Этот протокол описывает изоляцию эпителиальных клеток из различных анатомических областей амниотической мембраны человека для определения их неоднородности и функциональных свойств для возможного применения в клинических и физиопатологических моделях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В vitro Культура эпителиальных клеток из различных анатомических регионов амниотической Мембраны человека
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Несколько протоколов были зарегистрированы в литературе для изоляции и культуры человека амниотических эпителиальных клеток (HAEC). Однако они предполагают, что амниотический эпителий является однородным слоем. Амнион человека можно разделить на три анатомические области: отраженную, плацентарную и пупочную. Каждый регион имеет различные физиологические роли, например, в патологических условиях. Здесь мы описываем протокол для вскрытия ткани амниона человека в трех разделах и поддерживать его в пробирке. В культуре клетки, полученные из отраженного амниона, отображали кубоидальную морфологию, в то время как клетки как из плацентарных, так и из пупочных областей были плоскоклеточными. Тем не менее, все полученные клетки имеют эпителиальный фенотип, продемонстрированный иммунообнаружением E-кадерин. Таким образом, поскольку плацентарные и отраженные области на месте отличаются в клеточных компонентах и молекулярных функциях, может потребоваться для исследования in vitro рассмотреть эти различия, поскольку они могут иметь физиологические последствия для использования HAEC в биомедицинских исследований и перспективного применения этих клеток в регенеративной медицине.
Введение
Клетки амниотического эпителия человека (HAEC) возникают на ранних стадиях эмбрионального развития, примерно в восемь дней послеоплодизации. Они возникают из популяции плоскоклеточных эпителиальных клеток эпибласта, которые вытекают из внутреннего слоя амниотической мембраны1. Таким образом, HAEC считаются остатками плюрипотентных клеток из эпибласта, которые имеют потенциал, чтобы дифференцироваться в три слоя зародыша эмбриона2. В последнее десятилетие, различные исследовательские группы разработали методы, чтобы изолировать эти клетки от амниотической мембраны в срок беременности, чтобы охарактеризовать их предполагае....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол был одобрен комитетом по этике Национального института Перинатологии в Мехико (номер реестра 212250-21041). Все процедуры, проведенные в этих исследованиях, соответствовали этическим стандартам Национального института перинатологии, Хельсинкской декларации и руководящим принципам, изложенным в официальном мексиканском стандарте Министерства здравоохранения.
1. Подготовка
- Подготовьте решение 1x PBS с помощью EDTA. Для этого добавьте 500 л 0,5 М EDTA в 500 мл 1x PBS для конечной концентрации 0,5 мм EDTA.
- Подготовьте среду культуры для HAEC. Возьмите 450 мл высокоглюкозного дМЭМ, дополните его 5 мл пирувата на....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
HAEC были выделены из каждого из трех анатомических регионов амниотической мембраны и индивидуально культивируется в пробирке. После 48 ч культуры, клетки с эпителиальным фенотипом прилипли к поверхности пластины, хотя средства массовой информации также содержали мусор клетки и плавающие клетки, которые были удалены после того, как среда была изменена(рисунок 3).
Во время обработки первичной культуры (проход ноль, P0), некоторые осложнения могут возникнуть, которы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы внедрили новый протокол для изоляции HAEC от терминовых мембран. Он отличается от предыдущих докладов в том, что каждая мембрана была разделена на три анатомических регионов до изоляции для анализа клеток от каждого из них.
Одним из наиболее важных шагов в протоколе является промывка мембраны для удаления всех сгустков крови, так как они могут мешать активности трипсина при разделении эпителиальных клеток. Неспособность выполнить этот шаг должным образом может привести к получению первичной.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Наше исследование было поддержано грантами Национального института Перинатологии Мексики (21041 и 21081) и CONACYT (A1-S-8450 и 252756). Мы благодарим Джессику Гонсалес Норрис и Лидию Юририю Паредес Вивас за техническую поддержку.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Культуральные реагенты | |||
| 2-меркаптоэтанол | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 мМ |
| Рекомбинантный человеческий EGF без животного происхождения | Peprotech | AF-100-15 | |
| Антибиотик-антимикотик | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| модифицированная среда Dulbecco's Eagle | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | с добавкой с высоким содержанием глюкозы и HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0,5 М |
| эмбриональные стволовые клетки FBS, сертифицированные | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| заменимые аминокислоты | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| параформальдегид | любая марка | ||
| Фосфатно-Буферный Физиологический Раствор | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Солевой раствор (хлорид натрия 0,9%) | любая марка | ||
| Пируват натрия | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 мМ |
| Трипсин/ЭДТА 0,05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| <сильный> Одноразовый материал | |||
| 100 и микро; m Клеточный фильтр | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 мм Чашка для культур с обработкой TC | Corning | 430167 | |
| 24-луночные прозрачные многолуночные пластины с обработкой TC | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-луночные прозрачные многолуночные пластины с обработкой TC | Corning/Costar | 3516 | |
| Непирогенная стерильная центрифужная трубка | любой марки | с конической дно | |
| Непирогенные стерильные наконечники из 1 000 микро; l, 200 и микро; л и 10 & мкр. | |||
| Стерильные ватные марли | |||
| Стерильные серологические пипетки по 5, 10 и 25 мл | любой марки | ||
| Стерильные хирургические перчатки | любой марки | ||
| <прочные>Оборудование | |||
| Шкаф | |||
| Центрифуга | |||
| Микропипетки | |||
| Моторизованная пипетка Наполнитель/диспенсер | |||
| Стерильные стаканы объемом 500 мл | |||
| Стерильная пластиковая разделочная доска | |||
| Стерильные скальпели, ножницы, щипцы, зажимы | |||
| Стерильный контейнер | |||
| Стерильный лоток | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Антитела и наборы | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Клеточная сигнализация | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Клеточная сигнализация | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| козья мышь Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Козий анти-кролик Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Набор для анализа туннеля | ABCAM | 66110 |
Ссылки
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem c....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
Эпителиальные клетки амниона человекадиссекция амниотической мембраныпротокол ферментативного расщепленияметод изоляции клетокцентрифугирование и фильтрацияанализ эпителиального фенотипаиммунодетекция E-кадгеринамаркер пролиферации Ki-67области прикрепления плаценты и пуповиныкультура клеток in vitro
