Этот протокол обеспечивает простой в обращении метод культуры кишечных клеток из морского огурца Apostichopus japonicus и совместим с различными широко доступными образцами тканей морских организмов, включая Эхинодермата, Моллюскуску и Раккусею.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Апоптоз индукции и обнаружения в начальной культуре морских огурцов кишечных клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Первичные культивированные клетки используются в различных научных дисциплинах в качестве исключительно важных инструментов для функциональной оценки биологических веществ или характеристики конкретных биологических видов деятельности. Однако из-за отсутствия универсально применимых средств массовой информации и протоколов клеточной культуры хорошо описанные методы клеточной культуры для морских организмов по-прежнему ограничены. Между тем, часто происходящее микробное загрязнение и политропные свойства морских беспозвоночных клеток еще больше препятствуют выработке эффективной стратегии клеточной культуры для морских беспозвоночных. Здесь мы описываем простой в обращении метод культивирования кишечных клеток из морского огурца Apostichopus japonicus; кроме того, мы предоставляем пример индукции in vitro apoptosis и обнаружения в первичных культивированных кишечных клетках. Кроме того, этот эксперимент содержит подробную информацию о соответствующем методе культуры и собираемости клеток. Описанный протокол совместим с различными широко доступными образцами тканей морских организмов, включая Эхинодермата, Моллюскусу и Раккуза, и может обеспечить достаточное количество клеток для нескольких экспериментальных применений in vitro. Этот метод позволит исследователям эффективно манипулировать первичными культурами клеток из морских беспозвоночных и облегчить функциональную оценку целевых биологических материалов на клетках.
Введение
Культивирование клеток в искусственно контролируемых условиях, а не в их естественной среде, обеспечивает единые экспериментальные материалы для биологических исследований, особенно для видов, которые не могут быть легко культивированы в лабораторных условиях. Морские беспозвоночные составляют более 30% всех видов животных1,и они обеспечивают многочисленные биологические материалы для проведенияисследований по регулирующим механизмам конкретных биологических процессов, таких как регенерация2,3,стресс ответ 4 , и экологическая адаптация5
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Средняя подготовка клеточной культуры
-
Coelomic препарат жидкости
- Коллекция coelomic жидкости: В стерильных условиях вскрыть здоровый морской огурец (мокрый вес 85-105 г), собрать коеломную жидкость и хранить ее в стерильной стеклянной колбе.
- Удаление coelomic клетки: Центрифуга кельомной жидкости в 50 мл центрифуговых труб окни при 1700 х г в течение 5 мин и перенос супернатанта в новую стерильную стеклянную колбу; Далее, собирать клетки свободной кельомной жидкости морского огурца.
- Инактивация компонентов дополнения: Инкубировать стерильную ст....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь мы установили первичную кишечную клеточную культуру A. japonicus и прооцизировали клетки. На рисунке 1 показаны круглые клетки на разных стадиях культивирования. И EdU окрашивания анализы предоставляют прямые доказательства, чтобы выявить пролиферативной активности этих круглых клеток на более поздней стадии (Рисунок 2). Мы также слегка скорректировали протокол, культивируя измельченные блоки ткани вместо фильтрованных клеток; кроме того, тип шпин.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Обширные исследовательские усилия были посвящены созданию клеточных линий в последние десятилетия, однако, по-прежнему трудно добиться прогресса в долгосрочной культуре клеток из морских беспозвоночных14,22. Было сообщено, что культивированные клетки из регенерирующих голотурийских тканей были жизнеспособными в течение длительного периода времени и высокая активность пролиферации может быть обнаружена в конкретных клетках17,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить профессора Наиджина Чжоу из Университета Чжэцзян за его технические рекомендации и за то, что он сделал оборудование его лаборатории доступным для использования. Эта работа была финансово поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант номера 41876154, 41606150, и 41406137) и фундаментальных научно-исследовательских фондов для чжэцзян провинциальных университетов и научно-исследовательских институтов (грант номер 2019J'00007) ].
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,1 μ m фильтр | Millipore | SLVV033RS | |
| 0,22 мкм; m фильтр | Millipore | SLGP033RB | |
| 0,25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 мкм; m фильтр | Falcon | 352360 | |
| 4 см посуды | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% раствор параформальдегида | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | в настольных |
| центрифугах | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Химический реагент Sinopharm | 10005817 | |
| Инкубатор постоянной температуры | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Дексаметазон | Sinopharm Химический реагент | XW00500221 | |
| Электрическая термостатическая водяная баня | senxin17 | DK-S28 | |
| Химический | реагент этанол Sinopharm | 80176961 | 75% |
| Фактор роста фибробластов (FGF)) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Leica DMI3000B | DMI3000B | ||
| Химический реактив Garamycin | Sinopharm XW14054101 | ||
| Глюкоза | Химический реактив Sinopharm | 63005518 | |
| Hoechst33258 Окрашивающий раствор | Beyotime | C1017 | |
| Инсулин | Sinopharm Химический реактив | ||
| Инсулиноподобный фактор роста (ИФР) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Химический реагент Sinopharm | 10016308 | |
| L-15 геном Лейбовица | GNM41300 | ||
| L-глутамин (100 мг/мл) | Геном | ГНМ-21051 | |
| MgCl<суб>2 | Химический реактив | Sinopharm | |
| XW77863031 Na2SO4 | Sinopharm Химический реагент | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Химический реагент | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Химический реактив | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7,2-7,4 |
| Пенициллин-стрептомицин | Геном | ||
| PH-метр | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
Ссылки
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
