Идентификация хост Пути целевых бактериальных протеинов с использованием дрожжей токсичности и супрессорэкранов

Summary

Бактериальные патогены выделяют белки в хост, которые нацелены на важнейшие биологические процессы. Выявление путей пребывания, мишенью для белков бактериальных эффекторов является ключом к решению молекулярного патогенеза. Здесь описан метод с использованием модифицированного супрессора дрожжей и экрана токсичности для выяснения путей пребывания, мишенью которыми становятся токсичные бактериальные протеины.

Abstract

Внутриклеточные бактерии выделяют вирулентные факторы, называемые эффекторными белками в цитозол хозяина, которые действуют, чтобы подорвать белки-хозяева и/или связанные с ними биологические пути в пользу бактерии. Идентификация допустимых бактериальных эффекторов белков стала более управляемой благодаря достижениям в секвенировании бактериального генома и появлению алгоритмов, которые позволяют в силико-идентификации генов, кодирующих секрецию кандидатов и/или эукариотических Доменов. Однако выявление этих важных факторов вирулентности является лишь первым шагом. Естественно, цель состоит в том, чтобы определить молекулярную функцию эффекторов белков и выяснить, как они взаимодействуют с хозяином. В последние годы такие методы, как дрожжи двухгибридного экрана и крупномасштабных иммунопрециций в сочетании с масс-спектрометрии помогли в выявлении белково-белковых взаимодействий. Хотя идентификация партнера, связывающего хозяина, является важнейшим первым шагом на пути к выяснению молекулярной функции белка бактериального эффектора, иногда протеин-хозяин имеет несколько биологических функций (например, актин, клатрин, тубулин) или бактериальный белок не может физически связывать белки-хозяева, лишая исследователя важной информации о точном пути пребывания, которым манипулируют. Модифицированный экран токсичности дрожжей в сочетании с экраном супрессора был адаптирован для идентификации путей пребывания, пострадавших от белков бактериальных эффекторов. Экран токсичности опирается на токсическое воздействие на дрожжи, вызванное эффектор белка вмешательства в принимающей биологических путей, который часто проявляется как дефект роста. Выражение дрожжевой геномной библиотеки используется для выявления факторов, которые подавляют токсичность белка бактериального эффектора и таким образом определить белки в пути, что эффектор белка цели. Этот протокол содержит подробные инструкции как для токсичности, так и для экранов супрессора. Эти методы могут быть выполнены в любой лаборатории, способной молекулярного клонирования и выращивания дрожжей и кишечной палочки.

Introduction

Первый доклад процедур, аналогичных тем, которые представлены здесь характеризуется Legionella пневмофилы типа IV эффектор СидД, deAMPylase, который изменяет Rab1¹. Сопоставимые методы были использованы для характеристики нескольких L. пневмофила эффекторов^1,2,3. Анализ был адаптирован для характеристики Coxiella burnetii типа IV эффектор белка⁴, и в последнее время полезность этой техники была расширена для характеристики Chlamydia trachomatis включения мембранных белков⁵

Protocol

1. Подготовка носителей и реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Плиты должны быть подготовлены до дня проведения ассеа и хороши в течение 1 месяца. Медиа и реагенты могут быть сделаны в любой момент и хороши в течение 1 месяца.

1. Приготовьте 1 л раствора глюкозы (10% ж/в), растворив 100 г D-(я)-глюкозы в 800 мл дистиллированной воды в стакане 1000 мл. Отрегулируйте громкость до 1 л с дистиллированной водой. Фильтр через 0,2 мкм стерильный фильтр в стерильной 1 L бутылку хранения средств массовой информации.
2. Приготовьте 1 л раствора галактоза (10% ж/в) путем растворения 100 г D-(я)- галактоза в 800 мл дистиллированной воды в стакане 1 л. О....

Results

Прежде чем фактический экран супрессора дрожжей может быть выполнена, эффектор белка интерес должны быть проверены на токсичность в дрожжах. Это достигается путем выражения белка интереса к дрожжам под контролем галактоз-индуцируемого промоутера. Рост глюкозы (неиндуцирующие условия) следует сначала сравнить, чтобы обеспечить токсичность именно из-за выражения белка интерес и не является общим дефектом. Как показано на рисунке 3, токсичность проявляется как меньшие колонии и / или снижение р.......

Discussion

В этом протоколе излагаются пошаговые процедуры для определения биологических путей пребывания, нацеленных на бактериальные эффекторные белки с использованием модифицированной токсичности дрожжей и экрана супрессоров. Дрожжи штамм используется, S. cerevisiae W303, auxotrophic для обоих uracil и лейцин. Uracil auxotrophy штамма используется для выбора дрожжей, несущих белок интерес на векторе pYesNTA-Кан в то время как лейкин auxotrophy используется для выбора для дрожжей геномной библиотеки вектор pYep13. Дрожжи.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP2641500
Galactose	MilliporeSigma	G0750-1KG
Набор для экстракции геля	ThermoFisher Scientific	K0691
Набор для очистки ПЦР GeneFisher	Scientific	K0701
Набор для мини-подготовки плазмиды	GeneJet Thermo	K0503
Глюкоза	MilliporeSigma	G8270-1KG
Сперма сельди ДНК	Promega	D1811
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S
Дигидрат ацетата лития	MilliporeSigma	L6883-250G
Peptone	Fisher Scientific
Phusion Высокоточная ДНК-полимераза	Новая Англия Biolabs	M0530
Поли(этиленгликоль) 3350	MilliporeSigma	1546547-1G
pYep13	ATCC	37323
T4 ДНК-лигаза	New England Biolabs	M0202S
Триптофан	MilliporeSigma	470031-1G
XhoI-HF	New England Biolabs	R0146S
Экстракт дрожжей	Fisher Scientific	BP1422-500
Набор для приготовления дрожжей	Zymo	D2001
Азотная основа дрожжей без аминокислот	MilliporeSigma	Y0626-250G
Дрожжи синтетические дропаут-аут Медиа Добавки	MilliporeSigma	Y1501-20G	без урацила
Дрожжи синтетические дропаут Медиа Добавки	MilliporeSigma	Y1771-20G	без урацил, лейцин, триптофан