Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Получение активированной обогащенной тромбоцитами плазмы для культивирования стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60480

⸱

4 мая 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Kansai Medical University, 2Department of Plastic Surgery, Zhejiang Provincial People's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

В этом отчете мы описываем метод двойного спина для получения активированной обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP). С использованием аутологичного тромбина культивировали стволовые клетки, полученные из жировой ткани человека (hASCs). Было показано, что активированная ОТР способствует пролиферации ЧССК.

Аннотация

Активированная обогащенная тромбоцитами плазма (PRP), полученная из цельной крови методом центрифугирования, продемонстрировала пролиферационно-стимулирующий эффект в нескольких видах культивируемых клеток, что предполагает ее возможное использование в регенеративной медицине. Здесь для получения ОТР из цельной крови был использован метод двойного спиннинга. PRP дополнительно активировался аутологичным тромбином. Измеряли количество тромбоцитов в активированном PRP и изучали пролиферативно-стимулирующий эффект в стволовых клетках жировой ткани человека (hASCs). Полученное количество тромбоцитов в ОТР было в 11,5 раз выше, чем в плазме цельной крови. Пролиферация hASC заметно усиливалась при инкубации с 1% PRP. Описанный способ может быть использован для воспроизводимого получения PRP с высокой концентрацией тромбоцитов. ОТР, полученная таким методом, заметно способствует пролиферации ЧССК.

Введение

Активированная обогащенная тромбоцитами плазма (PRP) получают путем центрифугирования цельной крови и, как показано, содержат тромбоциты значительно выше исходного уровня1. Аутологичный РПП широко используется в хирургическом лечении, включая заживление ран2, повреждение костей 3 и эстетические операции 4,5. После активации тромбоцитов в PRP α-гранулы, присутствующие в тромбоцитах, высвобождают несколько факторов роста, таких как тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF), инсулиноподобные факторы роста (IGFs), трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и другие 1,6,7. Эти факторы роста играют важную рольв пролиферации клеток8, миграции9 и дифференцировке9.

На сегодняшний день в нескольких исследованиях сообщается о пролиферационно-стимулирующем эффекте PRP в различных типах клеток 10,11,12,13,14,15,16. Одним из таких типов клеток являются стволовые клетки, полученные из жировой ткани человека (hASCs); hASC существуют в жировой ткани человека и могут быть легко собраны в больших количествах. Регенеративный эффект hASC также предполагает потенциальное использование в клиническом применении8. В наших предыдущих исследованиях сообщалось, что по сравнению с неактивированным PRP, активированный PRP оказывает выраженное пролиферативное действие на hASC и дермальные фибробласты человека (hDFs)8. Кроме того, мы сообщили, что ОТР способствует пролиферации hDFs через сигнальный путь ERK1/217. Недавно мы также сообщали, что ОТР способствует распространению hASC через сигнальные пути ERK1/2, JNK и Akt18. При ЧССК ОТР играет важную роль в качестве добавки, способствующей пролиферации. Знания о влиянии ОТР на ЧПСК помогут в разработке методов крупномасштабного культивирования и позволят провести дальнейшие исследования механизма пролиферации в ЧКАСК.

В этом отчете мы представляем и описываем метод получения PRP из цельной крови с использованием центрифугирования. В этом методе используется метод двойного отжима, чтобы легко получить стабильный образец PRP. Для оценки биологической функции ОТР мы измерили концентрированное количество тромбоцитов и концентрацию нескольких факторов пролиферации. Мы также подтвердили стимулирующий рост эффект при использовании приготовленного PRP для культивирования hASCs.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследование было одобрено Советом по этике Медицинского университета Кансай в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации 1975 года. Все образцы были собраны и использованы с информированного согласия доноров.

1. Подготовка

  1. После получения информированного согласия возьмите кровь у здоровых взрослых доноров. Здесь была собрана кровь у четырех мужчин-доноров в возрасте от 28 до 38 лет.
    1. Рекомендовать донорам выпить 500 мл воды за 6 ч до забора крови.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Референсные диапазоны гемоглобина (Hb), количества эритроцитов (RBC) и концентрации тромбоцитов (PL) у здоровых взрослых описаны в Vajpayee19. Для того, чтобы донорская кровь была пригодна для сдачи крови, анализ крови донора должен находиться в этих диапазонах.

2. Забор крови

  1. Попросите доноров крови сесть во время процедуры.
  2. Надевайте перчатки. Наложите жгут на плечо донора, пока донор сжимает кулак.
  3. Как только подходящая вена будет найдена, дважды простерилизуйте кожу 70% спиртом и введите иглу.
  4. Используйте шприц 21 г для сбора крови. Не ослабляйте жгут во время забора крови.
    1. Для сбора крови используйте пробирку для сбора крови объемом 8,5 мл. Наблюдайте за состоянием крови в пробирке и меняйте на новую пробирку, как только кровоток замедлится.
    2. Соберите достаточное количество крови для производства PRP. Соберите четыре пробирки антикоагулянтной крови общим объемом 34 мл. Переверните трубки 10 раз, чтобы смешать кровь с антикоагулянтом.
    3. Используйте пробирку для сбора сыворотки крови объемом 10 мл объемом 10 мл (см. Таблицу материалов) без антикоагулянта для сбора крови для производства активатора (см. Шаг 4). Соберите 10 мл крови, не содержащей антикоагулянтов.

3. Метод двойного вращения для проведения PRP

  1. Примите 40 μл антикоагулянтной цельной крови для подсчета тромбоцитов. Используйте отфильтрованные наконечники для пипетки, чтобы защитить пипетку от загрязнения крови.
  2. Центрифугируйте антикоагулянтную цельную кровь в течение 7 минут при 450 х г и комнатной температуре. Это первый спин для получения послойных образцов крови. Верхний слой — это фракция плазмы, средний слой — тонкая охристая лодочка, а самый нижний слой состоит из эритроцитов.
  3. С помощью маркера проведите линию на 2 мм ниже охристого слоя.
  4. С помощью шприца объемом 20 мл с длинной канюлей соберите плазму до отметки 2 мм ниже охристого слоя. Желтая плазма с охристой шерстью содержит тромбоциты, лейкоциты и некоторое количество эритроцитов. Соберите плазму из двух пробирок в пробирку для сбора сыворотки крови. Соедините содержимое 4 пробирок в 2 пробирки для получения общего объема 16 мл собранной плазмы.
  5. Центрифугируйте плазму с охристым покрытием в течение 5 минут при температуре 1 600 x g и комнатной температуре. Это второй спин. Надосадочной жидкостью слоистых образцов крови является бедная тромбоцитами плазма (PPP).
  6. Используйте шприц объемом 20 мл с длинной канюлей для переноса PPP в пробирку для сбора сывороточной крови объемом 50 мл, содержащую 1 мл жидкости в качестве меры. В качестве ОТП использовали тромбоциты, накопившиеся в грануле тромбоцитов в оставшейся 1 мл плазмы. Общий объем собранной ОТР составил 2 мл.
  7. Внесите PRP в каждую пробирку, а затем объедините в одну пробирку (всего 2 мл).
  8. Возьмите 400 мкл PRP для подсчета тромбоцитов.
  9. Распределите PRP в несколько пробирок объемом 1,5 мл, содержащих примерно 400 мкл в каждой пробирке. Всего имеется четыре трубки. Рекомендуется примерно 500 мкл PRP на пробирку.

4. Подготовьте активатор

  1. Дайте 10 мл крови без антикоагулянта в пробирке для сбора сыворотки крови (шаг 2.3.3) постоять в течение 30 минут при комнатной температуре.
  2. Центрифугируйте образец крови без антикоагулянта в течение 8 мин при температуре 2,015 x g и комнатной температуре в лабораторной центрифуге.
  3. Соберите надосадочную жидкость в виде аутологичного тромбина.
  4. Смешайте 0,5 М CaCl2 и аутологичный тромбин в соотношении 1:1 (v/v) в качестве активатора. Например, 500 мкл CaCl2 смешивали с 500 мкл аутологичного тромбина. Сделайте общий объем 1 мл активатора.

5. Активация PRP

  1. Смешайте PRP и активатор в соотношении 10:1 (v/v). Смешайте 400 мкл PRP с 40 мкл активатора в каждой пробирке объемом 1,5 мл, а затем инкубируйте в течение 10 мин при комнатной температуре. Это активированный PRP в коагулированной форме.

6. Хранение PRP

  1. Центрифуга активировала PRP при 9 000 x g в течение 10 мин в лабораторной центрифуге при температуре 4 °C.
  2. Соберите надосадочную жидкость с помощью пипетки в шприц соответствующего объема.
  3. Отфильтруйте надосадочную жидкость через мембрану размером 0,22 мкм.
  4. Храните окончательный PRP при температуре −80 °C до использования.

7. Измерение концентрации тромбоцитов и уровня фактора роста

  1. Подсчитайте количество тромбоцитов в цельной плазме и PRP с помощью автоматизированной гематологической системы (см. Таблицу материалов).
  2. Анализируйте концентрации уровней PDGF-BB, IGF и EGF в цельной плазме и активированном PRP с использованием коммерчески доступных наборов для ИФА (см. Таблицу материалов).

8. Анализ пролиферации клеток

  1. Изолируют hASC с помощью ранее описанного способа18.
    1. Посев hASC при плотности 1,0 x 104 клеток /лунка в 24-луночных культуральных планшетах и инкубирование в DMEM, содержащем 10% FBS и антибиотики, в течение ночи при 37 °C. Используйте в экспериментах hASC из отрывков 7-9.
  2. Замените клеточные среды на бессывороточные DMEM. Через 6 ч добавьте PRP в назначенных концентрациях и продолжайте инкубировать в течение 48 ч при 37 °C.
  3. Инкубировать с раствором WST-8 (см. Таблицу материалов) в течение 1 ч при 37 °C. Поглощение считывания на длине волны 450 нм с помощью многолуночного планшетного ридера.
  4. Постройте стандартную кривую: засейте hASC при плотностях 0, 6,250, 12,500, 25,000, 50,000 и 100,000 клеток/лунку в 24-луночных планшетах в DMEM с 10% FBS в течение 3 ч. Считывание абсорбции при длине волны 450 нм после инкубации с раствором WST-8 в течение 1 ч при 37 °C
    1. Нарисуйте стандартную кривую, изобразив количество ячеек относительно A450 нм.
  5. Оцените количество hASC по абсорбции на основе стандартной кривой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Обогащенные концентрации тромбоцитов и PDGF-BB в ОТР
Концентрации тромбоцитов и PDGF-BB в PRP увеличивались в 11,5 и 25,9 раза, соответственно, так же высоко, как и в цельной плазме. Тем не менее, концентрации EGF в PRP не изменялись, и IGF составлял всего 70% от концентрации в цельной плазме (табл. 1). Эксперименты были повторены четыре раза методом двойного спина.

Усиленная пролиферация hASC за счет стимуляции PRP
Пролиферация клеток у...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

После активации PRP несколько факторов роста, таких как PDGF, EGF, IGF, TGF-β и VEGF 1,6,7, «активируют» клетки и ткани ран, способствуя заживлению ран 20,21. В случае косметической реконструктивной хирургии было показано, что активированные клетки вызывают заживление и улучшают эстетику22,23

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Не применяется.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприц 20 мл, замок для шприца Terumo типаTerumo, Токио, Япония.Трубка SS-20LZP
50 мл, полипропиленовая коническая трубкаCorning, Нью-Йорк, США.352070
Автоматизированная гематологическая системаSysmex Corp., Токио, ЯпонияXE-2100
, набор SafeTouch PSV с адаптером Люэра, 21 г x 3/4"Нипро, Осака, Япония.32-384
Пробирка для сбора крови, раствор ACD Пробирка для сбора крови, 8,5 млBD Vacutainer, Нью-Джерси, США.
Пробирка для сбора крови, пробирка для сбора сыворотки крови, 10 млBD Vacutainer, Нью-Джерси, США.366430
Кальция хлорид, 1 мг-экв/мл,фармацевтическая фабрика Оцука, Токусима, Япония.3215400A1061
Канюля, игла BS без скоса, 18 г (1,2 мм) x 75 ммBS Medical, Токио, Япония.BS-81007Не продается
набор для подсчета клеток-8Dojindo Molecular Technologies, Кумамото, ЯпонияCK04
ЦентрифугаKokusan, Токио, Япония.H-19F
CentrifugeEppendorf, Гамбург, Германия.5415R
Многоканальный считыватель EnSpire 2300PerkinElmer, Inc., Уолтем, Массачусетс, США
Фильтрующая установкаMerck Millipore, Co. Корк, Ирландия.
Human EGF Quantikine ELISA KitR& D Systems, Миннеаполис, Миннесота, СШАDEG00
Человеческий IGF-I Quantikine ELISA KitR& D Systems, Миннеаполис, Миннесота, СШАDG100
Human PDGF-BB Quantikine ELISA KitR& D Systems, Миннеаполис, Миннесота, СШАDBB00
, ART 1000 Барьерный наконечникReach Thermo Scientific, Массачусетс, США.2079-05-HR
Пипетка, Nichipet EXII 100-1000 μ Л.Нитирио, Сайтама, Япония.00-NPX2-1000
Перчатки для осмотра из нитрила Sterling Power-FreeKimberly-Clark50707
Спирт Yamazen для дезинфекцииYamazen Pharmaceutical, Осака, Япония.А7Л07
Игла для сбора крови 364606SLGP033RS Наконечник для пипетки

Ссылки

  1. Eppley, B. L., Woodell, J. E., Higgins, J. Platelet quantification and growth factor analysis from platelet-rich plasma: implications for wound healing. Plastic and Reconstructive Surgery. 114 (6), 1502-1508 (2004).
  2. Salcido, R. S. Autologous platelet-rich plasma in chronic wounds. Advances in Skin & Wound. 26 (6), 248(2013).
  3. Marx, R. E., et al. Platelet-rich plasma: Growth factor enhancement for bone grafts. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology. 85 (6), 638-646 (1998).
  4. Bhanot, S., Alex, J. C. Current applications of platelet gels in facial plastic surgery. Facial Plastic Surgery. 18 (1), 27-33 (2002).
  5. Man, D., Plosker, H., Winland-Brown, J. E. The use of autologous platelet-rich plasma (platelet gel) and autologous platelet-poor plasma (fibrin glue) in cosmetic surgery. Plastic and Reconstructive Surgery. 107 (1), 238(2001).
  6. Eppley, B. L., Pietrzak, W. S., Blanton, M. Platelet-rich plasma: a review of biology and applications in plastic surgery. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (6), 147-159 (2006).
  7. Lubkowska, A., Dolegowska, B., Banfi, G. Growth factor content in PRP and their applicability in medicine. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 26, 2 Suppl 1 3-22 (2012).
  8. Kakudo, N., et al. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plastic and Reconstructive Surgery. 122 (5), 1352-1360 (2008).
  9. Kakudo, N., Morimoto, N., Kushida, S., Ogawa, T., Kusumoto, K. Platelet-rich plasma releasate promotes angiogenesis in vitro and in vivo. Medical Molecular Morphology. 47 (2), 83-89 (2014).
  10. Liu, Y., Kalen, A., Risto, O., Wahlstrom, O. Fibroblast proliferation due to exposure to a platelet concentrate in vitro is pH dependent. Wound Repair and Regeneration. 10 (5), 336-340 (2002).
  11. Lucarelli, E., et al. Platelet-derived growth factors enhance proliferation of human stromal stem cells. Biomaterials. 24 (18), 3095-3100 (2003).
  12. Kilian, O., et al. Effects of platelet growth factors on human mesenchymal stem cells and human endothelial cells in vitro. European Journal of Medical Research. 9 (7), 337-344 (2004).
  13. Kanno, T., Takahashi, T., Tsujisawa, T., Ariyoshi, W., Nishihara, T. Platelet-rich plasma enhances human osteoblast-like cell proliferation and differentiation. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 63 (3), 362-369 (2005).
  14. Gruber, R., et al. Platelet-released supernatants increase migration and proliferation, and decrease osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells under in vitro conditions. Platelets. 15 (1), 29-35 (2004).
  15. Koellensperger, E., von Heimburg, D., Markowicz, M., Pallua, N. Human serum from platelet-poor plasma for the culture of primary human preadipocytes. Stem Cells. 24 (5), 1218-1225 (2006).
  16. Kocaoemer, A., Kern, S., Kluter, H., Bieback, K. Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue. Stem Cells. 25 (5), 1270-1278 (2007).
  17. Hara, T., et al. Platelet-rich plasma stimulates human dermal fibroblast proliferation via a Ras-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway. Journal of Artificial Organs. 19 (4), 372-377 (2016).
  18. Lai, F., et al. Platelet-rich plasma enhances the proliferation of human adipose stem cells through multiple signaling pathways. Stem Cell Research and Therapy. 9 (1), 107(2018).
  19. Vajpayee, N., Graham, S. S., Bem, S. Basic examination of blood and bone marrow. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 22, 509-535 (2011).
  20. Cervelli, V., et al. Use of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the loss of substance with bone exposure. Advances in Skin & Wound. 24 (4), 176-181 (2011).
  21. Nicoli, F., et al. Severe hidradenitis suppurativa treatment using platelet-rich plasma gel and Hyalomatrix. International Wound Journal. 12 (3), 338-343 (2015).
  22. Cervelli, V., et al. platelet rich lipotransfert: our experience and current state of art in the combined use of fat and PRP. BioMed Research International. 2013, 434191(2013).
  23. Gentile, P., et al. Platelet-Rich Plasma and Micrografts Enriched with Autologous Human Follicle Mesenchymal Stem Cells Improve Hair Re-Growth in Androgenetic Alopecia. Biomolecular Pathway Analysis and Clinical Evaluation. Biomedicines. 7 (2), (2019).
  24. Gentile, P., Scioli, M. G., Orlandi, A., Cervelli, V. Breast Reconstruction with Enhanced Stromal Vascular Fraction Fat Grafting: What Is the Best Method. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 3 (6), 406(2015).
  25. Gentile, P., Casella, D., Palma, E., Calabrese, C. Engineered Fat Graft Enhanced with Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells for Regenerative Medicine: Clinical, Histological and Instrumental Evaluation in Breast Reconstruction. Journal of Clinical Medicine. 8 (4), (2019).
  26. Gentile, P., Piccinno, M. S., Calabrese, C. Characteristics and Potentiality of Human Adipose-Derived Stem Cells (hASCs) Obtained from Enzymatic Digestion of Fat Graft. Cells. 8 (3), (2019).
  27. Scioli, M. G., Bielli, A., Gentile, P., Cervelli, V., Orlandi, A. Combined treatment with platelet-rich plasma and insulin favours chondrogenic and osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells in three-dimensional collagen scaffolds. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (8), 2398-2410 (2017).
  28. Marx, R. E., Garg, A. K. Dental and craniofacial applications of platelet-rich plasma. , Quintessence Publishing Company. (2005).
  29. Kakudo, N., Kushida, S., Kusumoto, K. Platelet-rich plasma: the importance of platelet separation and concentration. Plastic and Reconstructive Surgery. 123 (3), author reply 1136-1137 1135-1136 (2009).
  30. Kakudo, N., Kushida, S., Minakata, T., Suzuki, K., Kusumoto, K. Platelet-rich plasma promotes epithelialization and angiogenesis in a splitthickness skin graft donor site. Medical Molecular Morphology. 44 (4), 233-236 (2011).
  31. Kushida, S., et al. Platelet and growth factor concentrations in activated platelet-rich plasma: a comparison of seven commercial separation systems. Journal of Artificial Organs. 17 (2), 186-192 (2014).
  32. Morimoto, N., et al. Exploratory clinical trial of combination wound therapy with a gelatin sheet and platelet-rich plasma in patients with chronic skin ulcers: study protocol. British Medical Journal Open. 5 (5), 007733(2015).
  33. Kushida, S., Kakudo, N., Morimoto, N., Mori, Y., Kusumoto, K. Utilization of Platelet-Rich Plasma for a Fistula With Subcutaneous Cavity Following Septic Bursitis: A Case Report. Eplasty. 15, 31(2015).
  34. Eby, B. W. Platelet-rich plasma: harvesting with a single-spin centrifuge. Journal of Oral Implantology. 28 (6), 297-301 (2002).
  35. Castillo, T. N., Pouliot, M. A., Kim, H. J., Dragoo, J. L. Comparison of growth factor and platelet concentration from commercial platelet-rich plasma separation systems. The American Journal of Sports Medicine. 39 (2), 266-271 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.