Пересмотренный метод для индуцирования вторичной лимфедемы в Hindlimb мышей

Краткое содержание

Эта модель животных позволяет исследователям индуцировать статистически значимые вторичные лимфедемы в задней конечности мышей, продолжительностью не менее 8 недель. Модель может быть использована для изучения патофизиологии лимфедемы и для изучения новых вариантов лечения.

Аннотация

Модели животных имеют первостепенное значение в исследовании лимфедемы для того, чтобы понять патофизиологию болезни, но и изучить потенциальные варианты лечения. Эта модель мыши позволяет исследователям вызвать значительное лимфедема продолжительностью не менее 8 недель. Лимфедема индуцируется с помощью комбинации дробной лучевой терапии и хирургической абляции лимфатических. Эта модель требует, чтобы мыши получают дозу 10 серый (Gy) излучения до и после операции. Хирургическая часть модели включает в себя перевязку трех лимфатических сосудов и извлечение двух лимфатических узлов из задней конечности мыши. Наличие доступа к микрохирургическим инструментам и микроскопу имеет важное значение, из-за небольших анатомических структур мышей. Преимущество этой модели в том, что она приводит к статистически значимым лимфедема, который обеспечивает хорошую основу для оценки различных вариантов лечения. Это также отличный и легко доступный вариант для микрохирургического обучения. Ограничение этой модели заключается в том, что процедура может занять много времени, особенно если она не практикуется заранее. Модель приводит к объективно количественной лимфедемы у мышей, не вызывая тяжелой заболеваемости и был протестирован в трех отдельных проектах.

Введение

Лимфедема характеризуется накоплением лимфатической жидкости, что приводит к локализованной отек тканей, который в основном происходит из-за нарушения или нарушения потока лимфатической жидкости в лимфатических сосудах¹. Лимфатический поток может быть нарушен или нарушен инфекцией, обструкцией, травмой или врожденными дефектами в лимфатической системе^2. Эти этиологии приводят к накоплению лимфатической жидкости, что приводит к хроническому состоянию воспаления, что приводит к последующему фиброзу, а также осаждению жировой ткани³. Лимфедема может быть классифицирована как первичная или вторичная лимфедема. Первичная лимфедема вызвана отклонениями в развитии или генетической мутацией^2,4. Вторичный лимфедема возникает из-за основного системного заболевания, хирургии или травмы^2,4. Вторичный лимфедема является наиболее распространенной формой лимфедемы в мире². В развитых странах наиболее распространенной причиной вторичной лимфедемы является онкологическая терапия, такая как адъювантная лучевая терапия и вскрытие лимфатических узлов^5. Лимфедема является наиболее частым среди больных раком молочной железы, но также может развиваться у пациентов с гинекологическими, меланомы, мочеполовой или рак шеи⁶. Было высказано предположение, что из всех женщин с диагнозом рака молочной железы, 21% будет развиваться лимфедема⁷.

Лимфедема может быть стресс для пациента как физически, так и психологически. Пациенты с лимфедема имеют повышенный риск заражения^5,8,9, низкое качество жизни и может развиться социальная тревога и симптомы депрессии^10. Осложнения хронической лимфедемы приводят к высокой стоимости медицинской помощи и увеличению бремени болезней^9,11. Выводы также предположили, что лимфедема может быть связано с повышенным риском смерти после лечения рака молочной железы¹². Консервативное управление, такие как сжатие пораженного участка, ручной лимфатический дренаж и общий уход за кожей остаются первой линией подхода. В настоящее время не лечит⁶. Хотя был достигнут прогресс в области хирургической и медицинской терапии, все еще есть возможности для совершенствования. Необходимы дополнительные исследования, обеспечивая понимание патофизиологии и прогрессирования заболевания, необходимы для того, чтобы врачи могли обеспечить лучшие варианты лечения для пациентов^5.

Модели животных используются в доклинических исследованиях для понимания патофизиологии заболеваний и разработки потенциальных вариантов лечения. Несколько различных моделей лимфедемы животных были созданы в клыки^13,14,кролики¹⁵, овец^16,свиней^17,18 и грызунов^{19,20, 21,22,23,24}. Модель грызунов, как представляется, наиболее экономически эффективной моделью, при исследовании реконструкции лимфатической функции, из-за грызунов быть легко доступными и относительно^{недорогой 25}. Большинство моделей мышей были сосредоточены на индуцировании лимфедема в хвосте мышей^21,22,23. Хвост модель очень надежна, но точный хирургический метод для индуцирования лимфедема значительно варьируется в предыдущих опубликованных материалов. Это приводит к колебаниям продолжительности и надежности разработанной лимфедемы, представленной в известной стифетуре²⁵. Различные методы также используются для индуцирования лимфедема в модели задних конечностей, и они также дают различные результаты, но модель hindlimb может быть легче понять с точки зрения перевода. Предыдущие модели лимфедемы были затруднены спонтанное разрешение лимфедемы и, следовательно, воспроизводимый и постоянный лимфедема модель необходима²⁵. Исследователи ранее пытались увеличить дозу радиации, чтобы предотвратить спонтанное разрешение лимфедемы, но это часто приводило к последующей тяжелой заболеваемости²⁵.

Эта модель приводит к статистически значимой лимфедеме, не вызывая тяжелой заболеваемости, сочетая микрохирургию с радиацией. Модель была пересмотрена из предыдущей хирургической модели, добавив дозу облучения, что вызывает лимфедема, не вызывая тяжелой заболеваемости²⁶. Он также предлагает прекрасную возможность для микрохирургического обучения. Доступ к микрохирургическому оборудованию и микроскопу необходим, благодаря небольшим анатомическим структурам мышей. Хирургическая процедура может быть выполнена, когда пользователь был обучен основным микрохирургическим методам, таким как зашивание микрохирургическими инструментами. Операторы, которые выполнили эту процедуру все смотрели учебник видео Acland на предварительные условия микрохирургических навыков (1981) и основной метод микросватуры (1985). Мы рекомендуем практиковать хирургическую процедуру 8–10 раз, прежде чем использовать ее в исследованиях. Практика процедуры гарантирует, что меньше ошибок, и что процедура может быть выполнена более эффективно. При освоении хирургическая процедура может быть выполнена за 45 минут.

Протокол

В рамках институциональных руководящих принципов животные размещались в Университете южной Дании. Все процедуры, касающиеся животных, были одобрены Инспекцией по экспериментам на животных, министерством окружающей среды и продовольствия Дании.

1. Предоперационное облучение

ПРИМЕЧАНИЕ: Предоперационное облучение происходит за 7 дней до операции.

1. Индуцировать анестезию.
   1. Поместите мышь в индукционную коробку и установите испаритель до 3% изофлуран с частотой потока кислорода 0,8-1,2 л/мин, чтобы вызвать ингаляционную анестезию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, инъекционные анестезии могут быть использованы, но в течение короткой продолжительности облучения индуцирования ингаляционной анестезии было достаточно. Для получения результатов, представленных в этой статье, были использованы 9-недельные самки мышей C57BL6.
   2. Убедитесь, что мышь полностью обезвлена хвостом или лапой щепотку теста.
2. Расположите мышь для облучения.
   1. Если полностью успокоительное, переместить мышь из индукционной коробки и поместить его под источником излучения в положении на спине и аккуратно зафиксировать задние конечности с лентой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь будет оставаться седативным в течение короткой продолжительности излучения.
   2. Поместите 1,5 мм толщиной свинцовой площадки, чтобы гарантировать, что только область, которая проходит операцию (т.е. круговая область диаметром 25 мм вокруг колена) облучается.
3. Вводят дозу 10 Ги радиации со скоростью 5,11 г/мин (100 кВт, 10 мА).
   ВНИМАНИЕ: При работе с радиацией необходимо соблюдать меры предосторожности. В ходе этого эксперимента все облучение проводилось в радиационно-изолированной комнате, а источник излучения был включен только тогда, когда весь персонал вышел и опечатал помещение.
4. Поместите мышь обратно в клетку.

2. Установка оборудования

ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургия должна быть выполнена в комнате, посвященной хирургическим процедурам. Оперативная поверхность должна быть стерильной.

1. Тщательно очистите все оперативные поверхности с 70% этанола. Носите сетку для волос и кавер-версии. Используйте стерильные хирургические инструменты и стерильные перчатки.
2. Приготовить анестезию.
   1. Нарисуйте 1 мл фентанила (0,315 мг/мл), 1 мл мидазолама (5 мг/мл) и 2 мл стерильной воды. Используйте различные шприцы и иглы для различных компонентов.
   2. Смешайте фентанил и стерильную воду, медленно опорожняя шприцы в стерильную стеклянную трубку. При смешивании добавьте мидазолам, чтобы завершить рабочее решение.
3. Приготовьте анальгезию.
   1. Нарисуйте 0,2 мл бупренорфина (0,3 мг/мл) и 2 мл сольника.
   2. Смешайте объемы, медленно опорожнение шприцев в стерильную стеклянную трубку, чтобы завершить рабочее решение.
4. Включите микроскоп и убедитесь, что освещение достаточно, и что микроскоп хорошо регулируется для глаз оператора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические процедуры должны выполняться под операционным микроскопом. Достаточно ежефрейта в диапазоне от 4x-25x.

3. Подготовка

1. Взвесьте мышь до операции, поместив мышь в пустой контейнер на очищенной шкале.
2. Администрирование анестезии.
   1. Нарисуйте 0,1 мл анестезии на 10 г мыши веса тела. Вводят анестезию подкожно в виде инъекции болуса.
   2. Пусть мышь отдохнуть в клетке с большим количеством постельных принадлежностей и жилья в течение примерно 10 минут до полного успокоительного. Изучите глубину анестезии, оценивая расслабление мышц и выполняйте тест на лапу или хвост.
3. При полном успокоительном состоянии, брить заднюю конечность выбрали для процедуры с помощью электрических клиперов. Убедитесь в том, чтобы вытереть лишние волосы.
4. Включите нагревательное устройство, например, грелку и накройте его хирургической тканью.
5. Установите поток кислорода до 0,8 л/мин и соедините его с носеконом. Используйте 100% кислород.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Носекон предназначен только для доставки кислорода, а не для анестезии.
6. Нанесите офтальмологическую мазь и введите 0,5 мл солей подкожно, предпочтительно в потертости мыши, чтобы предотвратить гиповолемию во время операции.
7. Расположите мышь для операции.
   1. Поместите мышь на хирургической ткани в положении на спине. Поместите носекон над мдонов.
   2. Зафиксировать конец задних конечностей мягко с лентой, чтобы предотвратить мышь от смещения во время операции.
   3. Стерилизовать кожу с помощью алкоголя/хлоргексидина или спирта/повидона йода.

4. Хирургия

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере, левая задняя конечность (когда мышь рассматривается в положении на спине), был выбран для процедуры.

1. Сделайте круговой разрез.
   1. Поднимите кожу с гладкими щипками и обкрепите небольшое отверстие примерно 5 мм проксимальной к поплитеальной ямсе.
   2. Сдвиньте острые ножницы в отверстие и клип к колену, так что разрез заканчивается чуть выше колена. Убедитесь в том, чтобы не проколоть основные сосуды, подняв кожу щипками во время отсечения.
   3. Переместите мышь в положение лежа и продолжайте клип с колена к popliteal ямки до окружного разреза завершена.
2. Вскрыть кожу ниже колена.
   1. Аккуратно тупо вскрыть область ниже колена на пару миллиметров выше лодыжки, медленно открывая и закрывая микроскисора при подъеме кожи щипками.
   2. Тщательно резать оставшиеся видимые спайки с помощью микроскиссор. Используйте стерильный солен регулярно, чтобы сохранить ткань влажной в течение всей процедуры.
3. Вскрыть кожу на проксимальном краю окружного разреза, так что он может быть убран с упругий втягиватель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ретрактор позволяет оператору лучше ею обзор проксимального лимфатического сосуда и предотвращает смещение проксимального обода во время операции.
4. Хотя все еще в положении подвержены, поверните заднюю лимбу осторожно и зафиксировать его с лентой, так что ишиатная вена видна из наиболее проксимальной точки открытой области до наиболее дистальной точки.
5. Вводят примерно 0,01 мл патентного Blue V субкожно между вторым и третьим носом, используя шприц 0,5 мл с иглой 30 G. Аккуратно нажмите на лапу пару раз, чтобы распределить патент Blue V. Визуализировать лимфатические сосуды и лимфатические узлы через микроскоп, как патент Blue V заполняет лимфатические сосуды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если синий цвет лимфатических сосудов исчезает во время процедуры, осторожно массируйте лапу, чтобы способствовать поглощению, а не вводить больше патента Blue V. Чрезмерное использование патента Blue V может привести к утечке и окраске тканей, окружающих лимфатические сосуды, которые могут скомпрометировать процедуру.
6. Найдите важные структуры: поплитовый лимфатический узло (PLN), два лимфатических сосуда дистального лимфатического узла (DLV1 и DLV2), и один лимфатический сосуд проксимальный для лимфатического узла (PLV).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все лимфатические сосуды могут быть найдены рядом с источетической вены. Проксимальный лимфатический сосуд обычно находится медиальным к вене, 2 дистальных лимфатических сосудов найдены медиальными и боковыми к вене. Аббревиальное проемы конструкций используются в сопроводительном видео.
7. Увеличить четко визуализировать PLV и ligate его с 10-0 нейлоновый шов с помощью микро-иглы держатель и микрофорспы. Нажмите на лапу пару раз, чтобы убедиться, что ни один патент Blue V проходит проксималь к шову.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обрезка жира, окружающего лимфатический сосуд может быть необходимо.
8. Повторите шаг 4.7, чтобы свести на нет два дистальных лимфатических сосудов. Нажмите на лапу несколько раз, чтобы убедиться, что ни один патент Blue V не проходит проксималь к лигатуре. Если лимфатические сосуды лежат близко к источенской вены, попробуйте вскрыть еще больше дистально.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере, можно увидеть, что один из лимфатических сосудов разрывается из-за лигатуры, препятствующей лимфатиковому потоку. Лимфатические сосуды часто отделяются от вены дальше вниз.
9. Удалите поплит лимфатический узла.
   1. Найдите поплитический лимфатический узлы и закрепите небольшое отверстие с микросиссорами, чтобы получить к нему доступ и удалить его с помощью микроусилитов и микроскисфоров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лимфатический узла имеет гладкую жемчужную поверхность в отличие от окружающей жировой ткани.
   2. Чтобы проверить, является лимфатическим узлом, поместите его в пробирку, наполненную водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань состоит из жира, ткань будет плавать. Если ткань является лимфатическим узлам, она опустится на дно.
10. Удалите обивку для жира и лимфатических узлов.
    1. Перед удалением пищевого жира, используйте биполярный коагулятор, чтобы прижигать сосуды, протекающие через жир.
    2. Рассекать паховой жировой площадки с помощью микроусилитов и микросциссоров. Аккуратно обрезать прижигаемые сосуды, протекающие через жир. Затем аккуратно резечк фата в области глоток.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Лимфатический узла, расположенный в жире редко окрашены патент blue V и может быть трудно отличить от жира. Удаление жира площадку в один кусок является лучшим способом обеспечить лимфатический узла была удалена.
11. Тщательно промыть ногу стерильным сольнием и подтвердите через микроскоп, что любые маленькие волоски и частицы были тщательно удалены из хирургической области, чтобы избежать заражения ранами и инфекции. Убедитесь, что нет активного кровотечения.
12. Шов края кожи до мышечной facia с 6-0 нейлоновый шов с помощью щипцы и держатель иглы, оставляя разрыв 2'3 мм, чтобы ограничить поверхностный поток лимфы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В сопроводительном видео показан пример готовых швов.
13. Администрирование анальгезии. Нарисуйте 0,1 мл обезболивания на 30 г массы тела мыши. Вводят обезболивание подкожно в виде инъекции болюса.
14. Взвесьте мышь для послеоперационного для сравнения.
15. Поместите мышь в клетку в шкаф с подогревом для восстановления.

5. Послеоперационный уход

1. Дайте мышам отдельные клетки, чтобы восстановить после операции с водой и пищей объявление libitum.
2. Администрирование bolus подкожной дозы 0,02 мл бупренорфина 3x ежедневно в течение 3 дней для обезболивания.
3. Мониторинг животного ежедневно для соответствующего заживления ран, признаки боли и инфекции. Если признаки инфекции присутствуют, используйте антибиотик мазь.

6. Послеоперационное облучение

1. Через три дня после операции повторите процедуру предоперационного облучения (шаги 1.1-1.4).

Результаты

Эта процедура ранее использовалась в трех отдельных экспериментах. Все эксперименты были сделаны различными ведущими следователями, которые все являются соавторами этой статьи. Во всех трех экспериментах было принято большое окоза придерживаться той же процедуры, что и описано в данном протоколе. Во всех трех экспериментах, вторичные лимфедема была индуцирована в одной задней конечности в то время как другие hindlimb служил в качестве контроля. Объемы задних конечностей были основным резу...

Обсуждение

В этом протоколе есть несколько важных шагов. Во-первых, важно, чтобы исследователи принимали меры предосторожности при работе с радиоактивностью. Во-вторых, во время хирургической части этого протокола, важно начать процедуру, как только мышь была обезглавина и закончить его без лишних перерывов. Это важно, чтобы избежать чрезмерно длительного хирургического периода для животного и предотвратить, что анестезия теряет эффект во время операции. Рекомендуется проводить только одну инъекцию болиса обезболиваии и завершать х...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10-0 Нейлоновый шовный материал	S& T	12051-10
6-0 Нейлоновый шовный материал - Dafilon	B Braun	C0933112
Коагулятор - ICC 50	ERBE
Аппликаторы с хлопковыми наконечниками	Yibon medical co
Препарирующие щипцы	Lawton	09-0190
Эластичные ретракторы	Университетская больница Оденсе
Электрическое клипер	Aesculap	GT420
Фентанил 0,315 мг/мл	Матричная
грелка - PhysioSuite	Kent Scientific Corp.
Изофлуран 1000 мг Attane	Scan Vet
Изофлуран вапорайзер - PPV	Penlon
Micro еврейские щипцы	Lawton	1405-05
Микро иглодержатель	Lawton	25679-14
Микро ножницы	Lawton	10128-15
Микро связывающие щипцы	Lawton	43953-10
Шприц Microfine U-40 0,5мл	BD	328821
Шприц Microlance 25г	BD
Шприц Microlance 27г	BD
Мидазолам 5 мг/мл (hameln)	Матрица
Иглодержатель - Circle wood	Lawton	08-0065
Нетканые тампоны	Selefa
Opmi pico microscope F170	Zeiss
Patent blue V - 25 мг/мл	Guerbet
Ножницы - Joseph	BD	RH1630
Siemens INVEON мультимодальный доклинический сканер	Siemens доклинические решения
Siemens Источник излучения - D3100	Gulmay
Stata Статистическое программное обеспечение: Выпуск 15	StataCorp LLC
Temgesic - 0,2 мг	Indivior
Vet глазная мазь - вискозитраы	Bausch & Ломб