Методическая статья

Идентификация новых регуляторов транспирации растений путем масштабного теплового скрининга в Helianthus Annuus

6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60535

⸱

30 января 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Program in Molecular Biology, Pomona College

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы предоставляем метод для выявления модуляторов перепирания листа путем масштабного скрининга сложной библиотеки.

Аннотация

Адаптация растений к биотическим и абиотическим стрессам регулируется целым рядом факторов, среди которых решающую роль играет регуляция стоматальной диафрагмы в ответ на дефицит воды или патогенные микроорганизмы. Выявление малых молекул, которые регулируют стоматального движения, может способствовать пониманию физиологической основы, с помощью которой растения адаптируются к окружающей среде. Крупномасштабные подходы скрининга, которые были использованы для выявления регуляторов стоматального движения, имеют потенциальные ограничения: некоторые в значительной степени полагаются на абскизиновой кислоты (ABA) гормональный сигнальный путь, поэтому исключая ABA-независимые механизмы, в то время как другие полагаются на наблюдение косвенных, долгосрочных физиологических эффектов, таких как рост и развитие растений. Представленный здесь метод скрининга позволяет проводить масштабную обработку растений библиотекой химических веществ в сочетании с прямой количественной оценкой их транспирации с помощью тепловизоров. Поскольку испарение воды через транспирацию приводит к охлаждению поверхности листьев, тепловизор обеспечивает неинвазивный подход к исследованию изменений в стоматальной проводимости с течением времени. В этом протоколе, Helianthus annuus саженцы выращиваются гидропонно, а затем лечение корневых кормления, в котором первичный корень вырезать и окунается в химическое вещество, тестируемое. Тепловизорс, за которым следует статистический анализ изменения температуры колидора с течением времени, позволяет выявить биоактивные молекулы, модулирующие стоматальную диафрагму. Наши эксперименты по проверке концепции показывают, что химическое вещество можно переносить из вырезанного корня в котиледон саженца подсолнечника в течение 10 минут. Кроме того, когда растения обрабатываются ABA в качестве положительного контроля, повышение температуры поверхности листьев может быть обнаружено в течение нескольких минут. Таким образом, наш метод позволяет эффективно и быстро идентифицировать новые молекулы, регулирующие стоматальную диафрагму.

Введение

Стрессоустойчивость растений является полигенное признаки под влиянием различных молекулярных, клеточных, развития и физиологических особенностей и механизмов1. Растения в колеблющейся среде должны постоянно модулировать свои стомататные движения, чтобы сбалансировать фотосинтетический спрос на углерод, сохраняя при этом достаточную воду и предотвращая вторжение патогенов2; однако механизмы, с помощью которых принимаются эти компромиссные "решения", плохо изучены3. Внедрение биологически активных молекул в растения может модулировать их физиологию и помочь в зондирования новых механизмов регулирования.

Крупномасштабный скрининг малых молекул является эффективной стратегией, используемой в открытии противораковых препаратов и фармакологических анализов для проверки физиологических эффектов сотен и тысяч молекул в течение короткого периода времени4,5. В биологии растений, высокой пропускной скрининг показал свою эффективность, например, в выявлении синтетической молекулы пирабактина6, а также открытие долгожданного рецептора абсциновой кислоты (АБА)7,8. С тех пор, агонисты и антагонисты рецепторов ABA, и небольшие молекулы, способные модулировать выражение ABA-индуцируемых генов репортера были определены9,10,11,12,13,14,15. Высокопроизводительные подходы скрининга в настоящее время доступны для выявления небольших соединений, которые могут модулировать стоматальной диафрагмы имеют некоторые недостатки: (i) протоколы, вращающиеся вокруг ABA сигнальный путь может предотвратить выявление новых ABA-независимых механизмов, и (ii) в виво стратегии, используемые для идентификации биоактивных малых молекул полагаться в первую очередь на их физиологическое воздействие на прорастания или саженство.

Кроме того, хотя существует множество способов лечения растений биологически активными молекулами, большинство из них не очень хорошо подходят для крупномасштабного исследования стоматарального движения. Короче говоря, три наиболее распространенных метода являются применение листвятки путем распыления или погружения, обработки корневой системы и корневого орошения. Приложение Foliar не совместимо с наиболее распространенными и быстрыми методологиями для измерения стоматаральной диафрагмы, так как наличие капель на поверхности листа мешает крупномасштабному сбору данных. Основными ограничениями корневого орошения являются большие потребности в объеме выборки, потенциальное удержание соединений элементами в ризосфере и зависимость от активного усвоения корней.

Здесь мы представляем крупномасштабный метод выявления новых соединений, регулирующих транспирацию растений, который не обязательно включает в себя аБА или известные механизмы реагирования на засуху и позволяет эффективно и надежно очищая растения. В этой системе, Helianthus annuus растения обрабатываются с использованием корневого кормления подход, который состоит из резки основного корня саженцев, выращенных гидропонно и погружения разреза в образец решения. После обработки влияние каждого соединения на транспирацию растений измеряется с помощью инфракрасной тепловизионной камеры. Поскольку основным фактором, определяющим температуру поверхности листьев, является скорость испарения из листа, тепловизионные данные могут быть непосредственно коррелированы с стоматальной проводимостью. Таким образом, относительное изменение температуры листа после химической обработки обеспечивает прямое средство количественной оценки транспирации растений.

H. annuus является одним из пяти крупнейших масличных культур в мире16 и открытий, сделанных непосредственно на этом заводе может облегчить будущие передачи технологии. Кроме того, H. annuus саженцы имеют большие и плоские котиледоны, а также толстый первичный корень, который был идеальным для развития этого протокола. Тем не менее, этот метод может быть легко адаптированы к другим растениям и различных соединений.

Этот протокол может быть использован для эффективной идентификации молекул, способных вызвать стоматальное закрытие или способствовать стоматальному открытию, что имеет серьезные последствия для понимания сигналов, которые регулируют стоматальную проводимость и адаптацию растений к окружающей среде Напряжения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Выращивание растений

  1. Добавьте слой тонкого вермикулита толщиной 4 см к стандартным 10 дюйма х 20 дюйма (254 мм х 501 мм) подносы для растений без отверстий.
  2. Поместите держатели семян (см. Таблица Материалов) 2 см друг от друга в подносах растений.
  3. Заполните держатели семян вермикулитом.
  4. Поместите семена подсолнечника с его остроконечным концом вниз в каждом держателе семян, толкая вниз так половина семян остается открытым.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Семя подсолнечника является асимметричным и заостренный конец, откуда радикл появится должны указывать вниз. Правильное размещение семян имеет важное значение, поскольку переориентация корней и стебля невозможна в пределах держателей семян. Закругленный конец семени должен протянуться мимо верхней части держателя семян.
  5. После того, как семена на месте, покрыть их дополнительным 2 см толщиной слой мелкого вермикулита. Вода, затуманивая сверху. Поверхность должна оставаться влажной через час. Если это так, накройте подносы крышками.
  6. Выращивайте растения в камере роста или теплице. Рекомендуемые условия : интенсивность света 140 фотон-м -2с-1 и фотопериод 16 ч свет при 22 градусах Цельсия и 9 ч темной при 20 градусах По цельсии в течение 5 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полив не должен быть необходимым, если поверхность становится заметно сухой.

2. Настройка гидропонной системы

  1. Найти подходящий контейнер, подходящий для выращивания растений гидропонно. Размер контейнера должен быть адаптирован к пространству, имеющегося в камере роста или теплице. Рекомендуется минимальная глубина 15 см.
  2. Заполните контейнер дистиллированной водой и добавьте общие удобрения гидропоники, как указано производителем. Полученный гидропонный раствор должен быть газирован и находиться в постоянном движении, что может быть достигнуто с помощью воздушных и водяных насосов.
  3. Подготовьте гидропоники поплавки.
    1. Вырежьте лист 2 см толщиной расширенной полистирол пены (см. Таблица материалов) на размеры контейнера. Лист должен покрывать большую часть поверхности контейнера, чтобы ограничить рост водорослей. Инструмент сжигания древесины эффективен для резки полистироловой пены и достаточно универсален для этого протокола.
      ВНИМАНИЕ: Пары или пары, выделяемые при горячей резке полистироловой пены, представляют серьезную опасность для здоровья. Используйте надлежащую защиту дыхательных путей. Пользователи также могут удовлетворить требования к вентиляции, разрезая пену под капотом дыма.
    2. Сделайте отверстия (1-2 см в диаметре) в пенопласте полистирола с помощью инструмента сжигания древесины. Расстояние между центрами в два отверстия можно скорректировать с учетом потребностей эксперимента. Тем не менее, минимальное расстояние 2,5 см рекомендуется.

3. Передача саженцев на гидропонику и рост растений

  1. Аккуратно вытащите 5-дневную старую саженцу из вермикулита и немедленно перенесите в контейнер, наполненный водой в течение 30 мин. Этот шаг позволит удалить избыток вермикулита и смягчить оставшиеся перикарпы. Возникающий первичный корень должен быть виден.
  2. Удалите стены перикарпа вручную, если это необходимо для оптимизации будущего расширения котиледонов.
  3. Перенесите саженцы в держателях семян на полистирол пены поплавок. Выращивайте растения с интенсивностью света 140 фотон-м -2с-1,относительная влажность 65% и фотопериод 16 ч свет при 22 градусах Цельсия и 9 ч темной при 20 градусах Цельсия в течение 2 дней.

4. Препарат до начала лечения

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура предназначена для тестирования 20 химических веществ из небольшой библиотеки соединения в тройном, с 100 ММ ABA в 10 мМ MES-KOH (pH No 6.2) и 10 mM MES-KOH (pH No 6.2), содержащий 1% (v/v) диметилсульфод (DMSO) в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно.

  1. Убедитесь, что есть достаточно растений, готовых к обработке. Растения, готовые к лечению, должны быть достаточно зрелыми, чтобы иметь полностью развернутые котиледоны, но достаточно молодые, что боковое пролиферацию корней является минимальным. Для качественного скрининга необходимо 69 таких растений.
  2. Удалите 96-ну колодец, содержащий небольшие соединения из морозильной камеры -80 градусов. Оттепель при комнатной температуре.
  3. Подготовьте 80 мл 10 мМ буфера MES-KOH с поправкой на рН 6,2 с 1 М КНГ.
  4. Этикетка крышка менее 2 мл микротруб. Подготовьте не менее шести трубок для отрицательного контрольного лечения (10 мМ MES-KOH (pH No 6.2), содержащего 1% (v/v) DMSO). Используйте три трубки для лечения ABA (100 мкм ABA в 10 мМ MES-KOH pH 6.2), положительный контроль). Используйте оставшиеся 60 труб для анализа влияния 20 химических веществ в тройной.
  5. Передача 10 кЛ каждого химического вещества (10 мМ в DMSO) в каждую из трех надлежащим образом помечены трубки. Пипер 10 мМ ABA растворяется в ДМСО на три трубки и 10 Л DMSO в шесть контрольных труб.
    ВНИМАНИЕ: По своей природе, некоторые соединения могут вызвать серьезные последствия для здоровья и пользователи должны принять соответствующие защитные меры.
  6. Добавьте 990 кл. 10 мМ MES-KOH (pH 6.2) к каждой из 69 трубок. Распределите буфер MES с достаточной силой, чтобы смешать химическое вещество с буфером MES, но будьте очень осторожны, чтобы не использовать столько силы, что химические вещества и буфер МЧС шприц из трубки. Кроме того, вихрь на низкой скорости.

5. Настройка тепловизионной камеры

  1. Установите тепловизионную камеру на копировальную подставку. Подключите все кабели к ноутбуку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запись осуществляется в условиях температуры (от 20 до 25 градусов по Цельсию), влажности (от 50% до 70%) и качество света (от 110 до 140фотонсм -2с-1)аналогично тем, которые используются для выращивания растений.
  2. Включите камеру, затем ноутбук и откройте программное обеспечение для анализа тепловизионных изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последующие инструкции для записи применяются к конкретному программному обеспечению, используемому (см. Таблицу Материалов).
  3. Отрегулируйте настройки записи.
    1. Мышь над красной кнопкой записи в верхней части центрального окна. Появится меню выпадающих. Нажмите на настройкизначка гаечного ключа.
    2. Выберите подходящий режим записи и параметры. Запись периодически вариант, с одним кадром захватили в минуту и ручной остановки могут быть использованы. Обратите внимание на место назначения файлов, где программное обеспечение сохранит видео. Закройте окно настройки записи.

6. Подготовка и лечение растений

  1. Поместите колпачок-менее трубки, содержащие химические вещества в трубке стойки. Кроме того, лист пены полистирола можно вырезать и ткнул с дровяным инструментом горения, как описано в шаге 2.3, чтобы сделать пользовательский стойку трубки. Диаметр каждого отверстия должен быть очень близко к внешнему диаметру безкрышки труб для того, чтобы держать их твердо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поле зрения камеры является ограничивающим фактором, который должен быть принят во внимание при принятии решения о том, как крышка менее трубы будут проводиться на месте.
  2. Равномерно распределить положительные и отрицательные трубы управления, а также экспериментальные трубки в стеллажах для учета смещения17,связанного с положением.
  3. Подготовьте следующие материалы рядом с растениями, выращенными гидропонно: ножницы микрорассечения, мелководная тарелка с водой, тонкие салфетки, 69 колпачков, содержащих различные химические вещества.
  4. Повторите следующие шаги для каждого растения, которые будут обработаны. Росток подсолнечника всегда останется в держателе семян.
    1. Аккуратно поднимите держатель семян и быстро окуните корень в мелководной тарелке, содержащей воду.
    2. Вырезать основной корень под водой, чтобы предотвратить кавитации. Разрез должен произойти 0,8-1 см под наиболее базальный конец семенного держателя.
    3. Вложите свеженарежеваемый завод в одну из трубок, содержащих химические вещества.
    4. Если есть какие-либо капли воды на cotyledons, осторожно вымазать их сухой с деликатной задачей протрите.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти четыре шага должны быть сделаны как можно быстрее (10 минут или меньше), чтобы предотвратить несоответствия в исследовании кинетики.
  5. Переместите растения под тепловизионную камеру и убедитесь, что все растения находятся в поле зрения камеры. Отрегулируйте высоту камеры и положение стеллажей по мере необходимости.

7. Запись

  1. Сосредоточьте камеру на поверхности котледонов, нажав на Ctrl и Alt .
  2. Мышь над красной кнопкой и нажмите на кнопку Запись фильма. Должно открыться новое окно, подтверждающее запись.
  3. Остановите запись через 1-2 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.

8. Сбор данных

  1. Перейти к файлу Открыто (ru) Просмотр для правильного . Файл СЭЗ и откройте его.
  2. Прекрати играть в кино.
  3. На левой стороне основного окна нажмите на добавление индикатора измерения ROI (3x3 пикселей). РЕНТАБЕЛЬНОСТь инвестиций означает Регион интересов.
  4. Мышь над центром cotyledon первого растения и левый щелчок один раз. Курсор 1 в настоящее время на месте. Пометьте второй котиледон первого растения, повторяя процедуру. Следует отметить порядок этикеток.
  5. Повторите процедуру. Все растения должны быть помечены двумя курсорами.
  6. Нажмите на значок Edit ROIs. В главном окне, левый щелчок и удерживайте в левом верхнем углу и прокрутите в правый нижний угол, чтобы выбрать все ROIs.
  7. Мышь над значок статистического зрителя и выберите временный участок. Откроется новое окно.
  8. Выполнить фильм. График заполнят данные.
  9. В этом окне нажмите на двойную стрелку в правом верхнем углу, чтобы открыть новое меню.
  10. Нажмите на значок Сохранить. Сохранить как X и Y значения в сюжете (.csv). Закройте программное обеспечение после экспорта данных.

9. Анализ данных

  1. Откройте файл .csv с помощью программного обеспечения для анализа данных (например, Microsoft Excel). Обратите внимание, что три первых столбца (От C) предоставляют информацию о номере кадра, абсолютном времени и относительном времени. Остальные столбцы дают температуру каждой рентабельности инвестиций с течением времени.
  2. Принять решение о характере используемого статистического инструмента; это решение зависит от различных факторов, включая экспериментальный дизайн.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем примере стандартная оценка, или z-оценка, рассчитывается для каждой выборки на основе среднего демографического и отклонения населения. Для каждого образца p-значение рассчитывается из z-оценки. Этот метод позволяет дополнительно проверить положительный и отрицательный контроль, а также определить новые соединения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эксперимент с использованием красного красителя Эритрозин B (0,8 kDa) демонстрирует способность химических веществ, чтобы быть заметно поглощается через корень разреза в cotyledons саженца подсолнечника в течение 10 минут(рисунок 1).

Когда растения обрабатываются ABA, повышение температуры листьев обнаруживается в котиддонах подсолнечника в течение нескольких минут. Это повышение температуры листьев...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Количество соединений, которые могут быть протестированы в данный день, в основном зависит от i) экологически контролируемого пространства, доступного для выращивания растений и выполнения экрана, а также (ii) числа лиц, которые могут быть вовлечены в шестой шаг протокола. Мы рекомендуем использовать три экспериментальных репликатора для консолидации интерпретации результатов после статистического лечения. В обычный день, от одного до двух человек могут экран 60 соединений в триплицирует без затруднений, проверяя, наприм...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Работа была поддержана Помона колледж стартап фонды и Хирш исследований Инициация Гранты фонда (для FJ), а также Помона колледж молекулярной биологии программы через звездные летние исследования помощник программы (для KG).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1020 пластиковые лотки для выращивания без дренажных отверстийСтандартные лотки 10 x 20 дюймов
2,0 мл микропробирки, без колпачкаGenesee Scientific22-283NC
Абсцизовая кислота (ABA)Sigma-AldrichA1049
Воздушный насосActive AquaAAPA7,8L2 выхода, 3W, 7,8 л/мин
Airstones
Библиотека химических соединенийMicroSource Discovery NaturalProduct Collection
Creative Versa-Tool (инструмент для выжигания древесины)Nasco9724549
Диметилсульфоксид (ДМСО), проверенная культура растительных клетокSigma-AldrichD4540
Dwarf Sunspot Семена подсолнечникаOutsidepride.com
эритрозин BSigma-Aldrich200964
Набор гидропонных удобрений (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro)Общая гидропоникаGL51GH1421.31.11
Kimwipes Деликатные салфеткиKimberly-Clark Professional34155
НоутбукDell
MES гидратSigma-AldrichM2933
Микродиссекционные
Microsoft ExcelMicrosoft
Гидроксид калия (KOH)Sigma-AldrichP5958
ResearchIR Программное обеспечениеFLIR
R-Tech Жесткий пенополистирольный картонИнсульфопластовые
держатели семянAraponicsN/A
Super Tub (пластиковая универсальная ванна)MaccourtST3608Бак 36 x 24 x 8 дюймов, используемый для гидропоники
T450sc LWIR (длинноволновая инфракрасная) Ручная тепловизионная камераFLIRFLIR-T62101Поставляется с необходимым зарядным кабелем и USB-кабелем, необходимым для подключения к ноутбуку
Вермикулитовый
фильтр для водыSunSunHW-304B Pro Канистровый фильтр
ножницы

Ссылки

  1. Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
  2. McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
  3. Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant's Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
  4. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
  5. Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
  6. Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
  7. Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
  8. Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
  9. Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
  10. Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
  11. Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
  12. Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
  13. Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
  14. Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
  15. Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
  16. Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
  17. Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
  18. Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
  19. Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи