Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В vitro Культура эпителиальных клеток из различных анатомических регионов амниотической Мембраны человека

7.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60551

⸱

28 ноября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Fisiología y Desarrollo Celular, Instituto Nacional de Perinatología, 2Biotecnología Médica y Farmacéutica CONACYT, Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), 3Departamento de Inmunobioquímica, Instituto Nacional de Perinatología, 4Instituto de Neurobiología, UNAM

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает изоляцию эпителиальных клеток из различных анатомических областей амниотической мембраны человека для определения их неоднородности и функциональных свойств для возможного применения в клинических и физиопатологических моделях.

Аннотация

Несколько протоколов были зарегистрированы в литературе для изоляции и культуры человека амниотических эпителиальных клеток (HAEC). Однако они предполагают, что амниотический эпителий является однородным слоем. Амнион человека можно разделить на три анатомические области: отраженную, плацентарную и пупочную. Каждый регион имеет различные физиологические роли, например, в патологических условиях. Здесь мы описываем протокол для вскрытия ткани амниона человека в трех разделах и поддерживать его в пробирке. В культуре клетки, полученные из отраженного амниона, отображали кубоидальную морфологию, в то время как клетки как из плацентарных, так и из пупочных областей были плоскоклеточными. Тем не менее, все полученные клетки имеют эпителиальный фенотип, продемонстрированный иммунообнаружением E-кадерин. Таким образом, поскольку плацентарные и отраженные области на месте отличаются в клеточных компонентах и молекулярных функциях, может потребоваться для исследования in vitro рассмотреть эти различия, поскольку они могут иметь физиологические последствия для использования HAEC в биомедицинских исследований и перспективного применения этих клеток в регенеративной медицине.

Введение

Клетки амниотического эпителия человека (HAEC) возникают на ранних стадиях эмбрионального развития, примерно в восемь дней послеоплодизации. Они возникают из популяции плоскоклеточных эпителиальных клеток эпибласта, которые вытекают из внутреннего слоя амниотической мембраны1. Таким образом, HAEC считаются остатками плюрипотентных клеток из эпибласта, которые имеют потенциал, чтобы дифференцироваться в три слоя зародыша эмбриона2. В последнее десятилетие, различные исследовательские группы разработали методы, чтобы изолировать эти клетки от амниотической мембраны в срок беременности, чтобы охарактеризовать их предполагаемых плюрипотентных свойств, связанных с культурой в пробирке3,4.

Соответственно, было установлено, что HAEC особенность черты, характерные для человека плюрипотентных стволовых клеток (HPSC), таких как поверхностные антигены SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; ядро факторов транскрипции pluripotency OCT4, SOX2 и NANOG; и маркер распространения KI67, предполагая, что они самообновляются5,6,7. Кроме того, эти клетки были оспорены с помощью протоколов дифференциации для получения клеток, положительных для линейных конкретных маркеров трех слоев микробов (эктодерм, мезодерм, и эндодерм)4,5,8, а также в животных моделей человеческих заболеваний. Наконец, HAEC выразить E-кадерин, которые демонстрируют, что они сохраняют эпителиальный характер так же, как HPSC5,9.

Помимо их эмбрионального происхождения, HAEC имеют другие свойства, которые делают их пригодными для различных клинических применений, таких как секреция противовоспалительных и антибактериальных молекул10,11, факторы роста и цитокинов релиз12, не образование тератомы, когда они пересажены в иммунодефицитных мышей в отличие от HPSC2, и иммуно-толерной толерантности, потому что они выражают HLA-G отказ, который трансплантация13.

Однако, предыдущие доклады предполагали, что амнион человека является однородной мембраной, не учитывая, что она может быть анатомически и физиологически разделена на три области: плацентарный (амнион, который охватывает decidua базалис),пупочная (часть, которая обволакивает пуповину), и отражается (остальная часть мембраны не прилагается к плаценте)14. Было показано, что плацентарные и отраженные области амниона отображают различия в морфологии, митохондриальной активности, обнаружении реактивных видов кислорода15, выражении миРНК16, и активации сигнальных путей17. Эти результаты свидетельствуют о том, что амнион человека интегрируется в разнородную популяцию с различной функциональностью, которая должна быть рассмотрена для дальнейших исследований, проведенных в situ или in vitro моделей. В то время как другие лаборатории разработали протоколы для изоляции HAEC от всей мембраны, наша лаборатория разработала протокол для изоляции, культуры и характеристики клеток из различных анатомических регионов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был одобрен комитетом по этике Национального института Перинатологии в Мехико (номер реестра 212250-21041). Все процедуры, проведенные в этих исследованиях, соответствовали этическим стандартам Национального института перинатологии, Хельсинкской декларации и руководящим принципам, изложенным в официальном мексиканском стандарте Министерства здравоохранения.

1. Подготовка

  1. Подготовьте решение 1x PBS с помощью EDTA. Для этого добавьте 500 л 0,5 М EDTA в 500 мл 1x PBS для конечной концентрации 0,5 мм EDTA.
  2. Подготовьте среду культуры для HAEC. Возьмите 450 мл высокоглюкозного дМЭМ, дополните его 5 мл пирувата натрия (100 мМ), 50 мл тепло-неактивной сыворотки крупного рогатого скота, 5 мл несущественных аминокислот (100x), 5 мл антибиотико-антимикотик (100х), 5 мл L-глухота (20 м0 м0 м0 м0 м0 м0 м0 м0 м0м м0м) 500 л меркаптоэтанола (1000x).
  3. Стерилизовать контейнеры для транспортировки и обработки ткани: контейнер из нержавеющей стали с крышкой для транспортировки всей плаценты из операционной в лабораторию, лоток (20 см х 30 см х 8 см) для мытья и удаления крови из всей плаценты до вскрытие амниотической мембраны и пластиковой разделочной доски для разделения амниотической мембраны на три области.
  4. Стерилизовать хирургические инструменты (скальпели, ножницы, щипцы и зажимы), 500 мл клюв, хлопчатобумажные марли и солевой раствор.

2. Получение плацентарной ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Амниотические мембраны были получены от женщин на полную беременность (37–40 недель), под указанием кесарева сечения, без каких-либо признаков активного труда и никаких микробиологических характеристик инфекции. Процедуры полной изоляции и культуры осуществлялись в рамках кабинета биобезопасности в стерильных условиях.

  1. В операционной, зажим пуповины, чтобы предотвратить приток крови к остальной части ткани. Соберите всю плаценту с пуповиной зажатой в стерильных контейнерах.
  2. Добавьте 500 мл соблюй раствора в контейнер для увлажнения плаценты.
  3. Закройте контейнер и транспортировать ткань в лабораторию при комнатной температуре.
  4. Поместите контейнер с плацентой в шкаф биобезопасности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если вскрытие не осуществляется в течение 15 минут от сбора плаценты, хранить контейнер с плацентой на льду до обработки. Избегайте более 1 ч прошедшего времени между получением плаценты и началом вскрытия.

3. Механическое разделение на область амниотической мембраны

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура должна проводиться в шкафу биобезопасности в стерильных условиях и при комнатной температуре.

  1. Удалите всю плаценту из контейнера и поместите его на лоток с пуповиной, обращенной вверх.
  2. Используя стерильную хлопчатобумажную марлю, очистите сгустки крови с поверхности хорион-амниона, которая покрывает плаценту.
  3. Определите три области мембраны: пупочный амнион, окутывающий пуповину, плацентарный амнион, покрывающий базалис decidua, и отраженный регион, который является остальной частью амниона, который не прикреплен к плаценте (Рисунок 1).
  4. Расчлените пупочной амнион(рисунок 2A).
    1. Используя рассекающие щипцами, удерживайте часть мембраны амниона, которая покрывает стык плаценты и пуповины.
    2. С помощью скальпеля, вскрыть область, которая окружает шнур при растяжении, чтобы отделить его от хориона.
    3. Депозит разделенной ткани в помечены стакан с 100 мл солевым раствором.
  5. Вскрыть плацентарную амнионную область(рисунок 2B).
    1. С помощью стерильной хлопчатобумажной марли удалите сгустки крови с поверхности хорион-амниона, которая покрывает плаценту.
    2. Держите мембрану на границе между плацентой и отраженной областью с рассекающимищицами щипцами.
    3. Вырезать по окружности плаценты скальпелем.
    4. Отделите плацентарную амнион от хориона, стараясь не вырезать сосуды из плаценты.
    5. Поместите отделенную ткань в другой помеченный стакан с 300 мл соблюй раствора.
  6. Отделить остальную часть амниотической мембраны, которая не прикреплена к плаценте (т.е. отраженной части) от хориона(рисунок 2C).
    1. Соберите отраженную область в другой помеченный стакан с 300 мл сольного раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить сосуд постоянно во время вскрытия, чтобы предотвратить высыхание тканей.

4. Мытье мембран

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура должна проводиться в шкафу биобезопасности в стерильных условиях при комнатной температуре.

  1. Откажитесь от сольного раствора каждой мембранной области отдельно.
  2. Добавьте 100 мл свежего сольного раствора в пупочной области.
  3. Добавьте 300 мл свежего сольного раствора в плацентарные и отраженные области соответственно.
  4. Перемешать мембраны с помощью вскрытия щипцы для удаления остатков крови.
  5. Откажитесь от сольного раствора.
  6. Повторите стирание и возбуждение по крайней мере 3x, пока мембраны полупрозрачные.
  7. Поместите и удлините мембраны на доске, чтобы очистить стерильной марлей сгустки крови, которые не были удалены с омынием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно удалить как можно больше эритроцитов, так как их присутствие влияет на функцию трипсина и жизнеспособность последующих клеточных культур.

5. Ферментативное пищеварение мембран из разных регионов

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура должна проводиться в шкафу биобезопасности в стерильных условиях.

  1. Разрежьте отраженные и плацентарные области на два или три фрагмента.
  2. Не разрезайте пуповину.
  3. Поместите фрагменты каждого региона в центрифуги труб. Добавьте 20 мл 0,5% трипсина/ЭДТА в отраженные и плацентарные области и 5 мл 0,5% трипсина/ЭДТА в пупочный регион, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы сократить отраженные и плацентарные области на более мелкие кусочки, потому что они должны быть полностью погружены в раствор трипсина.
  4. Встряхните центрифуги труб слегка в течение 30 с. Отбросьте трипсина.
  5. Добавьте 30 мл новых 0,5% трипсина/ЭДТА в отраженные и плацентарные области и 15 мл новых 0,5% трипсина/ЭДТА в пупочный регион, соответственно.
  6. Поместите трубки в ротатор внутри инкубатора.
  7. Инкубировать с вращением (20 об/мин) в течение 40 мин при 37 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ротатор трубки недоступен, встряхните трубки слегка вручную каждые 10 минут.
  8. Перенесите трипсин/клеточные растворы из каждого региона в новые центрифуги.
  9. Добавьте 2x том средств HAEC prewarmed на 37 c в пробку для того чтобы инактивировать энзим.
  10. Храните первое пищеварение на льду.
  11. Повторите шаги 5.6-5.8 на второй период пищеварения.
  12. Для каждой области, провести один конец амниона часть с помощью рассекающих щипцы, а с другой парой сжать вдоль ткани, чтобы удалить ряды эпителиальных клеток, которые не полностью слезть во время предыдущих инкубационных периодов.
  13. Соберите второе пищеварение в другой набор центрифуговых трубок и инактивируйте с 2-х объемом носителей HAEC.
  14. Отбросьте переваренные мембраны в контейнер для биоопасности.

6. Изоляция ГАЭК

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура должна проводиться в шкафу биобезопасности в стерильных условиях.

  1. Центрифуга все трубы на 200 х г в течение 10 мин при 4 кв. C.
  2. Откажитесь от супернатанта и добавьте 10 мл предварительно разогретых носителей HAEC (до 37 градусов по Цельсию) на трубку и трубку мягко дезагрегировать каждую гранулу.
  3. Объедините клеточные суспензии двух пищеварений в отдельной трубке для каждой мембранной области.
  4. Фильтр клеточных суспензий с помощью 100 мкм ячейки ситектов для удаления внеклеточного матричного мусора и получения одиночных клеток.
  5. Подготовьте три аликвота с 90 злицу трипан синего в микроцентрифуге трубки.
  6. Добавьте 10 кЛ каждой клеточной подвески на мембранную область в микроцентрифуговые трубки и перемешайте.
  7. Подсчитайте клетки гемоситометром под световым полевым микроскопом.

7. Культура HAEC

  1. Семена HAEC из трех регионов отдельно при плотности 3 и 104 клетки /см2 с предварительно разогретых HAEC средств массовой информации, дополненный 10 нг/мл человека эпидермального фактора роста (EGF).
    1. Семя клетки в 100 мм пластин для поддержания их в пробирке или в 24 пластин ы для иммунохимического анализа.
  2. Инкубировать блюда при 37 градусах Цельсия при нормокиси (5% CO2)в увлажненный инкубатор.
  3. Добавляйте EGF ежедневно и меняйте среду каждый третий день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки станут стыковочные через 4–6 дней.
  4. Используйте клетки для обычной иммуногистохимии, анализа клеточной сортировки, криоконсервирования, экстракции РНК и белка, или для продолжения прохождения.

8. Прохождение HAEC

  1. Удалите среду HAEC и промойте 2x с помощью PBS/EDTA 0.01M.
  2. Инкубировать раствором PBS/EDTA 0.01M на 15 мин при 37 градусах Цельсия.
  3. Удалить PBS/EDTA и добавить 1,5 мл 0,5% трипсин / EDTA.
  4. Инкубировать в течение 5-8 мин при 37 градусах По Цельсию.
  5. Инактивируйте фермент двумя томами медиаHAEC.
  6. Соберите смешанный раствор и центрифугу в течение 5 мин при 200 х г.
  7. Подсчитайте клетки и продолжайте следующие проходы или используйте клетки для дальнейшего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

HAEC были выделены из каждого из трех анатомических регионов амниотической мембраны и индивидуально культивируется в пробирке. После 48 ч культуры, клетки с эпителиальным фенотипом прилипли к поверхности пластины, хотя средства массовой информации также содержали мусор клетки и плавающие клетки, которые были удалены после того, как среда была изменена(рисунок 3).

Во время обработки первичной культуры (проход ноль, P0), некоторые осложнения могут возникнуть, которы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы внедрили новый протокол для изоляции HAEC от терминовых мембран. Он отличается от предыдущих докладов в том, что каждая мембрана была разделена на три анатомических регионов до изоляции для анализа клеток от каждого из них.

Одним из наиболее важных шагов в протоколе является промывка мембраны для удаления всех сгустков крови, так как они могут мешать активности трипсина при разделении эпителиальных клеток. Неспособность выполнить этот шаг должным образом может привести к получению первичной...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Наше исследование было поддержано грантами Национального института Перинатологии Мексики (21041 и 21081) и CONACYT (A1-S-8450 и 252756). Мы благодарим Джессику Гонсалес Норрис и Лидию Юририю Паредес Вивас за техническую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Культуральные реагенты
2-меркаптоэтанолThermo Fisher Scientific/Gibco2198502355 мМ
Рекомбинантный человеческий EGF без животного происхожденияPeprotechAF-100-15
Антибиотик-антимикотикThermo Fisher Scientific/Gibco15240062100X
модифицированная среда Dulbecco's EagleThermo Fisher Scientific/Gibco12430054с добавкой с высоким содержанием глюкозы и HEPES
EDTAThermo Fisher Scientific/AmbionAM9260G0,5 М
эмбриональные стволовые клетки FBS, сертифицированныеThermo Fisher Scientific/Gibco10439024
заменимые аминокислотыThermo Fisher Scientific/Gibco11140050100X
параформальдегидлюбая марка
Фосфатно-Буферный Физиологический РастворThermo Fisher Scientific/Gibco100100231X
Солевой раствор (хлорид натрия 0,9%)любая марка
Пируват натрияThermo Fisher Scientific/Gibco11360070100 мМ
Трипсин/ЭДТА 0,05%Thermo Fisher Scientific/Gibco25300054
<сильный> Одноразовый материал
100 и микро; m Клеточный фильтрCorning/Falcon352360
100 мм Чашка для культур с обработкой TCCorning430167
24-луночные прозрачные многолуночные пластины с обработкой TCCorning/Costar3526
6-луночные прозрачные многолуночные пластины с обработкой TCCorning/Costar3516
Непирогенная стерильная центрифужная трубкалюбой маркис конической дно
Непирогенные стерильные наконечники из 1 000 микро; l, 200 и микро; л и 10 & мкр.
Стерильные ватные марли
Стерильные серологические пипетки по 5, 10 и 25 мллюбой марки
Стерильные хирургические перчаткилюбой марки
<прочные>Оборудование
Шкаф
Центрифуга
Микропипетки
Моторизованная пипетка Наполнитель/диспенсер
Стерильные стаканы объемом 500 мл
Стерильная пластиковая разделочная доска
Стерильные скальпели, ножницы, щипцы, зажимы
Стерильный контейнер
Стерильный лоток
Tube RotatorMaCSmix
Антитела и наборыAntibody ID
Anti-E-cadherinBD Biosciences610181RRID:AB_3975
Anti-KI67Santa Cruz23900RRID:AB_627859)
Anti-NANOGPeprotech500-P236RRID:AB_1268274
Anti-OCT4Abcamab19857RRID:AB_44517
Anti-SOX2MilliporeAB5603RRID:AB_2286686
Anti-SSEA-4Клеточная сигнализация4755RRID:AB_1264259
Anti-TRA-1-60Клеточная сигнализация4746RRID:AB_2119059
козья мышь Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11029RRID:AB_2534088
Козий анти-кролик Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-11036RRID:AB_10563566
Набор для анализа туннеляABCAM66110
биологической безопасности из нержавеющей стали

Ссылки

  1. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
  2. Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).
  3. Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
  4. Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1E 6 (2010).
  5. Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10 (12), 0146082(2015).
  6. Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).
  7. Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).
  8. Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).
  9. Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).
  10. Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
  11. Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003(2018).
  12. Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).
  13. Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).
  14. Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. , Springer. 268-318 (1995).
  15. Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).
  16. Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6 (9), 24131(2011).
  17. Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).
  18. Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).
  19. Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7 (1), 3761(2017).
  20. Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
  21. Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).
  22. Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).
  23. Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3 (3), 12320(2015).
  24. Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эпителиальные клетки амниона человекадиссекция амниотической мембраныпротокол ферментативного расщепленияметод изоляции клетокцентрифугирование и фильтрацияанализ эпителиального фенотипаиммунодетекция E-кадгеринамаркер пролиферации Ki-67области прикрепления плаценты и пуповиныкультура клеток in vitro
В vitro Культура эпителиальных клеток из различных анатомических регионов амниотической Мембраны человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.