Method Article

Идентификация хост Пути целевых бактериальных протеинов с использованием дрожжей токсичности и супрессорэкранов

DOI:

10.3791/60488

⸱

October 25th, 2019

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Iowa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактериальные патогены выделяют белки в хост, которые нацелены на важнейшие биологические процессы. Выявление путей пребывания, мишенью для белков бактериальных эффекторов является ключом к решению молекулярного патогенеза. Здесь описан метод с использованием модифицированного супрессора дрожжей и экрана токсичности для выяснения путей пребывания, мишенью которыми становятся токсичные бактериальные протеины.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внутриклеточные бактерии выделяют вирулентные факторы, называемые эффекторными белками в цитозол хозяина, которые действуют, чтобы подорвать белки-хозяева и/или связанные с ними биологические пути в пользу бактерии. Идентификация допустимых бактериальных эффекторов белков стала более управляемой благодаря достижениям в секвенировании бактериального генома и появлению алгоритмов, которые позволяют в силико-идентификации генов, кодирующих секрецию кандидатов и/или эукариотических Доменов. Однако выявление этих важных факторов вирулентности является лишь первым шагом. Естественно, цель состоит в том, чтобы определить молекулярную функцию эффекторов белков и выяснить, как они взаимодействуют с хозяином. В последние годы такие методы, как дрожжи двухгибридного экрана и крупномасштабных иммунопрециций в сочетании с масс-спектрометрии помогли в выявлении белково-белковых взаимодействий. Хотя идентификация партнера, связывающего хозяина, является важнейшим первым шагом на пути к выяснению молекулярной функции белка бактериального эффектора, иногда протеин-хозяин имеет несколько биологических функций (например, актин, клатрин, тубулин) или бактериальный белок не может физически связывать белки-хозяева, лишая исследователя важной информации о точном пути пребывания, которым манипулируют. Модифицированный экран токсичности дрожжей в сочетании с экраном супрессора был адаптирован для идентификации путей пребывания, пострадавших от белков бактериальных эффекторов. Экран токсичности опирается на токсическое воздействие на дрожжи, вызванное эффектор белка вмешательства в принимающей биологических путей, который часто проявляется как дефект роста. Выражение дрожжевой геномной библиотеки используется для выявления факторов, которые подавляют токсичность белка бактериального эффектора и таким образом определить белки в пути, что эффектор белка цели. Этот протокол содержит подробные инструкции как для токсичности, так и для экранов супрессора. Эти методы могут быть выполнены в любой лаборатории, способной молекулярного клонирования и выращивания дрожжей и кишечной палочки.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первый доклад процедур, аналогичных тем, которые представлены здесь характеризуется Legionella пневмофилы типа IV эффектор СидД, deAMPylase, который изменяет Rab11. Сопоставимые методы были использованы для характеристики нескольких L. пневмофила эффекторов1,2,3. Анализ был адаптирован для характеристики Coxiella burnetii типа IV эффектор белка4, и в последнее время полезность этой техники была расширена для характеристики Chlamydia trachomatis включения мембранных белков5 .

Этот протокол может быть разбит на две основные части: 1) экран токсичности дрожжей, в котором бактериальный белок, представляющий интерес, выражается в дрожжах, а клоны проверяются на токсичный фенотип, о чем свидетельствует дефект роста, и 2) экран супрессора дрожжей , в котором токсичный фенотип подавляется выражением дрожжевой геномной библиотеки в токсичном штамме. Таким образом, экран токсичности является экраном для токсичных фенотипов, которые проявляются как дефекты роста, когда бактериальный эффект интереса является переэкспрессива. Токсичные клоны, успешно трансформированные с помощью бактериального эффектора и выражающие бактериальный эффектор, отбираются и сохраняются для следующего шага. Второй важный шаг включает в себя переэкспрессирование частично переваренных дрожжей геномной библиотеки в токсичных клон дрожжей. Плазмиды, составляющие дрожжевой геномной библиотеки, предложенные для использования в этом протоколе нести 5'20 кб вставки, как правило, соответствующие 3'13 дрожжей открытых кадров чтения (ORF) среднего размера гена 1,5 кб во всех плазмидах, представляющих весь геном дрожжей покрыты примерно в 10 раз. Эта часть ассея называется экраном супрессора, так как цель состоит в том, чтобы подавить токсичность белка бактериального эффектора. Потенциальные супрессорные плазмиды изолированы от дрожжей, секвенируются, и подавления ORFs определены. Обоснование, лежащее в основе экрана супрессора, состоит в том, что протеин-эффектор связывается, взаимодействует с и/или переполняет компоненты пути пребывания, на которые он нацелен, и что предоставление этих белков-хозяев в избытке может спасти токсическое воздействие на пути и, таким образом, дефект роста. Таким образом, выявленные ORF, подавляющие токсичность, часто представляют несколько участников пути хоста. Ортогоналальные эксперименты затем выполняются для проверки того, что бактериальный эффектор действительно взаимодействует с вовлеченным пути. Это особенно необходимо, если связывающий партнер, такой как клатрин или актин, был выявлен, потому что эти белки участвуют во множестве принимающих процессов. Дальнейшие эксперименты могут затем выяснить физиологическую функцию белка-эффектора во время инфекции. Токсичность и супрессор экраны также мощные инструменты для расшифровки физиологической функции бактериальных белков, которые физически не связывают белки-хозяева с сродствами, достаточными для обнаружения иммунопрецицией или которые взаимодействуют с хост в ферментативных хит-и-запустить взаимодействия, которые не могут быть обнаружены дрожжи-два гибридного экрана.

Хотя экран супрессора может быть мощным методом, чтобы выявить потенциальные физиологические взаимодействия между бактериальными белками-эффекторами и путями хозяина, бактериальный белок должен вызвать дефект роста в дрожжах, в противном случае используя его в экран супрессора будет мало пользы. Кроме того, токсичный фенотип должен привести, по крайней мере, к дефициту роста в 2х3 журнала10, иначе будет трудно определить супрессоры. Если лаборатория создана для клеточной культуры, скрининг эффектор белков для токсичности в общих клеточных линий, таких как HeLa часто может дать представление о том, стоит ли усилия, чтобы приступить к экрану токсичности дрожжей. Эктопическое выражение белка-эффектора в клетках HeLa иногда приводит к токсичности, которая очень сильно коррелирует с токсичностью в штамме дрожжей, используемом для этих экранов4. Наблюдаемые признаки стресса в клетках HeLa включают потерю стрессовых волокон, отслоение клеток от пластины и ядерный конденсацию, указывающий на апоптоз. Любое визуальное указание стресса в клетках HeLa делает интересующий белок хорошим кандидатом для индуцирования дефекта роста в дрожжах, которые размножаются гораздо быстрее и, таким образом, более чутко реагируют на возмущение основных путей.

Следует отметить, что экран супрессора не всегда определяет партнеров-хоста, связывающих сяпок, как супрессоров, но он все еще может вовлечь критические компоненты пути хоста (ы) целевых, что дает целостное представление о биологических процессах, захваченных бактериальный эффектор белка. На первый взгляд, это кажется нелогичным, потому что предоставление связующего партнера протеина-эффектора в избытке, как ожидается, спасет дефект роста. В усилиях по выявлению путей, направленных на C. trachomatis эффектор белка CT229 (CpoS), который связывается с по крайней мере 10 различных Rab GTPases во время инфекции5, ни один из Раб связывания партнеров подавлены токсичности CT229. Тем не менее, были выявлены многочисленные супрессоры, занимающиеся торговлей везикулами с покрытием clathrin (CCV), что привело к дальнейшей работе, продемонстрировавшей, что CT229 специально подрывает торговлю ХКВ, зависящим от раба. Аналогичным образом, при исследовании C. burnetii эффектор белка Cbu0041 (CirA) несколько Rho GTPases, которые спасли дефект роста дрожжей были выявлены, и позже было установлено, что CirA функции в качестве GTPase активации белка (GAP) для RhoA4.

Полезность экрана супрессора дрожжей для выяснения путей хозяина, мишенью которыми становятся бактериальные эффекторные белки, не может быть переоценена, и другие исследователи, пытающиеся охарактеризовать внутриклеточные бактериальные эффекторные белки, могут извлечь большую пользу из эти методы. Эти анализы имеют значение, если иммунопрецитарии и / или дрожжей два гибридных экранов не смогли найти связующего партнера и может выяснить, какие пути ориентированы на бактериальный эффектор белка. Здесь предоставляются подробные протоколы для токсичности и супрессоров для определения биологических путей пребывания, нацеленных на внутриклеточные бактериальные эффекторные белки, а также некоторые из распространенных препятствий, испытываемых при использовании этих анализов и их соответствующих решений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка носителей и реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Плиты должны быть подготовлены до дня проведения ассеа и хороши в течение 1 месяца. Медиа и реагенты могут быть сделаны в любой момент и хороши в течение 1 месяца.

  1. Приготовьте 1 л раствора глюкозы (10% ж/в), растворив 100 г D-(я)-глюкозы в 800 мл дистиллированной воды в стакане 1000 мл. Отрегулируйте громкость до 1 л с дистиллированной водой. Фильтр через 0,2 мкм стерильный фильтр в стерильной 1 L бутылку хранения средств массовой информации.
  2. Приготовьте 1 л раствора галактоза (10% ж/в) путем растворения 100 г D-(я)- галактоза в 800 мл дистиллированной воды в стакане 1 л. Отрегулируйте громкость до 1 мл с помощью дистиллированной воды и процедите через стерильный фильтр объемом 0,2 мкм в стерильную бутылку для хранения средств хранения 1000 мл.
  3. Приготовьте 1 л дрожжевого экстракта пептон декстроза (YPD) агар, растворив 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 20 г глюкозы и 20 г агара в 1000 мл дистиллированной воды. Автоклав в течение 20 минут и охладить в 56 градусов по Цельсию водяной бане до охлаждения. Налейте в 100 мм пластин, используя 20 мл носителей на тарелку.
  4. Приготовьте 1 l бульона YPD, растворив 10 г экстракта дрожжей, 20 г пептона и 20 г глюкозы в 1000 мл дистиллированной воды. Автоклав на 20 мин.
  5. Подготовка синтетического отсева (SD) uracil (Ура- )глюкоза агар. На 1 л растворите 6,7 г дрожжевой азотной базы без аминокислот, 1,9 г добавки отсева без урацила и 15 г агара в 800 мл дистиллированной воды. Автоклав в течение 20 минут и охладите в водяной бане 56 градусов по Цельсию до температуры 50-60 градусов по Цельсию. Используя серологический пипетку мощностью 50 мл или стерильный цилиндр, добавьте 200 мл раствора глюкозы, подготовленного в шаге 1.1. Хорошо перемешать, аккуратно закрученного или место на перемешать пластины. Налейте в 100 мм пластин, используя 20 мл носителей на тарелку.
  6. Подготовка синтетического отсева (SD) uracil (Ура- )галактозы агара. На 1 л растворите 6,7 г дрожжевой азотной базы без аминокислот, 1,9 г добавки отсева без урацила и 15 г агара в 800 мл дистиллированной воды. Автоклав в течение 20 минут и охладите в водяной бане 56 градусов по Цельсию до температуры 50-60 градусов по Цельсию. Используя серологический пипетку мощностью 50 мл или стерильный цилиндр, добавьте 200 мл раствора галактоза, подготовленного в шаге 1.2. Хорошо перемешать, аккуратно закрученного или место на перемешать пластины. Налейте в 100 мм пластин, используя 20 мл носителей на тарелку.
  7. Приготовить синтетический отсев (SD) урацил (Ura- )бульон глюкозы. Для 1 Л растворите 6,7 г дрожжевой азотной базы без аминокислот и 1,9 г добавки отсева без урасила в 800 мл дистиллированной воды. Автоклав в течение 20 минут и охладите в водяной бане 56 градусов по Цельсию до температуры 50-60 градусов по Цельсию. Используя серологический пипетку мощностью 50 мл или стерильный цилиндр, добавьте 200 мл раствора глюкозы, подготовленного в шаге 1.1.
  8. Подготовка синтетического отсева (SD) uracil (Ура- )лейцин (Leu- )глюкоза агар. На 1 л растворите 6,7 г дрожжевой азотной базы без аминокислот; 1,9 г отсева дополнение без uracil, лейцин, и триптофан; 15 г агара; и 0,076 г триптофана в 800 мл дистиллированной воды. Автоклав в течение 20 минут и охладите в водяной бане 56 градусов по Цельсию до температуры 50-60 градусов по Цельсию. Используя серологический пипетку мощностью 50 мл или стерильный цилиндр, добавьте 200 мл раствора глюкозы, подготовленного в шаге 1.1. Налейте в 100 мм пластин, используя 20 мл носителей на тарелку.
  9. Подготовка синтетического отсева (SD) uracil (Ура- )лейцин (Leu- )галактозы агара. На 1 л растворите 6,7 г дрожжевого азотного основания без аминокислот; 1,9 г отсева дополнение без uracil, лейцин, и триптофан; 15 г агара; и 0,076 г триптофана в 800 мл дистиллированной воды. Автоклав в течение 20 минут и охладите в водяной бане 56 градусов по Цельсию до температуры 50-60 градусов по Цельсию. Используя серологический пипетку мощностью 50 мл или стерильный цилиндр, добавьте 200 мл раствора галактоза, подготовленного в шаге 1.2. Хорошо перемешайте, аккуратно закрученного или поместив на перемешать пластины. Налейте в 100 мм пластин, используя 20 мл носителей на тарелку.
  10. Приготовьте синтетический отсев (SD) uracil (Ura- )лейцин (Leu- )бульон глюкозы. На 1 л растворите 6,7 г дрожжевого азотного основания без аминокислот; 1,9 г отсева дополнение без uracil, лейцин, триптофан; и 0,076 г триптофана в 800 мл дистиллированной воды. Автоклав в течение 20 минут и охладите в водяной бане 56–60 градусов по Цельсию до температуры 50 градусов по Цельсию. Используя серологический пипетку мощностью 50 мл или стерильный цилиндр, добавьте 200 мл раствора глюкозы, подготовленного в шаге 1.1.
  11. Приготовить полиэтиленовый гликоль (PEG) раствор. Добавьте 50% w/v полиэтилена гликоля 3350 в дистиллированную воду. Стерилизовать с помощью автоклавирования.
  12. Приготовьте 1 M литий-ацетат (LiAc), растворив 10,2 г обезвоживания литиевого ацетата в 200 мл дистиллированной воды. Стерилизовать с помощью автоклавирования.
  13. Подготовка ДНК спермы сельди. Разбавить 10 мг/мл ДНК сельди до 2 мг/мл с помощью дистиллированной воды. Нагрейте при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 5 минут и сразу же поставить на лед в течение 5 минут.

2. Клонирование гена интереса в дрожжей токсичности плазмид pYesNTA-Кан

ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящее время существуют различные векторы токсичности дрожжей, доступные как в коммерческом, так и в академическом плане. Экран супрессора дрожжей можно использовать в сочетании со многими из этих векторов при условии плазмида, выражающий эффектор белка интерес использует отсева выбор, кроме uracil и антибиотик маркер, кроме BlaR. Эта работа использовала модифицированный вектор pYesNTA4, 5, который включает в себя кассету сопротивления канамицина для облегчения скрининга потенциальных супрессоров. Схема клонирования должна позволить для белка-эффектора быть в кадре с промоутером Gal и его-Tag. Chlamydia trachomatis включение мембранного белка CT229 был использован в качестве доказательства принципа для этих анализов.

  1. Используйте PCR для усиления CT229 от Геномной ДНК C. trachomatis в соответствии с инструкциями производителя, используя ct229 Крпн F (CCGGTACCAATGAGCTCTCTAATTAATTAATTATCAGGT) и CT229 XhoI R (CCCTTTTTACGACGGGGTATGC) праймеры. Используйте следующие условия ПЦР: (1) 98 градусов по Цельсию на 30 с; (2) 98 градусов по Цельсию на 10 с, 55 градусов по Цельсию за 30 с, 72 градуса по Цельсию в течение 2 мин; (3) повторить шаг 2 в общей сложности 25x; (4) 72 кк в течение 10 мин; и (5) 4 градуса по Цельсию.
  2. Проанализируйте 5 ЗЛ продукта ПЦР на 1% агарозного геля(рисунок 1).
  3. Очистите оставшиеся 45 л ДНК с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Дайджест 50 зл очищенной пЦР вставить и pYesNTA-Kan(Рисунок 2) для 1 ч при 37 градусов по Цельсию в водяной бане с помощью KpnI-HF и XhoI-HF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для pYesNTA-Kan, дайджест 5 мкг плазмиды с использованием 5 зл KpnI-HF, 5 л XhoI-HF, и 6 зл буфера в общей сумме 60 зл. Для вставки, переварить весь 50 юл очищенного продукта ПЦР с использованием 2 Зл KpnI-HF, 2 Зл XhoI-HF, и 6 л буфера.
  5. Запустите весь плазмидный дайджест на 1% агарозный гель. Выполните очистку переваренной плазмиды с помощью комплекта для извлечения геля в соответствии с инструкциями производителя.
  6. Очистите переваренную пЦР-вставку с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.
  7. Клонвайте вставку в pYesNTA-Kan, используя 2 злиц pYesNTA-Kan (шаг 2.5), 2 Зл из буфера лигазы ДНК, 1 Зл из Лиги залисения T4 и 15 зл вставки (шаг 2.6). Инкубировать при комнатной температуре 1 ч.
  8. Добавьте всю реакцию клонирования к 50 МЛ компетентных клеток кишечной палочки и выполните трансформационную реакцию.
  9. Плита всей реакции преобразования на пластине LB, содержащей 100 мкг/мл карбеничиллина.
  10. Прививать 10 мл ЛБ, содержащий 100 мкг/мл карбеничиллина с тремя отдельными колониями. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия при встряхивании при 150 об/мин.
  11. Изолировать плазмид с помощью плазмидного мини-комплекта в соответствии с инструкциями производителя.
  12. Последовательность изолированных плазмидов с помощью генно-специфических грунтов (шаг 2.1).

3. Проверьте интересуя йенбелин для токсичности в дрожжах

  1. Streak Saccharomyces cerevisiae W303 на агаре YPD (шаг 1.3) для получения изолированных колоний. Инкубировать при 30 градусах по Цельсию на 24 ч.
  2. Прививать 10 мл бульона YPD (шаг 1.4) с одной колонией из агарной пластины (шаг 3.1). Инкубировать при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 150 об/мин на ночь.
  3. Добавьте 0,5 мл ночной культуры до 10 мл бульона YPD (шаг 1.4) и инкубировать при 30 градусах Цельсия с тряской при 150 об/мин на 4 ч.
    1. Пеллет 10 мл культуры при 3000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
    2. Приготовьграйте гранулы в 1 мл стерильной воды, перенесите в микроцентрифугую трубку и гранулы при температуре 3000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре.
    3. Отдохните гранулы в 1 мл литиевого ацетата 1 мм (LiAc) и гранулы на 3000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре.
    4. Повторите Лиакк мыть 2x.
    5. Снимите стирку. Отрежь гранулу в 2,4 мл 50% PEG 3350. Добавьте 360 л 1М лиакк, 500 л 2 мг/мл ДНК сельди и 400 л стерильной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этого достаточно для 20 преобразований.
    6. Добавьте 180 qL преобразования смеси от шага 3.3.5 к микроцентрифуге трубки, содержащей 5 Зл pYesNTA-Kan CT229 плазмид ДНК (100-500 нг) от шага 2.12.
    7. Инкубировать на водяной бане при 30 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
    8. Инкубировать на водяной бане при 42 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
    9. Пеллетка при температуре 3000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре.
    10. Удалите смесь преобразования с пипеткой. Приостановите гранулы в 100 л стерильной воды. Плита преобразования на SD Ura- агар с глюкозой (шаг 1.5).
    11. Инкубировать пластины при 30 градусах по Цельсию в течение 48 ч.
  4. Прививать 5 мл SD Ura- бульон, содержащий глюкозу (шаг 1.7) с одной колонией из пластины. Инкубировать на ночь при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 150 об/мин. Включите дрожжи, преобразованные только с вектором в качестве отрицательного контроля.
    1. Добавьте 180 л стерильной воды к 5 скважинам из 96 скважины (A2-A6).
    2. Vortex ночь культуры смешивать.
    3. Добавьте 180 л дрожжей к первому колодцу (A1). Серийно разбавлять 1:10 (всего шесть образцов, включая неразбавленные).
    4. Используя многоканальный пипетку, наместе 5 л каждого разбавления на SD Ura- глюкозе (шаг 1.5) и Ura- galactose (шаг 1.6) агарных пластин. Инкубировать при 30 градусах по Цельсию 48 ч.
  5. Оцените токсичность, сравнивая рост дрожжей, выражающий эффекторный белок интереса, выращенный на галактозосодержащих носителях, с ростом дрожжей, выражающих только вектор.
  6. Подтвердите выражение белка синтеза его тегов западным испугом.

4. Преобразование токсичных дрожжей с дрожжевой геномной библиотекой

  1. Прививать 100 мл SD Ura- бульон из глюкозы (шаг 1,7) с использованием 1 мл бульона от шага 3.4. Инкубировать по 16-24 ч при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 150 об/мин. Поместите 900 мл SD Ura- бульон из глюкозы при 30 градусах Цельсия на ночь, чтобы предварительно разогреть средства массовой информации.
  2. Добавьте все 100 мл ночной культуры в предварительно разогретую 1 l колбу. Инкубировать 4-5 ч при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 150 об/мин.
    1. Пеллет культуры на 6000 х г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.
    2. Отбросьте супернатант. Отрежь гранулу в 250 мл стерильной воды. Пеллет культуры на 6000 х г в течение 5 мин при 4 кв. C.
    3. Отбросьте супернатант. Отрежь гранулу в 250 мл 1 мМ LiAc. Пеллет культуры на 6000 х г в течение 5 мин при 4 кв. C.
    4. Удалить LiAc и повторно йрупелв в 9,6 мл 50% PEG 3350. Добавьте 1,44 мл 1М лиакк, 2 мл 2 мг/мл ДНК сельди, 50 мкг геномной библиотеки pYep13 (ATCC 37323). Отрегулируйте объем до 15 мл со стерильной водой. Смешайте осторожно инверсии.
    5. Инкубировать на водяной бане при 30 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
    6. Добавьте 750 л диметилсулькоксида (DMSO) для повышения эффективности преобразования. Инкубировать на водяной бане при 42 градусах по Цельсию в течение 30 мин. Смешайте нежной инверсией каждые 10 минут.
    7. Пеллет дрожжи при температуре 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    8. Откажитесь от супернатанта и отдохните гранулы в 10 мл стерильной воды. Пеллетка при температуре 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    9. Приостановите гранулы в 8 мл стерильной воды.
    10. Для определения эффективности преобразования разбавьте 1:10 и пластину 100 л каждого разбавления на SD Ura- Leu- глюкоза агара (шаг 1.8).
    11. Плита 200 л образца на пластинах SD Ura- Leu- galactose agar (шаг 1.9). Используйте 50 пластин в общей сложности.
    12. Инкубировать при 30 градусах Цельсия в течение 48-96 ч или до появления колоний.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии обычно появляются на агарных пластинах глюкозы на 48-72 ч и галактоза агар пластин на 72-96 ч.
  3. Патч колоний (потенциальных спасений) на SD Ура- Leu- galactose агар (шаг 1.9) для расширения и сделать запас. Инкубировать при 30 градусах по Цельсию при 24-48ч.
  4. Прививать 5 мл SD Ura- Leu- бульон глюкозы (шаг 1.10) с использованием части патча. Инкубировать на ночь при 26 градусах Цельсия при встряхивании при 150 об/мин.
    1. Добавьте 180 л стерильной воды к 5 скважинам из 96 скважины (A2-A6).
    2. Vortex ночь культуры смешивать.
    3. Добавьте 180 л дрожжей к первому колодцу (A1). Серийно разбавлять 1:10 (всего шесть образцов, включая неразбавленные).
    4. Используя многоканальный пипетку, наместе 5 л каждого разбавления на SD Ura- глюкозе и SD Ura- галактозных агарных пластинах. Включите токсичный эффектор только в качестве контроля.
    5. Инкубировать при 30 градусах по Цельсию 48 ч.
  5. Сравните рост дрожжей, выражающих токсичный эффектор только дрожжи, содержащие потенциальные супрессоры. Только приступить к потенциальным супрессоров, которые уменьшились токсичности по сравнению с дрожжами, выражающих эффектор в одиночку.

5. Определить и подтвердить супрессоры

  1. Прививать 5 мл SD Ura- Leu- бульон глюкозы (шаг 1.10) с 100 л дрожжей со ступенькой 4.4 и инкубировать ночь при 30 градусах Цельсия с тряской при 150 об/мин.
    1. Пеллет дрожжи при температуре 3000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Аккуратно отбросьте супернатант с помощью пипетки.
    2. Изолировать плазмид с дрожжевой плазмид мини-комплект в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Преобразуйте изолированную плазмиду в компетентные клетки кишечной палочки и наплитуйте всю трансформацию на агаре LB с 100 мкг/мл карбеничиллина. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 24 ч.
  3. Прививать 10 мл бульона LB, содержащего 100 мкг/мл карбеничиллина, с тремя колониями из тарелки и инкубировать при 37 градусах Цельсия в одночасье с тряской при 150 об/мин.
    1. Культура пеллет при температуре 3000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Изолировать плазмид с помощью комплекта miniprep в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Переформатировать токсичные дрожжи с изолированными плазмидов от шага 5.3.1 после шагов в части 3 протокола.
    1. Прививать 5 мл SD Ura- Leu- глюкозный бульон с колонией из преобразуемая пластины. Инкубировать на ночь при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 150 об/мин.
    2. Пятно на Ura- Leu- глюкоза и галактоза агар для подтверждения подавления токсичности.
  5. Последовательность с использованием pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) и pYep13 R (TGATGCGCCACGATGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC) грунтовки для выявления дрожжей ORFs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прежде чем фактический экран супрессора дрожжей может быть выполнена, эффектор белка интерес должны быть проверены на токсичность в дрожжах. Это достигается путем выражения белка интереса к дрожжам под контролем галактоз-индуцируемого промоутера. Рост глюкозы (неиндуцирующие условия) следует сначала сравнить, чтобы обеспечить токсичность именно из-за выражения белка интерес и не является общим дефектом. Как показано на рисунке 3, токсичность проявляется как меньшие колонии и / или снижение р...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе излагаются пошаговые процедуры для определения биологических путей пребывания, нацеленных на бактериальные эффекторные белки с использованием модифицированной токсичности дрожжей и экрана супрессоров. Дрожжи штамм используется, S. cerevisiae W303, auxotrophic для обоих uracil и лейцин. Uracil auxotrophy штамма используется для выбора дрожжей, несущих белок интерес на векторе pYesNTA-Кан в то время как лейкин auxotrophy используется для выбора для дрожжей геномной библиотеки вектор pYep13. Дрожжи...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Шелби Андерсен, Эбби Маккалоу и Лорел Вудс за помощь в этих методах. Это исследование было профинансировано за счет стартап-фондов от Университета Айовы Департамента микробиологии и иммунологии мэри М. Вебер.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgarFisher ScientificBP2641500
GalactoseMilliporeSigmaG0750-1KG
Набор для экстракции геляThermoFisher ScientificK0691
Набор для очистки ПЦР GeneFisherScientificK0701
Набор для мини-подготовки плазмидыGeneJet ThermoK0503
ГлюкозаMilliporeSigmaG8270-1KG
Сперма сельди ДНКPromegaD1811
KpnI-HFNew England BiolabsR3142S
Дигидрат ацетата литияMilliporeSigmaL6883-250G
PeptoneFisher Scientific
Phusion Высокоточная ДНК-полимеразаНовая Англия BiolabsM0530
Поли(этиленгликоль) 3350MilliporeSigma1546547-1G
pYep13ATCC37323
T4 ДНК-лигазаNew England BiolabsM0202S
ТриптофанMilliporeSigma470031-1G
XhoI-HFNew England BiolabsR0146S
Экстракт дрожжейFisher ScientificBP1422-500
Набор для приготовления дрожжейZymoD2001
Азотная основа дрожжей без аминокислотMilliporeSigmaY0626-250G
Дрожжи синтетические дропаут-аут Медиа ДобавкиMilliporeSigmaY1501-20Gбез урацила
Дрожжи синтетические дропаут Медиа ДобавкиMilliporeSigmaY1771-20Gбез урацил, лейцин, триптофан

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
  2. Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
  3. Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
  4. Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
  5. Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
  6. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119(1995).
  7. Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070(1991).
  8. Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21(2007).
  9. Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
  10. Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
  11. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258(2011).
  12. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
  13. Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989(2013).
  14. Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
  15. Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Yeast Toxicity ScreenSuppressor ScreenBacterial Effector ProteinsHost Pathway IdentificationChlamydia trachomatisYeast Genomic LibraryPlasmid TransformationGrowth Defect AssaySerial DilutionDouble Drop out Agar

Related Articles