Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Клетки коронарного прародителя и растворимые биомаркеры в сердечно-сосудистом прогнозе после коронарной ангиопластики

5.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60504

⸱

28 января 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Metabolism and Clinical Research Laboratory & Regenerative Medicine and Tissue Engineering Laboratory, 2Hemodynamics Unit, Cardiology Department, Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE, 3Laboratorio de Biología del Desarrollo y Teratogénesis Experimental, Hospital Infantil de México Federico Gómez

В этой статье

Краткое содержание

Развитие основных неблагоприятных сердечно-сосудистых событий, которые влияют на прогноз сердечно-сосудистой системы после коронарной ангиопластики, зависит от степени повреждения коронарной короны и сосудоску. Использование новых коронарных клеточных и растворимых биомаркеров, реактивных к повреждениям сосудов и ремонту, полезно для прогнозирования развития MACEs и прогноза.

Аннотация

Основные неблагоприятные сердечно-сосудистые события (MACEs) негативно влияют на сердечно-сосудистый прогноз пациентов, перенесших коронарную ангиопластику из-за коронарной ишемической травмы. Степень коронарного повреждения и механизмы восстановления сосудов являются факторами, влияющими на дальнейшее развитие MACEs. Внутренние сосудистые особенности, такие как характеристики бляшки и сложность коронарных артерий, продемонстрировали прогностические данные для MACEs. Однако использование внутрикоронарных циркулирующих биомаркеров было постулировано как удобный метод ранней идентификации и прогноза MacEs, поскольку они более точно отражают динамические механизмы, связанные с повреждением коронарного состояния и ремонтом. Определение коронарных циркулирующих биомаркеров во время ангиопластики, таких как количество субпопуляций моноядерных клеток-прародителей (MpCs), а также концентрация растворимых молекул, отражающих воспаление, клеточную сцепку и ремонт, позволяет оценка будущих событий и прогноз MACEs 6 месяцев после коронарной ангиопластики. Этот метод подчеркивается его трансляционным характером и лучшей производительностью, чем периферическая кровь, циркулирующая биомаркерами относительно прогнозирования MACEs и его влияния на прогноз сердечно-сосудистой системы, который может быть применен для расслоения риска пациентов при ишемической болезни сердца, проводящей ангиопластику.

Введение

Коронарная ангиопластика и стентирование представляют собой процедуру спасения пациентов с ишемической болезнью сердца (CAD). Однако основные неблагоприятные сердечно-сосудистые события (MACEs), включая сердечно-сосудистую смерть, инфаркт миокарда, коронарный рестеноз, а также эпизоды стенокардии или декомпенсации сердечной недостаточности, могут произойти через несколько месяцев после коронарного вмешательства, что вызвало незапланированные визиты в больницу. MACEs являются общими во всем мире и их morbi-смертность высока1.

Коронарная ишемическая травма вызывает раннюю сосудистую реакцию и репаративные механизмы, включающие мобилизацию ПДК из-за их дифференциации и/или ангио-репаративного потенциала, а также выработку растворимых молекул, таких как межклеточные молекулы адгезии (ИКАМ), матричные металлопротеины (ММЗ) и реактивные виды кислорода, отражающие клеточную аднезию, рефреймирование тканей, рефреймирование тканей. Хотя внутренние сосудистые особенности, такие как характеристики бляшки и сложность коронарной артерии были использованы для прогнозирования MACEs, некоторые исследования показали, что биомаркеры, связанные с механизмами травмы и ремонта, происходящих в коронарном эндотелии может быть очень полезным для ранней идентификации и прогноза сердечно-сосудистых событий у пациентов с CAD представлены коронарной ангиопластики2,3,5.

Непрерывный интерес к пониманию механизмов, лежащих в основе травмы САПР и ремонта побудило исследователей изучить внутрикоронарные циркулирующие биомаркеры, потому что коронарная выборка более тесно отражает повреждения сосудов и ремонт6. Однако характеристики коронарных биомаркеров в исследованиях человека были скудными7,8,9. Таким образом, цель настоящего исследования состояла в том, чтобы описать метод определения количества коронарных циркулирующих ПДК и растворимых молекул, отражающих как сосудистые травмы, так и ремонт, и показать, связаны ли эти биомаркеры с MACEs и клиническим прогнозом пациентов САПР, которые прошли коронарную ангиопластику. Этот метод основан на использовании связанных с сосудистой, циркулирующих ПЧК и растворимых молекул, полученных путем отбора проб, наиболее близких к повреждению сосуда. Он также может быть полезен для клинических исследований для ишемии нижних конечностей, инсульт, васкулит, венозный тромбоз, и другие травмы, связанные с сосудистой травмы и ремонта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол отвечает институциональным руководящим принципам Комитета по этике исследований человека.

1. Коронарная ангиография, УЗИ и анализ крови

  1. Запросить базовую клиническую и демографическую информацию до коронарного вмешательства. Сбор данных человека: возраст, пол, текущее состояние курения, индекс массы тела (ИМТ), высокое кровяное давление, дислипидемия, сахарный диабет, лекарства, и указание на текущую коронарную ангиографию.
  2. Выполняйте коронарную ангиографию с помощью катетеризации сердца с использованием радиального подхода. Эта процедура должна проводиться в рамках флюороскопии руководства в гемодинамике комнате экспертами-кардиологами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определите бесценные сосуды. Для настоящего исследования, evaluable сосуды были определены как артерии с секциями больше, чем 1,5 мм и стеноз промена более 50%.
  3. Продвигай внутрисосудистый ультразвуковой катетер в интересуемый регион и записывай изображения. Используйте соответствующее программное обеспечение для определения местонахождения и измерения наименьшей области светящегося.
  4. Используйте коронарный катетер для сбора 10 мл крови из ближайшего к налету.
  5. После выписки пациента, график периодических медицинских оценок для последующей исследования конечных точек. Если телефонный контакт невозможен или визит врача задерживается более чем на 2 месяца, попросите уполномоченное лицо (ранее разработанное) проверить конечные точки исследования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрим любой из следующих MACE: 1) сердечно-сосудистой смерти, 2) новый инфаркт миокарда, 3) нестабильный стенокардия, побуждающие незапланированный медицинский визит в течение 24 ч, 4) стентреста, как показано на коронарной ангиографии, 5) эпизоды декомпенсированной сердечная недостаточность, требующая клинического внимания.

2. Определение циркулирующих ПДК(рисунок 2)

  1. Обработка крови в течение 1 ч из коллекции. Передача 6 мл собранной крови в коническую трубку 15 мл и разбавить 1:1 (v/v) с 1x фосфатбуферным сольником (PBS), рН 7,4.
  2. Добавьте 2 мл градиента плотности среднего до трех пробирков. Тщательно перенесите три аликота разбавленной крови в каждую пробирку, содержащую среду градиента плотности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем градиентной плотности средней и разбавленной крови не должен превышать трех четвертей максимальной емкости пробирки.
  3. Центрифуга на 1800 х г,4 кв кв 30 мин. Перенесите полосу на интерфейсе между слоями в новую трубку. Добавьте 2 мл PBS и центрифугу при 1800 х г,4 кв. м в течение 6 мин. Гранулы будут содержать MPCs.
  4. Вымойте гранулы несколько раз. Присвоить предыдущее решение и аккуратно resuspend клеточной гранулы в свежем PBS. Для последующих смылок, центрифуга на 1800 х г, 4 кв кв 2 мин. Повторите процесс 6x.
  5. Приостановите действие клеточной гранулы в 1 мл PBS. Смешайте 20 qL клеточной подвески с 0,4% трипан синий, разбавленный 1:1 (v/v). Нанесите каплю на гемоцитометр и посчитайте неокрашенные клетки под легким микроскопом.
  6. Приступить к определению ПДК. Этикетка 5 мл потока цитометрии труб и aliquot из 1 х 106 ячеек на трубку. Подготовьте соответствующие изотипные контрольные антитела. Центрифуга при 1800 х г,4 кв кв 6 мин и отбросить супернатант.
  7. Добавьте первичные антитела, разбавленные в 100 л инкубационного раствора антител, состоящего из 1x PBS (pH 7.4), 2 ММ этиленденадиаминететраацетической кислоты (ЭДТА), и 0,05% альбумина сыворотки крупного рогатого скота (BSA). Отдохните на 10 с и инкубировать в течение 20 минут при 4 градусах По Цельсию, с защитой от света. Протокол может быть приостановлен на этом этапе путем фиксации лимфоцитов в 4% параформальдегида в PBS и хранения образцов до 24 ч при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные концентрации первичных антител, используемых в настоящем протоколе, были CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50.
  8. Центрифуга при 1800 х г,4 кв кв 2 мин и отбросить супернатант. Повторное в 500 л 1x PBS (pH 7.4), 2 mM EDTA.
  9. Выполните анализ цитометрии потока. Используйте изотипные контрольные антитела для настройки фонового окрашивания. Затем выберите лимфоциты, распространяющиеся на участке FSC/SSC, пытаясь исключить остаточные гранулоциты, клеточный мусор и другие частицы, которые обычно расположены в нижней, левой распределенной на участке. Такое распределение считается 100%.
  10. Используйте ворота, содержащие большое количество клеток с общим иммунофенотипом CD45 и CD34. Для двойных положительных иммунофенотипов, используйтеворота, ранее идентифицирующие CD45 , CD34, с добавлением либо KDR (VEGFR-2), CD133 , или CD184. Определите субпопуляции MPC по их конкретным маркерам поверхности клеток. Отчет как процент закрытых событий.
  11. Определить основные субпопуляции ПДК. В настоящем исследовании основными иммунофенотипами были CD45cd34cd34, CD45-CD34-CD184,CD45-CD34 , CD134 , CD134
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые маркеры поверхности клеток были CD45 (лимфоциты), CD34 (эндотелиальные и/или сосудистые клетки), KDR (VEGFR-2, мембранный маркер эндотелиальных клеток), CD133 (эндотелиальные клетки-протеиторы) и CD184 (гематопоитические стволовые клетки и эндотелиальные клетки).

3. Определение плазменных растворимых биомаркеров

  1. Используйте фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) для определения концентрации SICAM-1 и MMP-9(рисунок 3,верхний ряд).
    1. Centrifuge образцы крови на 3000 х г,комнатная температура в течение 5 мин и собирать плазму.
    2. Пометьте стандарты, пробные трубки и контрольные трубки. Уравновесите предварительно покрытые колодцы в панели анализа, промыв 2x с стиральным буфером, предусмотренным в комплекте ELISA.
    3. Перенесите стандарты, образцы и элементы управления в скважины. Печать и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 90 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте скважины высохнуть полностью.
    4. Откажитесь от содержимого и добавьте антитела для обнаружения биотина. Печать и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 60 мин.
    5. Отбросьте содержимое и вымойте 3x. Печать доска и инкубировать последовательно с стрептавидин рабочий раствор следуют тетраметилбензидин субстрата при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, светозащищенный. Вымойте 3x между инкубациями. Когда цвет развивается, добавьте стоп-решение и прочтите абсорбцию оптической плотности в микроплите ELISA reader.
  2. Используйте иммуномагнитный мультиплексный анализ для определения концентрации фактора некроза опухоли альфа (ТНФЗ) и интерлейкина 1 бета(IL-1)(рисунок 3, нижняя строка).
    1. Пометьте стандарты, пробные трубки и контрольные трубки.
    2. Вортекс магнитных бисерных флаконов на 30 с. Перенесите подвеску бисера в соответствующие по размеру трубки, а затем в колодцы в мультиплексирующей пластине. Периодический вихрь позволяет избежать осадков из бисера.
    3. Надежно вставьте ручную магнитную пластину шайбы. Подождите 2 минуты для шариков, чтобы накопить на дне каждого колодца и быстро инвертировать как ручной магнитной пластины шайбу и пластины сборки, над раковиной или отходов контейнера. Не забудьте использовать ручную магнитную пластину шайбу для поддержания бисера внутри колодцев.
    4. Добавьте 150 л буфера для мытья в каждую скважину и подождите 30 с, чтобы бусы накапливались на дне. Отбросьте содержимое в шаг3.2.3. Затем добавьте 25 юл универсального буфера асссе (предоставленного в комплекте), за которым последуют 25 юл подготовленных стандартов, образцов и элементов управления.
    5. Печать пластины и инкубировать в течение не менее 60 минут при комнатной температуре, светозащищенные, с постоянной тряски при 500 об/мин. Кроме того, инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия, светозащищенный, с постоянной тряской при 500 об/мин, если это возможно.
    6. Вымойте 2x, добавив 150 л буфера стирки и подождите 30 с. Отбросьте содержимое, вставив ручную магнитную шайбу пластины. Подождите 2 минуты и инвертировать над раковиной или контейнером отходов.
    7. Инкубировать последовательно с 25 л обнаружения антитела смеси следуют 25 ЗЛ стрептавидина-PE растворпри температуре 30 мин, герметичной и светозащищенной, с постоянной тряски при 500 об/мин. Вымойте 2x между инкубациями, как описано в шаге 3.2.6.
    8. Получить показания. Добавьте 120 зл и считывающий буфер. Печать пластины и инкубировать 5 мин при комнатной температуре, светозащищенный, с постоянной тряской при 500 об/мин. Выполнить чтение на мультиплексирования считыватель. Отрегулируйте параметры чтения в соответствии с каждым из них.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Коронарная, венозная синусовая и периферическая кровь были собраны у 52 пациентов, перенесших коронарную ангиографию(рисунок 1)и показали высокую распространенность гипертонии и дислипидемии. При клиническом последующем последующем исследовании 11 (21,1%) MACEs произошло через 6 месяцев после коронарной ангиографии: смерть (n No 1), стенокардия, требующая посещения больницы (n No 6), инфаркт миокарда (n No 2), и/или признаки сердечной недостаточности (n No 4)...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сбор крови из пораженной коронарной артерии может быть затруднен. Иногда коронарная артерия едва доступна. В этом случае, выборка из венозной синуса может быть альтернативой. Мы провели проверку, сравнивая циркулирующие биомаркеры в коронарной артерии против венозной синусовой синуса, без существенных различий. Однако эффективность циркулирующих биомаркеров была подтверждена только для коронарных проб. Таким образом, производительность биомаркеров, полученных из венозной синуса еще предстоит изучить.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят поддержку институциональной программы E015; и Фондо Секторальный ФОССИС-КоНАСИТ, SALUD-2014-1-233947.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BSARoche10735086001бычью сыворотку альбумин (BSA) в качестве буферного агента, стабилизатора, стандартного и для смешивания.
Калибровочные бусиныMiltenyi Biotec / MACS#130-093-607Калибровочные бусины MACQuant поставляются в водном растворе, содержащем 0,05% азида натрия. 3,5 мл для проведения до 100 тестов
CD133/1 (AC133)-PEMilteny Biotec / MACS#130-080-801Антитело, конъюгированное с R-фикоэритрином в буфере PBS/EDTA
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770Miltenyi Biotec / MACS#130-103-798Моноклональный, изотип рекомбинантный человеческий IgG1, конъюгированный
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APCMiltenyi Biotec / MACS#130-093-601Антитело, конъюгированное с R-фикоэритрином в буфере PBS/EDTA
CD34-FITCMiltenyi Biotec / MACS#130-081-001Клон моноклонального антитела AC136 выделяет эпитоп класса III CD34
CD45- VioBlueMiltenyi Biotec / MACS#130-092-880Моноклональное антитело CD45, человеческие конъюгированные
конические пробиркиThermo SCIENTIFIC#33965115 мл конические центрифужные пробирки
Цитометрические пробиркиFALCON Corning Brand#3520525 мл полистироловая трубка с круглым дном. 12x75 стиль. Стерильный.
EDTABIO-RAD#161-0729Тяжелые металлы, (как Pb) < 10 ppm, Fe < 0,01%, As < 1 ppm, Нерастворимые < 0,005%
Улучшенный NeubauerБез маркиБез каталожного номераГемоцитометр для подсчета клеток. (диапазон 0,1000 мм, 0,0025 мм2)
K2 EDTA Пробирки для сбора кровиBD Vacutainer#367863Сиреневая пластиковая пробирка для вакуума (K2E) 10,8 мг, 6 мл.
стволовых клетокLymphoprep01-63-12-002-AСтерильна и проверена на наличие эндотоксинов. Плотность: 1,077± 0,001 г/мл
ПараформальдегидSIGMA-ALDRICHФиксация биологических образцов, (порошок, 95%)
Пипетка Трансфер 1,3 млCRM GlobePF1016, PF1015Трансферная пипетка - это инструмент, который облегчает перенос жидкости с большей точностью.
ПробиркиKIMBLE CHASE45060 13100Термостойкие пробирки. РАЗМЕР/КОЛПАЧОК 13 x 100 мм
Технология #SZBF0920V

Ссылки

  1. Cassar, A., Holmes, D. R. Jr, Rihal, C. S., Gersh, B. J. Chronic coronary artery disease: diagnosis and management. Mayo Clinic Proceedings. 84 (12), 1130-1146 (2009).
  2. Regueiro, A., et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: time-course after acute myocardial infarction and stroke. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).
  3. Sen, S., McDonald, S. P., Coates, P. T., Bonder, C. S. Endothelial progenitor cells: novel biomarker and promising cell therapy for cardiovascular disease. Clinical Science (Lond). 120 (7), 263-283 (2011).
  4. Samman Tahhan, A., et al. Progenitor Cells and Clinical Outcomes in Patients With Acute Coronary Syndromes. Circulation Research. 122 (11), 1565-1575 (2018).
  5. Tomulić, V., Gobić, D., Lulić, D., Židan, D., Zaputović, L. Soluble adhesion molecules in patients with acute coronary syndrome after percutaneous coronary intervention with drug-coated balloon, drug-eluting stent or bare metal stent. Medical Hypotheses. 95, 20-23 (2016).
  6. Jaumdally, R., Varma, C., Macfadyen, R. J., Lip, G. Y. Coronary sinus blood sampling: an insight into local cardiac pathophysiology and treatment? European Heart Journal. 28 (8), 929-940 (2007).
  7. Kremastinos, D. T., et al. Intracoronary cyclic-GMP and cyclic-AMP during percutaneous transluminal coronary angioplasty. International Journal of Cardiology. 53 (3), 227-232 (1996).
  8. Karube, N., et al. Measurement of cytokine levels by coronary sinus blood sampling during cardiac surgery with cardiopulmonary bypass. American Society for Artificial Internal Organs Journal. 42 (5), M787-M791 (1996).
  9. Truong, Q. A., et al. Coronary sinus biomarker sampling compared to peripheral venous blood for predicting outcomes in patients with severe heart failure undergoing cardiac resynchronization therapy: the BIOCRT study. Heart Rhythm. 11 (12), 2167-2175 (2014).
  10. Suárez-Cuenca, J. A., et al. Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).
  11. Suárez-Cuenca, J. A., et al. Relation of Coronary Artery Lumen with Baseline, Post-angioplasty Coronary Circulating Pro-Inflammatory Cytokines in Patients with Coronary Artery Disease. Angiology Open Access. 7, 01(2019).
  12. Schmidt-Lucke, C., et al. Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol. PLoS One. 5 (1), e13790(2010).
  13. Moyer, C. F., Sajuthi, D., Tulli, H., Williams, J. K. Synthesis of IL-1 alpha and IL-1 beta by arterial cells in atherosclerosis. American Journal of Pathology. 138 (4), 951-960 (1991).
  14. Morales-Portano, J. D., et al. Echocardiographic measurements of epicardial adipose tissue and comparative ability to predict adverse cardiovascular outcomes in patients with coronary artery disease. International Journal of Cardiovascular Imaging. 34 (9), 1429-1437 (2018).
  15. Huang, X., et al. Endothelial progenitor cells correlated with oxidative stress after mild traumatic brain injury. Yonsei Medical Journal. 58 (5), 1012-1017 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Мононуклеарные клетки-предшественникипроточная цитометрияИФАиммуномагнитное мультиплексированиецентрифугирование в градиенте плотностиCD34-положительные CD133-положительныерастворимый ICAM-1основные неблагоприятные сердечно-сосудистые события
Клетки коронарного прародителя и растворимые биомаркеры в сердечно-сосудистом прогнозе после коронарной ангиопластики
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.