглобулинов (FcRn), который опосредует поглощение материнской IgG из молока в циркуляцию/ кровоток⁴. Выражение FcRn значительно снижается во время сосание к отлучению перехода⁵. У мышей созревание клеток Панета происходит послеродово, совпав с образованием и созреванием склепов, и характеризуется экспрессией антимикробных пептидов лизосомы (Лиз) и дефенсинов⁶.

Все эти изменения являются частью сосание к отлучению перехода, процесс, происходящий постепенно после рождения до одного месяца возраста у мышей, когда кишечный эпителий достигает своего зрелого взрослого состояния. Сосание к отлучению перехода внутренне регулируется и развития установить в кишечнике трубки. Транскрипционный фактор B лимфоцитов индуцированной созревания белка-1 (Blimp-1) играет ключевую роль в этом процессе внутренней созревания⁷. Blimp-1 высоко выражен в неонатальном эпителии, в то время как его экспрессия уменьшается и теряется во время сосание к отлучению перехода и, следовательно, может служить надежным маркером неонатального кишечного эпителия. Несмотря на то, что внутренний процесс, сосание к отлучению перехода может быть модулировано внешними факторами. Например, синтетический аналог кортизола, дексаметазон, как известно, ускорить созревание кишечника в vivo^8,9.

Текущие модели in vitro, используемые для изучения кишечного эпителиального созревания, включая переход от отлучение от отлучение, используют взрослые эпителиальные клеточные линии и/или взрослые органоиды, которые несут характеристики эпителия кишечника у взрослых. Недавно мы показали, что первичные кишечные эпителиальные клетки, изолированные от позднего кишечника плода созрели и резюмировать сосание к отлучению перехода при выращивании в пробирке, как органоиды¹⁰. Мы также показали, что этот процесс созревания кишечника в пробирке происходит в том же темпе, что и in vivo. Наконец, мы использовали дексаметазон для ускорения процесса созревания таким же образом, описанным для исследований in vivo.

Здесь мы наметили точный протокол для изоляции и культуры мыши поздних кишечных органоидов плода. Мы описываем предпочтительный способ сбора образцов для длительной органоидной культуры и методы для мониторинга сосание к отлучению перехода в пробирке. Этот протокол может быть использован для исследования in vitro кишечного эпителиального созревания и модуляторов этого процесса и приводит к более высокой пропускной способностью, повышению качества и трансляционной ценности данных и сокращению использования животных.

Данное исследование было проведено в соответствии с институциональными руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных, установленными Комитетом по этике по экспериментированию животных Амстердамского университета в полном соответствии с национальным законодательством о исследованиях на животных в соответствии с Европейской директивой 2010/63/EU для использования животных в научных целях (ALC312).

1. Изоляция малая кишечная органоида для плода

1. Пожертвуйте плодами E18-E20 путем обезглавливания хирургическими ножницами, в соответствии с утвержденными этическими нормами.
2. Сразу после эвтаназии аккуратно разрежьте нижнюю часть живота плода ножницами кишечника и удалите весь кишечник.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изоляция должна быть выполнена с кишечником между E18 и E20 беременности для того, чтобы достичь надлежащего сосание к отлучению перехода и созревания в пробирке.
3. С двумя небольшими щипками, растянуть кишечник. Используя желудок и аппендикс в качестве направляющих, разрежьте проксимальную и дистальную часть тонкой кишки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если вскрытие сделано тщательно, можно изолировать толстой кишки, а также. Разрежьте его на части с помощью приложения в качестве руководства(Рисунок 1).
4. Сделать кишечник открытым продольно: исправить кишечник с помощью лезвия бритвы размещены вдоль и потяните кишечник раздвижными щипками (одна рука щипцов на каждой стороне лезвия бритвы) вдоль лезвия бритвы. Затем разрежьте открытый кишечник на 1 см кусочков.
5. Подготовьте две трубки мощностью 50 мл с 10 мл ледяного фосфатно-буферного солья (PBS). Передача проксимальной и дистальной части тонкой кишки (и толстой кишки, если это применимо) отдельно к трубам. Держите трубки на льду, рассекая кишечник дополнительных мышей. Соберите все кишечные части одного помета вместе в одной трубке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один помет, как правило, 6-10 плодов. Кишечник всех плодов должен быть объединен. Этого количества должно хватить, чтобы дать 4-8 скважин с органоидами, в 48-хорошо пластины, на кишечную часть.
6. Продолжить с органоидной изоляции, как ранее описано¹¹. Короче говоря, мыть кишечные части с ледяной PBS, инкубировать с 2 мМ этилендеаминтетраацетической кислоты (ЭДТА) в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия, отделять склепы из ткани путем жесткого мытья кусочков с ледяной PBS 10% фетальной сыворотки икры (FCS), фильтр с помощью 70 мкм ячейки ситечко и центрифуги, чтобы собрать склепы на 150 х на 5 мин.
7. Плита от 4 до 8 скважин с склепом в внеклеточном матричном геле, в зависимости от размера гранул, в теплой 48-хорошей пластине. Используйте 20 зЛ склепов, взвешенных в внеклеточном матричного геля на скважину. Пусть внеклеточный матричного геля затвердейте в инкубаторе 37 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что только от 40% до 50% изолированных склепов образуют органоиды, стремиться к плотности от 250 до 300 органоидов на скважину. Сначала добавьте меньше внеклеточного матричного геля, чем нужно. Посмотрите под микроскопом после platting первый колодец, чтобы проанализировать ли плотность изолированных склепов является идеальным. При необходимости добавьте больше внеклеточного матричного геля.
8. В то же время подготовить ENR среды: 14 мл Расширенный Dulbecco в модифицированных Eagle Medium /Ham's F-12 (DMEM/F12) 1:1 - (дополнено 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперетанефолфоновая кислота (HEPES) 1x, L-глютамин 0,01 М и 0,2 U/mL пенициллин/стрептомицин), 4 мл носителей кондиционирования Noggin, 2 мл rspondin-кондиционированных носителей, 400 л B27 дополнения 1x, 200 кЛ N2 добавка 1x, 50 л 1,25 мМ n-ацетилцистеин, 20 мл 0,05 мкг/мл Эпидермальный фактор роста (EGF).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При культивировании органов толстой кишки, дополнение с 50% Wnt условных средств массовой информации.
9. Добавьте 250 л среды ENR на скважину.

2. Культивирование органоидов плода

1. Изменение среды культур 3 раза в неделю. Созревание органоидов достигается после 1 месяца культуры.
2. На 3-й день после каждого прохода подсчитайте количество сфероидов и органоидов с помощью оптического микроскопа. Количественная оценка по крайней мере 3 скважины на состояние и все органоиды, присутствующие в каждой скважине.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество сфероидов уменьшается со временем, в то время как количество органоидов увеличивается(рисунок 2).
3. Проход органоидов один раз в неделю механической диссоциации, как описано ниже.
   1. Удалите средний и добавьте 1 мл ледяного Advanced DMEM/F12 1:1. Соберите все внеклеточные матричные геля с органоидами в трубку 15 мл. Используйте кончик 200 л на вершине наконечника фильтра 1000 л и пипетка вверх и вниз 20 раз, чтобы нарушить органоиды.
   2. Центрифуга при 150 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Откажитесь от супернатанта и отрепримите гранулы в 20 зл и внеклеточного матричного геля на скважину. Как правило, органоиды плода могут быть расширены в соотношении 1:2.
   3. Пусть внеклеточный матричного геля затвердеть в течение 5-10 мин. Добавить 250 л ENR среды в скважине.

3. Анализ созревания на уровне РНК и белка

1. Анализировать культуру каждые 3 дня после каждого прохода, в течение 1 месяца (т.е. время, в котором достигается полное созревание)(рисунок 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фетальная органоидная культура динамична (Movie 1) и чтобы избежать отклонения от нормальной регенерации органоидов после механических нарушений, необходимо всегда собирать образцы в тот же день после прохождения.
2. Изоляция РНК
   1. Соберите 3 скважины органоидов, используя 200 qL буфера лизиса РНК для каждого хорошо дополненного 2 злюа й-меркаптоэтанола. После добавления в колодец буфера RNA-меркаптоэтанола убедитесь, что все внеклеточные матричные гели с органоидами передаются в трубку, свободную от РНК.
   2. Вихрь энергично и держать на -80 градусов по Цельсию в течение не более 1 месяца. Изолировать РНК с использованием коммерчески доступных комплектов колонки для вращения кремнезема.
   3. Для повышения качества РНК, после стирки шаги добавить 500 зл 80% EtOH и аккуратно перемешать путем инвертирования колонки. Центрифуга в течение 2 мин при 11000 х г, чтобы высушить колонку полностью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы мыть внутреннюю часть крышки трубки с 80% EtOH, щелкнув трубку с ног на голову три-пять раз, чтобы избавиться от всех следов гуанидин тиоцианат.
   4. Чтобы увеличить выход РНК, подождите 1-2 мин после применения РНЗа свободной воды до центрифуги. Повторное расширение РНК, применяя первый поток через eluate к столбце во второй раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированное качество РНК достаточно для использования в анализе экспрессии в масштабах всего генома. Проверьте, является ли число целостности РНК выше 8.
3. Белковая изоляция
   1. Соберите 5 скважин органоидов, используя 250 л раствора восстановления клеток ледяной в одну трубку 15 мл. Инкубировать не менее 30 мин на льду, чтобы растворить внеклеточный матричного геля (это уменьшит вклад белка из внеклеточного матричного геля).
   2. Вымойте ледяным пБС. Добавьте 250 кл. буфера лиза клетки и храните при -80 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После sonication, образцы могут быть использованы для обнаружения активности фермента или для западных помарки.
4. Иммуностоинг
   1. Соберите 2 скважины органоидов, используя 250 л раствора восстановления клеток ледяной в трубку 15 мл. Инкубировать не менее 30 мин на льду, чтобы растворить внеклеточный матричного геля (это уменьшит окрашивание фона). Вымойте ледяным пБС.
   2. Исправьте органоиды, используя 500 л из 4% параформадегида (PFA) на 1 ч при 4 градусах Цельсия. Вымойте ледяным пБС. Приступить к цельно-органоидной иммунофлуоресценции или парафина встраивания, в соответствии с опубликованными протоколами¹².
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пластиковый пипетка Pasteur для обработки органоидов. Это позволит избежать нарушения его структуры.

4. Влияние экстринсического фактора (дексаметазон в качестве примера) на процесс созревания органоидов

1. В первый день культуры, добавить 0.01M дексаметазон в органоиды. Инкубировать органоиды с дексаметазоном в течение всего месяца культуры, добавляя новый дексаметазон каждый раз, когда среда меняется.
2. Анализ экспрессии генов
   1. Изолировать РНК, как описано выше. Синтезировать, в то же время, cDNA всех образцов, которые должны быть сопоставлены (обработанные и необработанные). Продолжить с предпочтительным методом qRTPCR.
   2. Используйте GeNorm для определения двух наиболее стабильных эталонных генов каждый раз, когда новое лечение используется на органоидов плода. Используйте геометрическое среднее двух выбранных эталонных генов для расчетов относительной экспрессии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предложения эталонных генов для тестирования на органоиды плода мыши: Циклофилин, Gapdh, Зактин, 36b4, Hprt, Rpl4, Rpl32, Ppib и Tbp.
   3. Чтобы исследовать, как определенный экстримальный фактор влияет на послеродовой созревание плода мыши, все следующие гены должны быть оценены.
      1. Проверьте, являются ли фетальные маркеры лактазой(Lct),аргининосуцинат синтаза 1 (Ass1), B лимфоцитов индуцированной созревания белка 1 (Blimp-1) и неонатального рецептора FC (FcRn) снижение экспрессии в течение первых двух недель культуры и отсутствуют в течение оставшегося времени культуры (Рисунок 4C). Проанализируйте, изменяется ли этот шаблон.
      2. Проверьте, являются ли взрослые маркеры sucrase-isomaltase(Sis), аргиназы 2 (Arg2), trehalase (Treh) и lysozyme (Lyz) увеличение экспрессии после двух недель культуры (Рисунок 4D). Проанализируйте, изменяется ли эта модель внешним фактором.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Дексаметазон является внешним фактором, который может ускорить созревание органоидов плода и может быть использован в качестве положительного контроля во всех экспериментах, направленных на тестирование других внешних факторов.
3. Анализ активности ферментов
   1. Изолировать белок, как описано выше. Обнаружение кишечной дезорганизации дезачаридазы в соответствии с протоколами, опубликованными Дальквист и Мессер^13,14.
   2. Подготовка 0,625 M мужско-буфер рН 6,0 (держать в течение 3 месяцев при 4 градусах Цельсия). Используя этот буфер, приготовьте 0,05 М лактозу (добавить р-гидроксимеркурибензона натрия в качестве стабилизатора для ингибирования лизосомальной деятельности р-галактосидазы); 0,05 млн мальтоза; 0,05 М сахароза и 0,05 М треалоза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все эти решения могут храниться в течение 5 дней при 4 градусах Цельсия. Держите на льду во время подготовки асссе.
   3. Подготовьте стандарты ассирования, разбавив раствор глюкозы 5,56 М ультрачистой водой для получения растворов со следующими концентрациями: 0,125 М; 0,1 м; 0,075 М; 0,05 м и 0,025 м.
      ПРИМЕЧАНИЕ: раствор стабилен в течение не менее 3 месяцев при 4 градусах Цельсия.
   4. Инкубировать в 96-хорошую тарелку в течение 60 мин при 37 градусах Цельсия:
      - 30 л органоидного лисата с 30 л лактозы
      - 30 л органоидного лисата с 30 л сахарозы
      - 30 л из десяти раз разбавленного органоидного лисата с 30 зл мальтозы
      - 30 л из пяти раз разбавленного органоидного лисата с 30 л тремаласа
      - 30 л неразбавленного органоидного лисата с 30 зл мужской кислоты, в качестве образца фона
      - 30 л каждого стандарта глюкозы
      - 30 л ультрачистой воды, как пустая
      - 30 зЛ положительного контроля (оптимизация разбавления; лизинируют ткани кишечника плода могут быть использованы в качестве контроля для лактазной активности в то время как лисизированная кишечная ткань взрослого человека может быть использована в качестве контроля для sucrase, maltase и trehalase)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление образцов должно быть сделано с буфером лиза клетки. Держите образцы и пластины на льду во время подготовки асссе.
   5. Чтобы определить количество глюкозы, вырабатываемой ферментами, присутствующими в органоидном лисате после инкубации с их соответствующими субстратами, быстро добавьте 200 зл. PGO-цветового раствора и измерьте абсорбцию на 450 нм каждые 5 мин в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте решение цвета pGO свежим. Используйте 10 U/mL глюкозно-оксидазы, 2 U/mL peroxidase и 7.88 ммоль /L o-dianisidine в 0.5mol/L Tris-HCl буфер на pH 7.0. Раствор должен быть при комнатной температуре при добавлении в тарелку.
   6. Рассчитать активность в соответствии со стандартом глюкозы и правильно для общего количества белка (определяется анализом бисингониновой кислоты (BCA)). Активность ферментов должна быть выражена как «глюкоза/мкг-белок-мин^-1 (Рисунок 5В).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте активность аргиназы с использованием коммерчески доступного набора аргиназа деятельности ассеи.

Длительная культура эпителиальных клеток кишечника плода
Протокол для имитации сосание к отлучению перехода в пробирке зависит от правильного обращения с фетальными органоидами во время длительной культуры. Проксимальный и дистальный кишечник, изолированные от плодов мыши E18-E20, разделены, как представлено в(Рисунок 1). После изоляции эпителиальные клетки посеяны в внеклеточных куполах матричного геля(рисунок 2). Это обычно занимает четыре прохода и примерно 28-30 дней культуры для фетальных органоидов созреть до взрослого состояния. За это время можно собирать клетки на различных стадиях созревания(рисунок 3).

Представитель вниз по течению анализ сосание к отлучению перехода в пробирке
Чтобы подтвердить, что изолированные органоиды плода отчетливо проксимальны или дистальные, сравните уровень экспрессии проксимальных маркеров One cut domain family member 2 (Onecut2) и GATA связывающий белок 4 (Gata4) и дистальные маркеры жирных кислот связывающих белков 6 (Fabp6) и Guanylate Циклазы Органатор 2A (Guca2a) между обеими proxioid. Сосание к отлучению перехода in vitro можно контролировать двумя наборами генов: плода(рисунок 4C)и взрослых маркеров(рисунок 4D). Фетальные маркеры должны постепенно уменьшаться в течение культуры, в то время как выражение маркеров для взрослых должно постепенно увеличиваться(рисунок 4C,D).

Использование экстримового фактора в качестве модификатора сосание к отлучению перехода in vitro
В этом протоколе дексаметазон синтетический глюкокортикоид, был использован в качестве примера экстримового фактора, способного изменять сосание к отлучению перехода в пробирке. Репрезентативные данные на рисунке 5 свидетельствуют о том, что воздействие находинных факторов лучше всего определять несколькими анализами, поскольку они не обязательно должны быть геномными. Например, в случае сукрас-изомальтезе и РНК, и выражение белка индуцируются с дексаметазоном(рисунок 5А),в то время как экспрессия тремалаза изменяется только на уровне белка. (Рисунок 5B).

Рисунок 1: Изоляция мыши плода тонкой кишки. (A) Фотография расчлененной и растянутой кишки плода, в ключая желудок, проксимальный и дистальный тонкий кишечник, аппендикс и толстая кишка. Черная линия указывает, где кишечник должен быть сокращен, чтобы разделить проксимальной и дистальной тонкой кишки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Представитель микроскопические изображения проксимальной и дистальной культуры органоидов плода на 3-й день, день 17 и день 28 культуры. Все изображения были получены на 3-й день после прохождения и показывают уменьшение количества сфероидов сверхурочно. Шкала бар: 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Фильм 1: Представитель видео, показывающее динамику культуры органоидов плода, с 4-го по 6-й день культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)

Рисунок 3: Схематическое представление органоидной коллекции для анализа созревания кишечника с течением времени. Проксимальные и дистальные органоидные культуры плода должны культивируется в течение одного месяца и проходить каждую неделю. Образцы для анализа созревания должны быть собраны через 3 дня после изоляции и каждые 3 дня после каждого прохода.

Рисунок 4: Представитель qRTPCRs маркеров созревания кишечника в проксимальных и дистальных органоидов плода. (A) Проксимальные маркеры Onecut2 и Gata4 в основном выражаются в проксимальной органоидной культуре, в то время как (B)дистальные маркеры Fabp6 и Guca2a в основном выражены в дистальной органоидной культуре. (C) Фетальные маркеры Lct, Ass1, Blimp-1 и FcRn снижение и (D) взрослых маркеров Sis, Arg2, Treh и Lyz увеличение с течением времени в проксимальной и дистальной органоидных культур. Бары ошибок представляют SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Внешний фактор дексаметазон может модулировать созревание органоидов плода. ( A ) Выражение гена фетального маркера Blimp-1 уменьшается на 12 день культуры в дексаметазон лечение органоидов по сравнению с контрольными органоидами, в то время как экспрессиягенов(B) и ферментной активности (C) взрослых маркер sucrase-isomaltase (Sis) увеличивается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Авторы ничего не разглашают.