Методическая статья

Биочастицы Microarrays для хемотаксического и молекулярного анализа человека нейтрофил Роесь в пробирке

DOI:

10.3791/60544

⸱

16 февраля 2020 г.

 , 
1William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering, The Ohio State University, 2Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол генерирует биочастицы микроаррей, которые обеспечивают пространственно контролируемых нейтрофилов роятся. Он обеспечивает легкий доступ к посредникам, которые нейтрофилы высвобождают во время миграции, и позволяет проводить количественный анализ изображений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейтрофил роятся совместно процесс, с помощью которого нейтрофилы запечатать сайт инфекции и содействовать реорганизации тканей. Рой классически изучался в vivo в животных моделях, показывающих характерные закономерности миграции клеток. Однако модели in vivo имеют ряд ограничений, в ключая межклеточные посредники, которые трудно доступны и анализируют, а также неспособность непосредственно анализировать нейтрофилы человека. Из-за этих ограничений, существует необходимость в in vitro платформы, которая изучает роятся с человеческими нейтрофилов амии и обеспечивает легкий доступ к молекулярным сигналам, генерируемым во время роя. Здесь многоступенчатый процесс микроштамповки используется для генерации микроаря биочастиц, который стимулирует рой, имитируя инфекцию in vivo. Биочастица microarray индуцирует нейтрофилов роиться в контролируемой и стабильной образом. На микроарере нейтрофилы увеличивают скорость и образуют стабильные стаи вокруг скоплений биочастиц. Кроме того, был проанализирован супернатант, генерируемый нейтрофиловами, и было обнаружено, что 16 белков были дифференциально выражены в течение роя. Эта платформа in vitro роя облегчает прямой анализ миграции нейтрофилов и высвобождения белка воспроизводимым, пространственно контролируемым образом.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейтрофилы, наиболее распространенные белые кровяные клетки в крови1, приобретают внимание в качестве потенциальных диагностических и терапевтических целей2,3, потому что они могут быть вовлечены в различные медицинские условия, включая подагра4, сепсис3, травма5,рак1,7,8, и различные аутоиммунные заболевания5,9. Нейтрофил роятся многоступенчатый, жестко регулируется процесс со сложностью, что делает его особенно интересным фокусом исследования5,10,11. Во время роя, нейтрофилы изолируют участок воспаления от окружающих здоровыхтканей 5,10,11. Правильная регуляция нейтрофила роя имеет важное значение для содействия заживлению ран и в конечном счете, разрешение воспаления5,12. Нейтрофил роя в первую очередь изучался в vivo у грызунов12,13,14,15 и зебрафиш10,11,12,15 моделей. Тем не менее, характер этих моделей in vivo животных приводит к ограничениям5. Например, посредники, выпущенные нейтрофиловами во время роя, не так легко доступны для анализа5. Кроме того, Есть много потенциальных источников для данного посредника in vivo, так что эксперимент in vivo должен ввести генетический дефицит, чтобы ингибировать клеточного производства и / или взаимодействия для того, чтобы исследовать роль этого посредника в данном процессе13. Эксперимент in vitro обходит это осложнение, позволяя наблюдение за нейтрофилами без контекста дополнительных клеток. Кроме того, исследования, описывающие человека нейтрофил скоординированной миграцииограничено 16. На платформе витро роятся, человека нейтрофилов может быть непосредственно проанализированы. Платформа in vitro роя может расширить знания, полученные в результате исследований in vivo, предоставив возможности для заполнения пробелов, оставленных ограничениями исследований in vivo.

Для удовлетворения потребности в платформе in vitro, которая имитирует в ививо-нейтрофил роятся, мы разработали платформу микроштампов, которая позволяет нам узор биочастицы микроаррей, которые стимулируют нейтрофил роятся в пространственно контролируемым образом. Мы генерируем биочастицы микроаррей на стеклянных слайдах в двухэтапном процессе. Во-первых, мы используем микроштамповку для создания микроарра пятенного полиэлектролита (CP). Во-вторых, мы добавляем раствор биочастиц, которые придерживаются cp пятна через электростатическое взаимодействие. При первом узоре слое CP, мы можем выборочно шаблон отрицательно заряженных биочастиц для создания желаемого нейтрофила роя картины. Положительно заряженный слой удерживает отрицательно заряженные биочастицы через энергичную шаг стирки, которая удаляет биочастицы из областей на стеклянной горке, которые не имеют CP. Кроме того, CP используется здесь, кополимер акриламид и quaternized cationic мономер, является биосовместимым, так что это не вызывает реакцию от нейтрофилов. Он имеет очень высокий поверхностный заряд, который обездвиживает биочастицы размером с микрон к стеклянной горке, тем самым препятствуя нейтрофилу нейтрофилов удалять частицы из узорчатого положения на стеклянном слайде. Это приводит к биочастий кластеров, расположенных в microarray. Когда мы добавили нейтрофилов в микроаррей, они образовали стабильные стаи вокруг скоплений биочастиц. С помощью отслеживания миграции нейтрофилов мы обнаружили, что роятся нейтрофилы, активно мигрирующие в кластеры биочастиц. Кроме того, мы использовали эту платформу для анализа некоторых посредников, которые нейтрофилы высвобождают во время рояния. Мы нашли 16 посредников, которые дифферепрециально выражены во время роя. Их концентрации следуют трем общим тенденциям с течением времени: увеличение, уменьшение или всплеск. Наша платформа in vitro neutrophil swarming облегчает анализ пространственно контролируемого кишат нейтрофила, а также сбор и анализ посредников, выпущенных нейтрофилами. В предыдущей публикации, мы показали, что пациенты с определенными заболеваниями (травма, аутоиммунные заболевания и сепсис), были нейтрофилы, которые функционировали иначе, чем у здоровых доноров5. В будущих исследованиях, наша платформа может быть использована для анализа функции нейтрофилов среди различных популяций пациентов. Эта платформа может количественно проанализировать сложную координацию, связанную с нейтрофил роя. Дополнительные исследования могут быть сделаны, чтобы дать представление о нейтрофильной функции конкретной популяции пациентов или нейтрофил ответ на патоген, представляющий интерес.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают здоровых добровольцев, которые любезно сдали свою кровь. Образцы крови были получены после информированного согласия добровольцев в соответствии с протоколом институционального совета по обзору (IRB) #2018H0268 рассмотрены Комитетом по биомедицинским наукам при Университете штата Огайо.

1. Микрофабрикация биочастиц ымикроаря

  1. Используя стандартные фотолитографические процедуры, создайте мастер кремниевые пластины.
    1. Создайте доказательство желаемого дизайна с помощью компьютерного дизайна (CAD) программного обеспечения, а затем отправить в фотомаску производителя для производства хром фотомаски. Конструкция, используемая здесь, представляет собой 4 мм х 4 мм прямоугольные массивы диаметром 30 мкм, заполненные кругами с интервалом 150 мкм от центра к центру. Эта конструкция может быть изменена по желанию для различных приложений.
    2. Spincoat 40 м толщиной слой отрицательного фотоустойчивость на кремниевые пластины. Выпекать при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 5 мин и 95 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
    3. Выставлять на ультрафиолетовый свет через хромированную фотомаску со 150-160 мДж/см2 (рисунок 1А).
    4. Выпекать при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 5 мин и 95 градусов по Цельсию в течение 10 мин. Погрузить вафельу в фоторезистой разработчика в течение 10 минут и промыть изопропиловым спиртом. На этом этапе рисунок должен быть виден на вафельной(рисунок 1B).
  2. Тщательно смешать 10:1 соотношение полидиметилсилоксанпрея преполимера и его лечащий агент (т.е. 20 г преполимера и 2 г лечащий агент) и залить неизлечимых полидиметилсилоксан (PDMS) смесь над мастер в чашке Петри (Рисунок 1C).
  3. Вакуумная обработка неизлечимых pdMS смеси, пока не пузырьки воздуха присутствуют над мастер. Лечить при 65 градусах Цельсия на ночь.
  4. Используйте скальпель, чтобы разрезать вокруг внешней части узорной части пластины, и медленно удалить вылечить плиту PDMS. Поместите плиту PDMS на чистую разделочную доску с узорчатой стороной вверх(рисунок 1D).
  5. Выпукать отдельные марки из плиты PDMS с 8 мм биопсии удар(Рисунок 1E). Для одной стеклянной горки потребуется восемь марок.
  6. Поместите каждую марку лицом вниз на клеевую ленту, чтобы удалить любой мусор.
  7. Заранее приготовьте раствор CP в воду 1,6 мг/мл.
    1. Добавьте в воду необходимое количество порошка CP (например, от 0,8 г до 500 мл).
    2. Смешайте на перемешать пластины при комнатной температуре на ночь, или до тех пор, пока все твердые растворяется в воде. Раствор CP может храниться при комнатной температуре в течение 6 месяцев.
    3. При желании сделайте раствор CP флуоресцентным, добавив поли-L-лизин с маркировкой флуоресцеина изотиоцианата (PLL-FITC).
      1. Aliquot около 10 мл решения CP. Добавьте небольшое количество PLL-FITC (0,05 мг) к aliquoted объему. Сумма может быть изменена, чтобы настроить яркость флуоресценции по желанию.
      2. Vortex CP решение помечены FITC для 20 с, или пока решение единого, бледно-желтого цвета. Защитите от света и храните при 4 градусах По Цельсию до 1 месяца.
  8. С марками лицом вверх, премьер каждая марка с 100 л 1,6 мг /мл решение CP, обеспечивая отсутствие пузырьков воздуха форме между решением CP и штамп (Рисунок 1F).
  9. Перевернуть марки на слой решения CP(рисунок 1G).
  10. Удалите марки из решения CP после 1 ч.
  11. Dab каждый мокрый штамп лицом вниз на чистую стеклянную горку 6-8x, чтобы удалить лишнюю жидкость.
  12. Вакуумная обработка марок в течение 1-2 мин.
  13. Придерживайтесь восемь скважин, 9 мм диаметром изображения прокладка на верхней части чистого стекла слайд в качестве руководства для размещения штампа. С помощью этого прокладки, каждый стеклянный слайд может иметь восемь microarrays.
  14. Поместите штамп лицом вниз на стеклянную горку в центре каждого колодца прокладки изображения (т.е. используйте восемь марок всего).
  15. Поместите 5,6 и 0,1 г сбалансированного веса поверх каждой марки и позвольте 10 минут для штамповки(рисунок 1H). Сбалансированный вес необходим для обеспечения того, чтобы марка равномерно надавлялась на стеклянную горку и способствовала равномерному переносу CP на стеклянную горку.
  16. Удалите веси и марки со стеклянной горки(рисунок 1I). Разрешить CP слой высохнуть при комнатной температуре в течение 24 ч, прежде чем добавить биочастицы, как описано в шаге 1.17. Если CP помечен FITC, эффективность штамповки может быть проверена в этот момент с флуоресцентным микроскопом на 488 нм, прежде чем приступить к шагу 1.17(Рисунок 1M).
  17. Вырежьте пустую плиту PDMS до размера просмочонии изображения и используйте пунш биопсии 8 мм для того чтобы создать скважины в PDMS которые выравнивают с наилучшимобразом образом spacer изображения. Придерживайтесь плиты PDMS к стеклянной слайд с визуализации спейсер(Рисунок 1J).
  18. Оттепель раствор биочастиц (например, кишечной палочки или зимосана) и разбавить до 500 мкг/мл в воде для инъекций (WFI).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биочастицы не должны быть opsonized. Нейтрофильные поверхностные рецепторы непосредственно распознают молекулы на этих биочастицах19,20,21.
  19. Добавьте 100 л раствора биочастиц к каждому PDMS наилучшим образом на стекольке стекла(рисунок 1K).
  20. Раскачивай стеклянную горку в течение 30 минут.
  21. Тщательно промыть колодцы водой. Микроаррей биочастицы может храниться в свободной от пыли среде при 4 градусах Цельсия в течение 3 месяцев. На данный момент, картина должна быть проверена с флуоресцентным микроскопом на 594 нм, прежде чем приступить к шагу 2.1 (Рисунок 1N).

2. Подготовка образцов

  1. Соберите не менее 2 мл свежей крови в трубках K2-EDTA от желаемого донора. Ожидаемый выход нейтрофилов составляет 1-2 х 106 клеток/1 мл цельной крови. Анализ изображения требует примерно 1,5 х 10 5 нейтрофилов, а анализ супернатанта требует 1 х 106 нейтрофилов. Используйте кровь в течение 4 ч.
  2. Отделите эритроциты (RBCs) путем добавления агента агрегации эритроцитов в соотношении 1:5 ко всей крови. Подождите 45 минут для полупрозрачного слоя (буффи пальто), чтобы отделитьот от слоя РБК.
  3. Снимите буйный слой и промойте фосфат буферным сольниковым раствором (PBS) с помощью 1 мл шубной шерсти: 9 мл PBS.
  4. Центрифуга в течение 5 мин при 190 х г и 20 градусов по Цельсию.
  5. Приготовьте супернатант и отдохните гранулы на 5 х 107 клеток/мл.
  6. Используйте отрицательный набор иммуномагнитного отбора для изоляции нейтрофилов.
    1. Добавьте 50 зл антител, коктейль ный коктейль/1 мл клеточной подвески. Подождите 10 минут.
    2. Добавьте 100 зл магнитных бусин/1 мл клеточной подвески. Подождите 10 минут.
    3. Добавьте суспензию в трубку с круглым дном и поместите в цилиндрический магнит. Подождите 10 минут.
  7. Налейте супернатант в центрифуги трубки. Добавьте до 10 мл PBS. Центрифуга в течение 5 мин при 190 х г и 20 градусов по Цельсию.
  8. Аспирсупернатан. Отдохните белые гранулы в IMDM с 0,4% человеческого сыворотки альбумина.
  9. Ядра пятна с 20 мкг/мл Hoechst 33342 для 10 мин при 37 градусах По Цельсия.
  10. Добавьте 5 мл IMDM с 0,4% человеческого сывороточного альбумина для промывки. Центрифуга в течение 5 мин при 190 х г и 20 градусов по Цельсию.
  11. Resuspend клетки на 7,5 х 105 клеток / мл в IMDM с 0,4% человека сыворотки альбумина.
  12. Добавьте 100 зЛ клеточной суспензии в PDMS, содержащий биочастицу микроаррей. Убедитесь, что суспензия ячейки выпуклой поверх PDMS хорошо и не содержит пузырьков.
  13. Печать с крышкой диаметром 12 мм. Обложка открытия PDMS хорошо с 12 мм диаметром coverslip. Нажмите вниз осторожно на крышку с помощью пинцета, чтобы избыток подвески ячейки ускользает к краю колодца. Используйте ткань для удаления избыточной клеточной суспензии.

3. Проведение анализа и анализа изображений

  1. Загрузите массив микрочастиц с клетками на станции визуализации живых клеток с микроскопом, оснащенным инкубатором клетки, установленным до 37 градусов по Цельсию, 5% CO2и 90% относительной влажности.
  2. Используйте флуоресцентные и яркие микроскопии для записи изображений при 10-кратном увеличении каждые 10 с при 405 нм, 594 нм и ярком поле. В типичном эксперименте изображения собираются до 2 ч.
  3. Используйте автоматизированное программное обеспечение для отслеживания клеток для отслеживания миграции отдельных нейтрофилов к скоплению биочастиц.
    1. Используйте режим автоматической регрессии программного обеспечения для отслеживания ячейки обнаружения пятен. Установите радиус пятна до 5 мкм (приблизительный размер ядра нейтрофила). Установите минимальную длину трека до 120 с и максимальный размер зазора одного кадра.
    2. Из данных, генерируемых программным обеспечением для отслеживания клеток, извлекайте файлы, содержащие положение и скорость нейтрофилов. Эти файлы могут быть использованы с графиком программного обеспечения для генерации нейтрофилов миграционных треков(рисунок 2C) и тепловой карты скорости по сравнению с временем(рисунок 2D), соответственно.
  4. Используйте 405 нм флуоресцентные изображения для отслеживания размера роя с течением времени на программное обеспечение анализа изображений по вашему выбору.
    1. Определите области, представляющие интерес (ROIs) вокруг каждого кластера биочастиц, где будут роиться нейтрофилы. Держите тот же размер рентабельности инвестиций для анализа каждого кластера биочастиц.
    2. Проанализируйте средняя интенсивность флуоресцентных изображений 405 нм в пределах каждой рентабельности инвестиций с течением времени.
    3. Создайте кривую калибровки средней интенсивности флуоресцентного до размера роя, принимая ручные измерения на различных размерах роя от 0 мкм2 до максимального размера роя. Используйте эту калибровку, чтобы вычислить размер роя с течением времени.

4. Сбор супернатантов и обнаружение белка

  1. Инкубировать нейтрофилов в скважинах, содержащих биочастицы микроаррей на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 на 3 ч. Возьмите пробы в нужных временных точках. Как правило, пробы берутся при 0, 0,5, 1 и 3 ч. Чтобы преодолеть предел обнаружения протеинового массива, для каждой временной точки использовался весь объем супернатанта одного колодца (200 л). Каждый раз точка анализировалась в тройном.
  2. Используя яркий микроскоп, убедитесь, что стаи образуются на микроарле.
  3. Приготовьте супернатант с 200-мл пипеткой и загрузите в 0,45 мкм центрифуги фильтра трубки.
  4. Centrifuge супернатант на 190 х г и 20 градусов по Цельсию в течение 5 минут и собирать фильтрованный объем.
  5. Храните образцы при -80 градусах по Цельсию до времени обработки.
  6. Используйте набор microarray, который обнаруживает ряд человеческих белков для обработки образцов.
    1. Добавьте 200 л каждого образца в отдельную диализную трубку с комплектом.
    2. Поместите диализные трубки в стакан, содержащий не менее 500 мл PBS (pH 8.0). Аккуратно перемешайте на тарелке перемешать, по крайней мере 3 ч при 4 градусах Цельсия. Измените PBS в стакане и повторите этот шаг.
    3. Перенесите каждый образец в чистую центрифугу и центрифугу при 9000 х г в течение 5 мин, чтобы удалить все осадки. Перенесите каждый супернатант на чистую трубку.
    4. Биотинилат каждый образец, добавляя 36 юртей 1x маркировки реагента из комплекта на 1 мг общего белка в диализированном образце до 180 л диализированного образца. Инкубировать при 20 градусах по Цельсию в течение 30 мин. Смешайте осторожно каждые 5 минут.
    5. Добавьте в каждый образец трубки 3 злиста стоп-решения, снабженного комплектом. Перенесите каждый образец на свежую диализную трубку и повторите шаги 4.6.2-4.6.3. На этом этапе образец может храниться при -20 градусах или -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока вы не будете готовы к продолжению.
    6. Стеклянная горка с комплектом хранится при -20 градусах Цельсия. Разрешить ему прийти к комнатной температуре. Поместите собранную стеклянную горку в ламинарный капот потока на 1-2 ч при комнатной температуре.
    7. Добавьте 400 qL блокирующего буфера с комплектом в каждую скважину собранного стеклянного слайда. Инкубировать при комнатной температуре 30 мин.
    8. Centrifuge подготовленные образцы в течение 5 мин на 9000 х г, чтобы удалить осадки или частицы. Разбавить 5x блокирующим буфером.
    9. Удалите блокирующий буфер из каждого колодца. Добавьте 400 л разбавленных образцов в соответствующие скважины. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре во время раскачивания.
    10. Декант образцы из каждой скважины. Вымойте 3x с 800 л из 1x мыть буфера я предоставил комплект при комнатной температуре в течение 5 минут каждый в то время как качание.
    11. В чистом контейнере, погрузить собранное стекло слайд в 1x мыть буфер I. Вымойте 2x при комнатной температуре в течение 5 минут каждый во время качания.
    12. Добавьте 400 л из 1x Cy3-конъюгированного стрептавидина к каждому подмассиву. Накрыть пластиковыми клейки полосками. Защитите от света на оставшуюся часть протокола.
    13. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре во время раскачивания.
    14. Оснастить раствор и разобрать стеклянную горку из образцовых камер.
    15. В 30 мл центрифуги трубки с комплектом, тщательно добавить стеклянный слайд и достаточно 1x мыть буфер i для покрытия стеклянной слайд. Вымойте 3x для 10 минут каждый при комнатной температуре во время качания.
    16. В 30 мл центрифуги трубки, мыть 2x с 1x мыть буфер II в течение 5 минут каждый при комнатной температуре во время качания.
    17. Вымойте стеклянную горку с 30 мл ddH2O в течение 5 мин. Снимите стеклянную горку из центрифуги трубки и дайте высохнуть в течение 20 минут в ламинарном капоте. Подготовленная стеклянная горка может храниться при -20 градусов до готовности к сканированию.
    18. Сканирование стеклянной горки с помощью сканера микроаррей при флуоресценции 555 нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Когда нейтрофилы добавляются в микроаррей биочастиц, нейтрофилы, которые контактируют с скоплениями биочастиц, активируются и инициируют реакцию роятся. Биочастица microarray была проверена с помощью замедленного флуоресцентной микроскопии для отслеживания миграции нейтрофилов к скоплениям биочастиц(Видео S1). Миграция отдельных ядер нейтрофилов отслеживается по мере их миграции в скопление биочастиц. Когда нейтрофилы достигают скопления биочастиц, их ядра пересекаются с другими ядрами в кластере. Таким ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы разработали платформу микроштамповки для генерации однородных массивов биочастиц для стимулирования роятся в пробирке нейтрофила. In vitro характер нашей платформы позволяет нам обойти осложнения, которые возникают с in vivo роятся эксперименты, а именно плохая способность анализировать посредников освобождены роятся нейтрофилов5. Кроме того, модели in vivo обычно выполняются у грызунов11,12,13,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана финансированием со стороны Уильяма Г. Лоури Департамента химической и биомолекулярной инженерии и Всеобъемлющего онкологического центра в Университете штата Огайо. Данные, представленные в этом докладе, были получены из изображений, обработанных с помощью Imaris x64 (ver. 9.3.0 Bitplane), доступных в Campus Microscopy and Imaging Facility, Университет штата Огайо. Этот объект поддерживается частично грантом P30 CA016058, Национальным институтом рака, Bethesda, MD.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
"The Big Easy" EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18001Магнит для использования с набором для выделения нейтрофилов
Клеточный инкубаторOkolab777057437/77057343Okolab cage инкубатор для контроля температуры и CO2
EasySep Набор для выделения нейтрофилов человекаSTEMCELL Technologies17957Набор для иммуномагнитного негативного отбора нейтрофилов человека
Eclipse Ti2Nikon InstrumentsMEA54010/MEF55037Инвертированный исследовательский микроскоп
Escherichia coli (штамм K-12) BioParticles Texas Red конъюгатInvitrogenE2863Порошок биочастиц, растворяемый в воде перед добавлением в массив Zetag®
Harris Uni-Core 8-мм биопсийный перфораторSigma AldrichZ708925Для резки штампов PDMS
HetaSepSTEMCELL Technologies7906Агент агрегации эритроцитов для отделения охристой шерсти от эритроцитов в свежей крови человека
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570Nucleus флуоресцентный краситель
Human L1000 ArrayRaybiotech Inc.AAH-BLG-1000-4Матрица высокой плотности для детектирования 1000 белков человека
Сывороточный альбумин человека (HSA)Sigma AldrichA5843Низкий уровень эндотоксина HSA, для приготовления 2 % растворов в IMDM для выделенных нейтрофилов
Модифицированная среда Dulbeccos' Iscove (IMDM)Thermo Fisher Scientific12440053Для ресуспендирования изолированных нейтрофилов
K2-EDTA трубкиThermo Fisher Scientific02-657-32Пробирки для забора крови
Низкоотражающая хромированная фотомаскаПередний диапазон ФотомаскаН/ДРазмеры 5" x 5" x 0,09" (Д x Ш x Г)
Микрочип СканерPerkin ElmerASCNGX00Флуоресцентный считыватель белковых структурированных микродоменов
Микроскопия изображений Программное обеспечение для анализа анализа изображений - ImarisBitplane9.3.0Программное обеспечение для автоматического анализа
отслеживания клетокNiS Elements Advanced Research Software PackageInstrumentsMQS31100Программное обеспечение для автоматической визуализации живых клеток и расчета размера роя
Поли-L-лизин флуоресцеин изотиоцианат (PLL-FITC)Sigma AldrichP3069-10MG30 000 - 70 000 МВт ФАПЧ, меченный FITC, используется для флуоресцентного маркирования CP раствора
SecureSeal 8-луночный спейсер для визуализацииGrace Bio-Labs6540088-луночный, диаметр 9 мм, адгезивная прокладка для визуализации
Silicon WaferWafer590Silicon 100 мм N/P (100) 0- 100 Ом-см 500 μ m SSP тест
Spin CoaterLaurellWS-650MZ-23NPPBИспользуется для нанесения прядильного покрытия 40-&микро; m слой фоторезиста на кремниевой пластине
SU-8 2025MicroChem2025Негативный фоторезист для изготовления кремниевой мастер-пластины
SU-8 ПроявительMicroChemY020100проявитель фоторезиста. Удалить несшитую СУ-8 2025 из силиконовой пластины
Sylgard 184 (полидиметилсилоксан, PDMS)Dow16739212-х компонентный набор силиконовых эластомеров для изготовления микроштампов и колодцев PDMS
Система маскировки ультрафиолетового излученияKloéUV-KUB 2Используется для сшивания фоторезиста на кремниевой пластине через хромированную маску с ультрафиолетовым излучением
ВодаThermo Fisher ScientificA1287303Высококачественная вода для разбавления биочастиц
Zetag 8185BASF8185Катионный полиэлектролит (CP), порошок, сополимер акриламида и кватернизированный катионный мономер, образует «чернильный раствор» для микроштамповки при растворении в воде
Zymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red конъюгатInvitrogenZ2843Порошок биочастиц, растворить в воде перед добавлением в массив Zetag
Nikon University

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
  2. Jones, C. N., et al. Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-6 (2014).
  3. Ellett, F., et al. Diagnosis of sepsis from a drop of blood by measurement of spontaneous neutrophil motility in a microfluidic assay. Nature Biomedical Engineering. 2, 207-214 (2018).
  4. Malawista, S. E., Chevance de Boisfleury, A., Naccache, P. H. Inflammatory Gout: Observations over a Half-Century. The FASEB Journal. 25 (12), 4073-4078 (2011).
  5. Reátegui, E., et al. Microscale arrays for the profiling of start and stop signals coordinating human-neutrophil swarming. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-12 (2017).
  6. Morgan, A. S. Risk factors for infection in the trauma patient. Journal of the National Medical Association. 84 (12), 1019-1023 (1992).
  7. Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. 566, 553-557 (2019).
  8. Treffers, L. W., Hiemstra, I. H., Kuijpers, T. W., van den Berg, T. K., Matlung, H. L. Neutrophils in cancer. Immunological Reviews. 273, 312-328 (2016).
  9. Grayson, P. C., Kaplan, M. J. At the Bench: Neutrophil extracellular traps (NETs) highlight novel aspects of innate immune system involvement in autoimmune diseases. Journal of Leukocyte Biology. 99 (2), 253-264 (2016).
  10. Lämmermann, T. In the eye of the neutrophil swarm--navigation signals that bring neutrophils together in inflamed and infected tissues. Journal of Leukocyte Biology. 100 (1), 55-63 (2016).
  11. Kienle, K., Lämmermann, T. Neutrophil swarming: an essential process of the neutrophil tissue response. Immunological Reviews. 273 (1), 76-93 (2016).
  12. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
  13. Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  14. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  15. Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
  16. Lämmermann, T. Cell migration: Arraying neutrophils in swarms. Nature Biomedical Engineering. 1 (7), 1-2 (2017).
  17. Powell, D. R., Huttenlocher, A. Neutrophils in the Tumor Microenvironment. Trends in Immunology. 37 (1), 41-52 (2016).
  18. Uribe-querol, E., Rosales, C. Neutrophils in Cancer: Two Sides of the Same Coin. Journal of Immunology Research. 2015, (2015).
  19. Underhill, D. M., Ozinsky, A. Toll-like receptors: Key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology. 14 (1), 103-110 (2002).
  20. Netea, M. G., Van Der Meer, J. W., Kullberg, B. J. Recognition of fungal pathogens by toll-like receptors. Immunology of Fungal Infections. , 259-272 (2007).
  21. Thomas, C. J., Schroder, K. Pattern recognition receptor function in neutrophils. Trends in Immunology. 34 (7), 317-328 (2013).
  22. Prince, L. R., Whyte, M. K., Sabroe, I., Parker, L. C. The role of TLRs in neutrophil activation. Current Opinion in Pharmacology. 11 (4), 397-403 (2011).
  23. Tan, S. Y., Weninger, W. Neutrophil migration in inflammation: intercellular signal relay and crosstalk. Current Opinion in Immunology. 44, 34-42 (2017).
  24. Menezes, G. B., Rezende, R. M., Pereira-Silva, P. E. M., Klein, A., Cara, D. C., Francischi, J. N. Differential involvement of cyclooxygenase isoforms in neutrophil migration in vivo and in vitro. European Journal of Pharmacology. 598 (1-3), 118-122 (2008).
  25. Afonso, P. V., et al. LTB4 Is a Signal-Relay Molecule during Neutrophil Chemotaxis. Developmental Cell. 22 (5), 1079-1091 (2012).
  26. Gounni, A. S., et al. In Vivo Regulates Neutrophil Migration In Vitro and Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Chemorepellent Semaphorin 3E Negatively Regulates Neutrophil Migration In Vitro and In Vivo. The Journal of Immunology. 198, 1023-1033 (2017).
  27. Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. Galectin-3: An open-ended story. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).
  28. Padmanabhan Iyer, R., et al. Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart. Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitro

Похожие статьи