A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Целью данного протокола является детальный новый метод оценки сегментальной сердечной функции у эмбриональных зебры как в физиологических, так и в патологических условиях.
Зебрафиш все чаще используется в качестве образцового организма для кардиомиопатий и регенерации. Современные методы оценки сердечной функции не могут надежно обнаружить сегментающую механику и не всегда осуществимы у зебры. Здесь мы представляем полуавтоматический метод количественной оценки четырехмерной (4D) сегментальной сердечной функции: анализ смещения механической деформации миокарда (DIAMOND). Трансгенные эмбриональные зебры были изображены в vivo с помощью световой лист флуоресценции микроскопии системы с 4D синхронизации движения сердца. Приобретенные 3D цифровые сердца были реконструированы в конце систолы и конца диастолы, и желудочек был вручную сегментирован в двоичные наборы данных. Затем сердце было переориентировано и изотропно переопределилось вдоль истинной короткой оси, и желудочек был равномерно разделен на восемь частей (I-VIII) вдоль короткой оси. Из-за различных самолетов и матриц в конце систолы и конца диастолы, матрицы преобразования была применена для регистрации изображения для восстановления первоначальной пространственной связи между resampled систолических и диастолических матриц изображений. После регистрации изображений вектор смещения каждого сегмента от конечной систолы к конечной диастоле был рассчитан на основе смещения массовых центроидов в трех измерениях (3D). DIAMOND показывает, что базальные сегменты миокарда, прилегающие к атриовентрикулярному каналу, подвергаются самой высокой механической деформации и наиболее восприимчивы к сердечной травме, вызванной доксорубицином. В целом, DIAMOND предоставляет новые идеи в сегментальной сердечной механики в эмбрионах зебры за пределами традиционной фракции выброса (EF) в физиологических и патологических условиях.
Химиотерапия индуцированной сердечной токсичности и последующей сердечной недостаточности являются одной из основных причин прекращения химиотерапии1. Поэтому сердечная функциональная оценка играет решающую роль в выявлении токсичности сердца и, что более важно, в прогнозировании ранней сердечной травмы после химиотерапии2. Тем не менее, современные подходы к сердечной функциональной оценке сталкиваются с ограничениями. Такие методы, как левая фракция выброса желудочков (LVEF) обеспечивают только глобальную и часто задержку сердечной механики после травмы3,4. Ткань Доплера изображения обеспечивает сегментную информацию деформации миокарда, но страдает от значительной intraobserver и interobserver изменчивость, отчасти из-за ультразвукового луча угол зависимость5. Двухмерное (2D) слежение за пятнышком использует B-режим эхокардиографии, который теоретически устраняет зависимость от угла, но его точность ограничена движением вне плоскости6. Поэтому не хватает строгого подхода к количественной оценке сегментальной сердечной функции как в научных исследованиях, так и в клинических условиях.
В этом контексте мы разработали 4D метод количественной оценки для анализа сегментальной сердечной функции, который мы назвали анализом смещения миокарда механической деформации (DIAMOND), чтобы определить переносчики смещения миокардных масс центроидов в 3D пространстве. Мы применили DIAMOND для оценки in vivo сердечной функции и доксорубицина индуцированной сердечной токсичности с зебрафишами(Danio rerio) в качестве модели животных, выбранных из-за их регенерации миокарда и высоко консервированных генов развития7. Мы также сравнили сегментарное смещение DIAMOND с определением глобальной фракции выброса (EF) и 2D-напряжением после лечения доксорубицином. Интегрируя смещение DIAMOND с 4D световой лист флуоресцентной микроскопии (LSFM) приобретенные визуализации эмбриональных сердец зебры, DIAMOND показывает, что базальные сегменты миокарда, прилегающих к атриовентрикулярного канала проходят самую высокую механическую деформацию и являются наиболее восприимчивыми к острой доксорубицин сердечной травмы8.
Все методы, описанные здесь, были одобрены UCLA Институциональный комитет по уходу за животными и использования (IACUC), и эксперименты были проведены в соответствии с протоколами, утвержденными UCLA Управления по исследованию животных.
1. Разведение Tg (cmlc2:mCherry) зебры и сбор эмбрионов
2. Доксорубицин лечение, чтобы вызвать сердечную травму
3. Модуляция пути Ноч
4. Синхронизация изображений и пост-изображений
5. Реконструкция 3D систолического и диастолического сердца
6. Сегментация желудочка
7. Создание прямоугольных параллелепипедов для регистрации изображений
8. Систолическое систолическое и диастолическое 3D сердца вдоль короткой плоскости оси
9. Разделение перевыборы сердца
10. Регистрация систолических и диастолических изображений матриц
11. Выход переносчиков перемещения
координаты (где k указывает X, Y, или координат, соответственно) каждого сегмента (I-VI) в наборе данных сегментации от систолы до диастолы(рисунок 1J). Массовый центроид в 3D пространстве мы определяем следующим образом:
Процесс, с помощью которого DIAMOND был разработан для оценки 3D сегментальной сердечной функции, представлен на рисунке 1. После lsFM изображение приобретения и реконструкции в 3D эмбрионального сердца зебры (Рисунок 1A), истинная короткая ось плоскости была определена как плоскость перпендикулярно вертикальным и горизонтальным длинным осям, оба из которых определяются в многоплановой зритель(Рисунок 1B). Сердце было затем resampled вдоль короткой плоскости оси(Рисунок 1C), и разделены на восемь равных сегментов, состоящих даже углы в соответствии с виртуальной линии деления (красная пунктирная линия), соединяющая центр эндокардиальной желудочковой полости в центре атриовтрикулярного канала (Рисунок 1E). 3D-изображения идентифицированных сегментов иллюстрируются в поперечном представлении(рисунок 1F)и по сравнению с необработанными данными(рисунок 2). Сегменты VII и VIII были удалены из анализа, поскольку они охватывают атриовентрикулярный канал и, таким образом, содержат меньше миокарда по сравнению с другими сегментами. Различные самолеты для конечных систол (HS)и конечная диастоле (HD) приводят к определенным координатам для конечных систолических и конечных диастолических матриц, которые должны быть зарегистрированы для восстановления их первоначального пространственного отношения(рисунок 1G). В качестве ориентира для согласованности была выбрана система координат конечной систолической матрицы. Для определения матрицы трансформации (Tm) от конечной диастолической матрицы до конечной систолической матрицы практически была создана матрица из трех параллелепипедов, которая асимметрична в 3D и имеет такое же измерение, как и исходная матрица изображения. Параллелепипеды были повторно отобраны дважды, сначала в короткой плоскости оси конечной матрицы, а затем в короткой плоскости оси конечной диастолической матрицы, что привело к различным преобразованным параллелепипедам для конечной систолы (зеленый) и конечной диастоле (красный)(рисунок 1H).
Зеленые и красные параллелепипеды были затем зарегистрированы вместе жестким алгоритмом регистрации тела, а Тм был рассчитан и применен к матрице конца диастолы для восстановления координат(рисунок 1I). Этот процесс позволяет последующее отслеживание в 3D пространстве переносчиков смещения массовых центридов из любого сегмента желудочка во время сердечного цикла(рисунок 1J). DIAMOND смещения желудочковых сегментов I-VI можно отслеживать в течение нескольких точек времени в сердечном цикле(рисунок 1K), который может быть упрощен для количественного анализа до двух временных точек, начиная от конца систолы до конца диастолы (Рисунок 1L). Сегменты, генерируемые DIAMOND, могут быть визуализированы на рисунке 2,где каждый цвет представляет один сердечный сегмент.
С DIAMOND, мы обнаружили сегментальное неоднородность сердечной функции и восприимчивость к доксорубицин индуцированной травмы миокарда у зебры. После 24 ч лечения с 10 ММ доксорубицин от 3-4 dpf(Рисунок 3A), мы сравнили DIAMOND смещения желудочковсегментов между контролем и химиотерапией групп(Рисунок 3B) и 48 ч после лечения (Рисунок 3C). Все фигуры DIAMOND следуют тому же графическому рисунку, что и перерисовка желудочков вдоль короткой оси(рисунок 1E). Данные представлены в процентах за счет нормализации L2-нормы переносица перемещения во внутренний периметр сердца, с X (зеленый), Y (синий) и компоненты (оранжевый) иллюстрируются как их взвешенные вклады. На 4 dpf, средняя L2-норма сегментного переносчика перемещения в контрольной рыбы колебалась от 6,6-11,3 мкм, или 3,8-6,6% после нормализации. Наши результаты показывают, что в условиях контроля, базальные сегменты I и VI проходят наибольшие смещения и являются наиболее восприимчивыми к доксорубицин индуцированной сердечной травмы(Рисунок 3B, 29% снижение с 6,6-4,7%, n No 10 контроля и 8 доксорубицин, стр. 0,01). При 6 dpf средняя L2-норма переносчиков сегментного смещения в контрольной рыбе колебалась от 6,8-14 мкм, или 3,9-8% после нормализации. На 6 dpf, базальные сегменты I и VI восстановили смещения DIAMOND для контроля уровней, предлагая сегментальное регенерации(Рисунок 3C, n no 10 управления и n No 8 доксорубицин). Параллельно, ухудшение в 2D базальный штамм от -53 до -38% наблюдалось на 4 dpf после лечения доксорубицин, а затем возвращение к контрольным уровням на 6 dpf, подтверждающие результаты смещения DIAMOND(Рисунок 3D, 3E). Наблюдалось также параллельное снижение глобальной фракции выброса в ответ на доксорубицин при 4 dpf с восстановлением при 6 dpf(рисунок 3F, 3G).
Затем мы применили DIAMOND во время лечения доксорубицин и Нотч пути модуляции с использованием ингибитора Notch DAPT и спасения с помощью Notch вниз по течению эффекторов NICD и NRG1 мРНК (Рисунок 4A). Микроинъекция NICD и NRG1 mRNA спасла уменьшение смещения DIAMOND и EF после острой химиотерапии, вызванной травмой при 4 dpf(рисунок 4B, 4D). Воздействие ингибитора Notch DAPT вместе с доксорубицином привело к более диффузному снижению смещения DIAMOND, в дополнение к базальным сегментам I и VI(рисунок 4B). Кроме того, ингибирование нот пути после химиотерапии вызванных травмы еще больше препятствует восстановлению DIAMOND смещения базальных сегментов и EF на 6 dpf. Ингибирование было спасено Нотч вниз по течению эффекторов NICD и NRG1 (Рисунок 4C, 4E).
Рисунок 1: 4D развитие смещения DIAMOND. (A) Сырые изображения были захвачены светлистфлюеорной микроскопией. (B и C) Реконструированное 3D сердце было resampled вдоль истинного ближнего плоскости плоскости зрения. (D) Схематическая иллюстрация эмбрионального сердца зебры. (E и F) 2D и 3D иллюстрации деления желудочка на восемь сегментов, за исключением сегментов VII и VIII. (G) Различные системы координат конца-systole и конца-диастолы после resampling. (H) Группа прямоугольных параллелепипедов была создана для генерации матрицы преобразования (Tm). (I) Зарегистрированные конечные систолические и конечные диастолические координатные системы, применяя Tm. (J) Переносимый вектор сегментальной массы центроида от конечной систолы до конца диастолы. (K) DIAMOND смещения желудочковых сегментов I-VI отслеживается в течение нескольких точек времени в сердечном цикле. (L) DIAMOND смещения желудочковых сегментов I-VI от конца систолы до конца диастолы. Эта цифра из Chen et al.8 воспроизводится с разрешения Американского общества клинических исследований (ASCI). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: DIAMOND сегментации эмбрионального сердца зебры по сравнению с необработанными данными в 3D. Эмбриональное сердце зебры было разделено на шесть сегментов (объемов), изображенных здесь в разных цветах для расчета смещений DIAMOND (слева). Вектор смещения каждого сегмента, вычисленный DIAMOND, представляет его сегментальную сердечную функцию. Атриум и отток тракта были удалены во время сегментации. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: DIAMOND распутывает сегментатную неоднородность в сердечной функции и восприимчивость к химиотерапии индуцированной травмы. (A) Экспериментальный график лечения доксорубицин. (B и C) Сегментарное сравнение векторов смещения DIAMOND нормализовалось к внутреннему периметру миокарда между группами управления и доксорубицином на 4 и 6 dpf (t тесты,p qlt; 0.01, n 8-10 на группу). (D и E) Оценка деформации в желудочковой базе, изображающей аналогичную картину травми и регенерации, как векторы смещения DIAMOND (п.л.; 0,05, n 6-8 на группу). (F и G) Снижение фракции выброса в ответ на доксорубицин при 4 dpf с восстановлением на 6 dpf, следуя шаблону, аналогичному сегментарным смещениям DIAMOND на глобальном уровне желудочков (t тесты,p q lt; 0.01, бары ошибок SEM, n 6-10 на группу). Эта цифра из Chen et al.8 воспроизводится с разрешения ASCI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: DIAMOND механики для оценки Нотч-опосредованного восстановления миокарда после доксорубицина индуцированной травмы. (A) Экспериментальное расписание. (B и C) NICD и NRG1 Notch вниз по течению эффекторов спас сокращение смещения DIAMOND в сегментах I и VI на 4 dpf. При 6 dpf, ингибирование Нотч сигнализации DAPT нарушило восстановление сегментальной сердечной функции (ANOVA, no sp lt; 0.01 Dox против управления; pqlt; 0,05,p q lt; 0.01, Dox и DAPT против управления, n 6-10 на группу). (D и E) Фракция выброса подтверждает механику DIAMOND на глобальном уровне (ANOVA,p qlt; 0,05,p slt; 0.01, бары ошибок SEM, n - 5-11 на группу). Эта цифра из Chen et al.8 воспроизводится с разрешения ASCI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Авторы заявили, что никакого конфликта интересов не существует.
Целью данного протокола является детальный новый метод оценки сегментальной сердечной функции у эмбриональных зебры как в физиологических, так и в патологических условиях.
Нынешняя работа финансировалась американской ассоциацией сердца гранты 16SDG30910007 и 18CDA34110338, а также Национальные институты здравоохранения грантов HL083015, HL111437, HL118650, и HL129727.
| Amira6 | FEI | Программное обеспечение для анализа изображений | |
| DAPT | Millipore Sigma | D5942-5MG | |
| Доксорубицина гидрохлорид | Millipore Sigma | D1515-10MG | |
| Этил3-аминобензоат метансульфонат | Millipore Sigma | E10521-10G | Tricaine |
| MATLAB | MathWorks | Среда программирования | |
| Набор инструментов для обработки изображений MATLAB | Набор | инструментов дляобработки изображений MathWorks |
