Методическая статья

Анализ перемещения миокардной механической деформации (DIAMOND) показывает сегментную гетерогенность сердечной функции у эмбриональных зебрафиш

4.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60547

⸱

6 февраля 2020 г.

 , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California, Los Angeles, 2Ronald Reagan UCLA Medical Center, 3Veterans Affairs West Los Angeles Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Целью данного протокола является детальный новый метод оценки сегментальной сердечной функции у эмбриональных зебры как в физиологических, так и в патологических условиях.

Аннотация

Зебрафиш все чаще используется в качестве образцового организма для кардиомиопатий и регенерации. Современные методы оценки сердечной функции не могут надежно обнаружить сегментающую механику и не всегда осуществимы у зебры. Здесь мы представляем полуавтоматический метод количественной оценки четырехмерной (4D) сегментальной сердечной функции: анализ смещения механической деформации миокарда (DIAMOND). Трансгенные эмбриональные зебры были изображены в vivo с помощью световой лист флуоресценции микроскопии системы с 4D синхронизации движения сердца. Приобретенные 3D цифровые сердца были реконструированы в конце систолы и конца диастолы, и желудочек был вручную сегментирован в двоичные наборы данных. Затем сердце было переориентировано и изотропно переопределилось вдоль истинной короткой оси, и желудочек был равномерно разделен на восемь частей (I-VIII) вдоль короткой оси. Из-за различных самолетов и матриц в конце систолы и конца диастолы, матрицы преобразования была применена для регистрации изображения для восстановления первоначальной пространственной связи между resampled систолических и диастолических матриц изображений. После регистрации изображений вектор смещения каждого сегмента от конечной систолы к конечной диастоле был рассчитан на основе смещения массовых центроидов в трех измерениях (3D). DIAMOND показывает, что базальные сегменты миокарда, прилегающие к атриовентрикулярному каналу, подвергаются самой высокой механической деформации и наиболее восприимчивы к сердечной травме, вызванной доксорубицином. В целом, DIAMOND предоставляет новые идеи в сегментальной сердечной механики в эмбрионах зебры за пределами традиционной фракции выброса (EF) в физиологических и патологических условиях.

Введение

Химиотерапия индуцированной сердечной токсичности и последующей сердечной недостаточности являются одной из основных причин прекращения химиотерапии1. Поэтому сердечная функциональная оценка играет решающую роль в выявлении токсичности сердца и, что более важно, в прогнозировании ранней сердечной травмы после химиотерапии2. Тем не менее, современные подходы к сердечной функциональной оценке сталкиваются с ограничениями. Такие методы, как левая фракция выброса желудочков (LVEF) обеспечивают только глобальную и часто задержку сердечной механики после травмы3,4. Ткань Доплера изображения обеспечивает сегментную информацию деформации миокарда, но страдает от значительной intraobserver и interobserver изменчивость, отчасти из-за ультразвукового луча угол зависимость5. Двухмерное (2D) слежение за пятнышком использует B-режим эхокардиографии, который теоретически устраняет зависимость от угла, но его точность ограничена движением вне плоскости6. Поэтому не хватает строгого подхода к количественной оценке сегментальной сердечной функции как в научных исследованиях, так и в клинических условиях.

В этом контексте мы разработали 4D метод количественной оценки для анализа сегментальной сердечной функции, который мы назвали анализом смещения миокарда механической деформации (DIAMOND), чтобы определить переносчики смещения миокардных масс центроидов в 3D пространстве. Мы применили DIAMOND для оценки in vivo сердечной функции и доксорубицина индуцированной сердечной токсичности с зебрафишами(Danio rerio) в качестве модели животных, выбранных из-за их регенерации миокарда и высоко консервированных генов развития7. Мы также сравнили сегментарное смещение DIAMOND с определением глобальной фракции выброса (EF) и 2D-напряжением после лечения доксорубицином. Интегрируя смещение DIAMOND с 4D световой лист флуоресцентной микроскопии (LSFM) приобретенные визуализации эмбриональных сердец зебры, DIAMOND показывает, что базальные сегменты миокарда, прилегающих к атриовентрикулярного канала проходят самую высокую механическую деформацию и являются наиболее восприимчивыми к острой доксорубицин сердечной травмы8.

   

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены UCLA Институциональный комитет по уходу за животными и использования (IACUC), и эксперименты были проведены в соответствии с протоколами, утвержденными UCLA Управления по исследованию животных.

1. Разведение Tg (cmlc2:mCherry) зебры и сбор эмбрионов

  1. Следуйте процедурам жилищного строительства, размножения и эмбрионов, как описано в ранее установившейся практике ведения домашнего хозяйства и размножения. Для получения подробной информации, см Messerschmidt et al.9.
  2. Лечить собранные эмбрионы с 0,003% 1-фенил-2-тиуреа (PTU) в E3 среднего 18 h послеоплодизации для поддержания прозрачности эмбрионов для визуализации LSFM.

2. Доксорубицин лечение, чтобы вызвать сердечную травму

  1. В течение 3 дней послеферородации (dpf) лечить эмбрионы доксорубицином в концентрации 10 мкм в рыбной водной среде E3. После лечения 24 ч до 4 dpf, заменить доксорубицин среды со свежим E3 среды.
    ВНИМАНИЕ: Доксорубицин является химиотерапией лекарства. Требуется соответствующее оборудование для индивидуальной защиты (СИЗ), и отходы должны быть утилизированы в контейнерах для биологически опасных отходов.

3. Модуляция пути Ноч

  1. Лечить эмбрионы зебры с ингибитором пути Notch (2S)-N-(3,5-дифторенил)ацетил-L-аланил-2-фенилглицин 1,1-диметилэтил эстер (DAPT) при концентрации 10 мкм в рыбной средней воде E3 от 3-6 dpf.
  2. Микроинъекция Notch вниз по течению эффекторов Notch внутриклеточного домена (NICD) и Neuregulin-1 (Nrg-1) мРНК в концентрациях 10 пг/ нл и 5 пг/нл, соответственно, в 1-клеточный этап эмбрионов зебры8,10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микроинъекция выполняется под микроскопом с поддержкой воздушного насоса для точного контроля объема впрыскиваемых. Микроинъекция мРНК в клетку делается, когда оплодотворенная яйцеклетка находится на первой стадии клеток. Для получения подробной информации о подготовке и последовательности мРНК, см. Чэнь и др.8. Для получения подробной информации о микроинъекции и подготовки инъекционных игл, см. Розен и др.10.

4. Синхронизация изображений и пост-изображений

  1. Для методов визуализации LSFM и алгоритма синхронизации пост-изображения смотрите подробности в предыдущих публикациях9,11.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кратко, наша система использует непрерывно-волновой лазер как источник освещения для изображения всех трансгенных линий зебры. Модуль обнаружения состоит из двух научных дополнительных полупроводниковых полупроводниковых металлооксидных (sCMOS) камер и двух наборов фильтров для двухканальной визуализации. Модуль обнаружения перпендикулярно устанавливается на плоскость освещения. Каждый кадр LSFM приобретается в течение 20 мсек времени экспозиции, в то время как разрешающая мощность в поперечном сечении составляет 0,65 мкм, а размер шага между последовательными кадрами составляет 2 мкм. Лазер 589 нм был использован для возбуждения флуоресцентных сигналов mCherry.

5. Реконструкция 3D систолического и диастолического сердца

  1. Откройте папку, созданную алгоритмом синхронизации сообщений, а затем откройте папку«Выход». Выберите среднюю плоскость сердца и загрузите всю папку в ImageJ. Найдите первую диастолическую и систолическую фазы и запишите номер кадра.
  2. Откройте папку "Выход/по штату" и найдите папки с теми же числами, что и только что записанные номера кадра. Преобразуйте изображения в папке в 3D TIFF (помеченный формат файла изображения) и назовите их "diastole.tif" и "systole.tif".

6. Сегментация желудочка

  1. Откройте программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу Материалов). Нажмите файл (ru) Открытые данныеи загрузка "diastole.tif" и "systole.tif". Введите размер вокселя в соответствии с настройками изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для используемой системы LSFM, типичный размер вокселя составляет 0,65 мкм х 0,65 мкм х 2 мкм.
  2. Нажмите на панель"SEGMENTATION"и вручную отсегментируйте желудочковую часть сердца. Встроенный инструмент"Порог",который может выбрать все регионы выше определенной интенсивности, может облегчить этот процесс. Желудочек является более толстой камерой с более сильной флуоресценцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы удалить атриовентрикулярный канал и отток тракта в сегментированном желудочке, потому что это влияет на анализ смещения.
  3. После того, как сегментация будет сделана, щелкните панель«Проект». Правый щелкните"диастоле. Labels.tif" и "systole. Labels.tif" вкладки в консоли и нажмите "Экспортные данные как" для сохранения данных, как 3D TIFF файлов.

7. Создание прямоугольных параллелепипедов для регистрации изображений

  1. Запуск "prepImage_1.м"в среде программирования (см. Таблица материалов). Откройте "prepImage_1.m",ImPath" в строке 5, так что папка содержит исходные и сегментированные файлы TIFF, и измените "срез" в строке 4 на количество срезов 3D файлов tif.
  2. После запуска кода он будет генерировать пять новых 3D-файлов TIFF ("test.tif", "diastole_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif" и "sysLabel200.tif"), а также две новые папки ("resample_dia" и "resample_sys").

8. Систолическое систолическое и диастолическое 3D сердца вдоль короткой плоскости оси

  1. Импортировать все пять 3D файлов TIFF в программное обеспечение анализа изображения (см. Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер вокселя остается неизменным.
  2. Перейти к панели MULTIPLANAR. Выберите "diastole_200.tif" в качестве основных данных. Выровнять X-оси (зеленая линия в плоскости XY) с вертикальной длинной оси желудочка, и выровнять оси (красная линия в плоскости Y ' с горизонтальной длинной оси желудочка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вертикальная длинная ось определяется поиском самой длинной оси, соединяющей вершину и участок оттока в плоскости XY, а горизонтальная длинная ось определяется поиском самой длинной оси, соединяющей вершину и участок оттока в плоскости Y. Поверните ось, поместив курсор в конце оси.
  3. Выберите три случайные точки из косой плоскости Y ' (короткая плоскость оси) в против часовой стрелке образом и запишите их 3D координаты положения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что точки выбраны против часовой стрелки.
  4. Повторите шаги 8.2 и 8.3 для "systole_200.tif".
  5. Нажмите на панель"PROJECT". Создайте объект"Slice"для "diastole_200.tif", нажав на "diastole_200.tif" и ища объект"Slice". Слева щелкните только что созданный объект Slice, а в панели свойств (ru) Варианты, проверить "Установить плоскость" и выбрать три точки в "Самолет Определение". Введите координаты трех точек со ступени 7.3.
  6. Повторите шаг 8.5 для "systole_200.tif".
    ПРИМЕЧАНИЕ: Созданный объект среза должен иметь название «Slice 2».
  7. Нажмите кнопку "diastole_200.tif" и ищите"Преобразованное изображение"и создайте объект. В панели Свойств, выберите "Slice" как "Справка" и нажмите Применить. Это должно создать объект под названием"diastole_200.преобразованы".
  8. Правый щелчок "diastole_200.преобразованный" и поиск "Resample" и создать объект. Выберите "Voxel Size" в качестве "Mode" и измените "Voxel Size", чтобы быть х 1, y no 1 и z 1 в панели свойств.
  9. Нажмите "Применить". Это должно создать объект под названием"diastole_200.resampled". Нажмите кнопку "diastole_200.resampled" и сохраните его в виде файла 3D TIFF.
  10. Повторите один и тот же шаг для "diaLabel.tif" и "test.tif". Сохранить "diaLabel.resampled" и "test.resampled" в виде 3D файлов TIFF. Повторите тот же шаг для "systole_200.tif", "sysLabel.tif" и "test.tif" с помощью"Slice 2"в качестве эталона, и сохраните "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" и "test2.resampled" как файлы 3D TIFF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в этом шаге сохранено в общей сложности шесть файлов TIFF.

9. Разделение перевыборы сердца

  1. Импортируйте все шесть перевыборных файлов со шага 8 в ImageJ. Выберите кусочек "systole_200.resampled", в котором атриовентрикулярный канал четко визуализирован. Запишите номер среза.
    1. Используйте«Изображение» Преобразование Поверните"функцию ImageJ так, что атриовентрикулярный канал вертикальный. Примените одно и то же вращение ко всем файлам. Закройте все окна и сохраните все изменения.
    2. Переместите "diastole_200.resampled", "diaLabel.resampled" и "test.resampled" в папку "resample_dia" и переместите "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" и "test2.resampled" в папку "resample_sys".
  2. Открыть "divider_2_8_pieces.м." Изменение "ImPath" в строке 5 и "ImPath" в строке 395 в каталог изображений. Измените переменную"Средний"в строке 22 и линии 411 на срезные числа, где атриовентрикулярный канал четко визуализирован в "systole_200.resampled" и "diastole_200.resampled".
  3. Выполнить код, и в подсказанные окна нажмите один раз в центре желудочка и нажмите один раз в центре атриовентрикулярного канала. Это должно быть сделано дважды для систолы и диастолы изображений.

10. Регистрация систолических и диастолических изображений матриц

  1. Откройте "register_3.м" и измените"ImPath"в строке 4 на путь папки изображений. Запуск этого кода может занять 5–20 минут в зависимости от вычислительной мощности системы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Искусственно созданные прямоугольные параллелепипеды в шаге 7 используются для 3D жесткой регистрации, которая сохраняет расстояние между двумя точками и углами, подписанными на три точки. Когда конце-диастол прямоугольный parallelepiped (красный) регистрируется в конце систолы прямоугольный parallelepiped (зеленый), последующий дискреточный 3D местоположение позволяет производные уникальной матрицы жесткой трансформации, состоящей из вращения и перевода из конечной диастолы матрицы в конце систолы матрицы(рисунок 1H). Мы выполняем регистрацию и упорядочивание минимизации энергии, чтобы дешумировать матрицу после преобразования с помощью инструментария обработки изображений (см. Таблица Материалов). Для подробного математического описания, пожалуйста, см Чэнь и др.8.

11. Выход переносчиков перемещения

  1. Откройте "displacement_4.m"и измените "ImPath" в строке 4 на путь папки изображений.
  2. Выполнить "displacement_4.m", который генерирует "vector8.txt" файл в папке "векторы". После того, как файл "vector8.txt" будет открыт, будет 8 х 4 матрицы. Каждая строка матрицы имеет четыре числа, которые представляют собой величину компонента X, компонента Y, компонента И и величину SUM переносителя переносицы определенного сегмента желудочка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вектор смещения получен путем расчета смещения массового центроида каждого сегмента в 3D пространстве. Мы вычисляем 3D масс-центр (PS и PD) figure-protocol-1 координаты (где k указывает X, Y, или координат, соответственно) каждого сегмента (I-VI) в наборе данных сегментации от систолы до диастолы(рисунок 1J). Массовый центроид figure-protocol-2 в 3D пространстве мы определяем следующим образом:
    figure-protocol-3
    где Cх х, Cy y, и Cz , Mi - масса каждого сегмента (я и VI), м - количество вокселей каждого сегмента, и функция плотности, как сегментированная область составляет 1, в то время как остальное 0. L2-норма переносители субперемещения вдоль X-, Y-, и й-осей и вектор смещения суммы рассчитываются во время сердечного цикла. В матрице в общей сложности восемь рядов. Первый ряд и восьмой ряд содержат атриовентрикулярный канал и, таким образом, игнорируются в нашем анализе. Сегменты I к VI представлены вторым рядом на седьмой строке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Процесс, с помощью которого DIAMOND был разработан для оценки 3D сегментальной сердечной функции, представлен на рисунке 1. После lsFM изображение приобретения и реконструкции в 3D эмбрионального сердца зебры (Рисунок 1A), истинная короткая ось плоскости была определена как плоскость перпендикулярно вертикальным и горизонтальным длинным осям, оба из которых определяются в многоплановой зритель(Рисунок 1B

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Строгая стратегия для количественной оценки сегментальной функции миокарда имеет решающее значение для оценки сердечной механики за пределами традиционных EF, как известно, нечувствительным и задержкой индикатор травмы миокарда1,4,12. Таким образом, наблюдается растущий интерес к маркерам ранних изменений миокарда, и растущее тело литературы поддерживает параметры деформации миокарда в качестве раннего индикатора для прогнозиров...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявили, что никакого конфликта интересов не существует.

Благодарности

Нынешняя работа финансировалась американской ассоциацией сердца гранты 16SDG30910007 и 18CDA34110338, а также Национальные институты здравоохранения грантов HL083015, HL111437, HL118650, и HL129727.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Amira6FEIПрограммное обеспечение для анализа изображений
DAPTMillipore SigmaD5942-5MG
Доксорубицина гидрохлоридMillipore SigmaD1515-10MG
Этил3-аминобензоат метансульфонатMillipore SigmaE10521-10GTricaine
MATLABMathWorksСреда программирования
Набор инструментов для обработки изображений MATLABНаборобработки изображений MathWorks
инструментов для

Ссылки

  1. Ewer, M. S., Ewer, S. M. Cardiotoxicity of anticancer treatments. Nature Reviews Cardiology. 12 (9), 547-558 (2015).
  2. Thavendiranathan, P., Wintersperger Bernd, J., Scott, F. D., Thomas D, M. H. Cardiac MRI in the Assessment of Cardiac Injury and Toxicity From Cancer Chemotherapy. Circulation: Cardiovascular Imaging. 6 (6), 1080-1091 (2013).
  3. Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
  4. Thavendiranathan, P., et al. Use of Myocardial Strain Imaging by Echocardiography for the Early Detection of Cardiotoxicity in Patients During and After Cancer Chemotherapy. A Systematic Review. 63 (25), Part A 2751-2768 (2014).
  5. Collier, P., Phelan, D., Klein, A. A Test in Context: Myocardial Strain Measured by Speckle-Tracking Echocardiography. Journal of the American College of Cardiology. 69 (8), 1043-1056 (2017).
  6. Hanekom, L., Cho, G. Y., Leano, R., Jeffriess, L., Marwick, T. H. Comparison of two-dimensional speckle and tissue Doppler strain measurement during dobutamine stress echocardiography: an angiographic correlation. European Heart Journal. 28 (14), 1765-1772 (2007).
  7. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  8. Chen, J., et al. Displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND) reveals segmental susceptibility to doxorubicin-induced injury and regeneration. JCI Insight. 4 (8), e125362(2019).
  9. Messerschmidt, V., et al. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Journal of Visualized Experiments. (138), e57763(2018).
  10. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).
  11. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  12. Lenneman, C. G., Sawyer, D. B. Cardio-Oncology: An Update on Cardiotoxicity of Cancer-Related Treatment. Circulation Research. 118 (6), 1008-1020 (2016).
  13. Geyer, H., et al. Assessment of Myocardial Mechanics Using Speckle Tracking Echocardiography: Fundamentals and Clinical Applications. Journal of the American Society of Echocardiography. 23 (4), 351-369 (2010).
  14. Castro, P. L., Greenberg, N. L., Drinko, J., Garcia, M. J., Thomas, J. D. Potential pitfalls of strain rate imaging: angle dependency. Biomedical Sciences Instrumentation. 36, 197-202 (2000).
  15. Seo, Y., Ishizu, T., Aonuma, K. Current Status of 3Dimensional Speckle Tracking Echocardiography: A Review from Our Experiences. Journal of Cardiovascular Ultrasound. 22 (2), 49-57 (2014).
  16. Amzulescu, M. S., et al. Improvements of Myocardial Deformation Assessment by Three-Dimensional Speckle-Tracking versus Two-Dimensional Speckle-Tracking Revealed by Cardiac Magnetic Resonance Tagging. Journal of the American Society of Echocardiography. 31 (9), 1021-1033 (2018).
  17. Wolterink, J. M., Leiner, T., Viergever, M. A., Išgum, I. Reconstruction, Segmentation, and Analysis of Medical Images. Zuluaga, M. A., et al. , Springer International Publishing. 95-102 (2016).
  18. Avendi, M. R., Kheradvar, A., Jafarkhani, H. A combined deep-learning and deformable-model approach to fully automatic segmentation of the left ventricle in cardiac MRI. Medical Image Analysis. 30, 108-119 (2016).
  19. Packard, R. R. S., et al. Automated Segmentation of Light-Sheet Fluorescent Imaging to Characterize Experimental Doxorubicin-Induced Cardiac Injury and Repair. Scientific Reports. 7 (1), 8603(2017).
  20. Jay Kuo, C. C., Chen, Y. On data-driven Saak transform. Journal of Visual Communication and Image Representation. 50, 237-246 (2018).
  21. Natarajan, N., et al. Complement Receptor C5aR1 Plays an Evolutionarily Conserved Role in Successful Cardiac Regeneration. Circulation. 137 (20), 2152-2165 (2018).
  22. Zhukov, L., Barr, A. H. IEEE Visualization VIS 2003. , 597-602 (2003).
  23. Nielles-Vallespin, S., et al. In vivo diffusion tensor MRI of the human heart: Reproducibility of breath-hold and navigator-based approaches. Magnetic Resonance in Medicine. 70 (2), 454-465 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

zebrafish4D

Похожие статьи