Method Article

Идентификация регуляторов транскрипционных факторов с использованием средне-пролимчатого скрининга архиерейных библиотек и репортера на основе двойной люциферазы

DOI:

10.3791/60582

⸱

March 27th, 2020

 , 
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для выявления новых регуляторов транскрипционных факторов, мы разработали подход к экрану массивных лентивирных или ретровирусных рнки библиотек с помощью двойной люциферазы основе транскрипционного репортера ассс. Такой подход предлагает быстрый и относительно недорогой способ проверки сотен кандидатов в одном эксперименте.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Транскрипционные факторы могут изменить экспрессию многочисленных генов-мишеней, которые влияют на различные процессы вниз по течению, что делает их хорошими мишенями для противораковой терапии. Однако, непосредственно ориентации транскрипционных факторов часто трудно и может вызвать неблагоприятные побочные эффекты, если транскрипционный фактор необходим в одной или нескольких взрослых тканей. Выявление восходящих регуляторов, которые аберантно активируют транскрипционные факторы в раковых клетках, предлагает более осуществимую альтернативу, особенно если эти белки легко смягчены. Здесь мы описываем протокол, который может быть использован для объединения массивных среднесрочных лентивирных библиотек и двухлюциферазы основе транскрипционного репортера асссы для выявления новых регуляторов транскрипционных факторов в раковых клетках. Наш подход предлагает быстрый, простой и недорогой способ тестирования сотен генов в одном эксперименте. Чтобы продемонстрировать использование этого подхода, мы выполнили экран массивной лентивирусной библиотеки РНК, содержащей несколько регуляторов ассоциированного белка Yes (YAP) и транскрипционного со-активатора с pd'-связывающим мотивом (ТАЗ), двумя транскрипционными коактиваторами, которые являются эффекторами вниз по течению пути Гиппо. Однако этот подход можно было бы изменить для проверки для регуляторов практически любого фактора транскрипции или со-фактора, а также можно было бы использовать для проверки библиотек CRISPR/CAS9, cDNA или ORF.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этого ассеса заключается в использовании вирусных библиотек для выявления регуляторов транскрипционных факторов относительно быстрым и недорогим способом. Аномальная транскрипционная активность связана с раком и метастазами1,,2,,3,,44,5,,6,поэтому таргетинг факторов транскрипции в раковых клетках является перспективным терапевтическим подходом. Тем не менее, транскрипционные факторы часто трудно ориентировать фармакологически7, и многие из них необходимы для нормальной клеточной функции во взрослых тканях88,9,,10. Ориентация на рак связанных путей, которые аберрантно активировать транскрипционные факторы для привода болезни является более осуществимым подходом с потенциалом иметь менее серьезные побочные эффекты. Коммерческая доступность массивных лентивирных и ретровирусных рнквирных РНК, CRISPR/CAS9, cDNA или ORF библиотек позволяет исследователям проверить важность многочисленных генов в одном эксперименте. Тем не менее, требуется надежное считывание для измененной транскрипционной активности.

Здесь мы описываем использование двойной люциферазы основе транскрипционного репортера анализ и массивные лентивирные библиотеки для выявления белков, которые регулируют транскрипционные факторы в раковых клетках. В этом исследовании, shRNAs, которые нацелены на рак связанных генов поставляются в клетки рака млекопитающих через лентивирусной трансдукции и клетки выбираются для стабильной интеграции с использованием пуромицина. Клетки следующий трансфицируется с репортером построить, что выражает светлячок luciferase управляется промоутер омрачается промоутер конкретных транскрипции фактор, который исследуется и контрольная конструкция, которая выражает Ренилья luciferase от constitutively активный промоутер, который не реагирует на транскрипции фактор исследуется. Мы демонстрируем этот подход с экраном доказательства концепции для регуляторов YAP и ТАЗ, критических эффекторов вниз по течению пути Гиппо8,10,11. Аномальная активность ЯП и ТАЗ способствует нескольким шагам метастатического каскада11 и наблюдается у многих видов рака11,,12,,13. Однако, как YAP и ТАЗ становятся аберантно активированы в некоторых раковых клетках еще не полностью понял. YAP и ТАЗ не связывают ДНК, но вместо этого набираются в промоутеров другими факторами транскрипции. Члены семейства факторов транскрипции TEA (TEAD) являются основными обязательными партнерами для YAP и ТАЗ, и имеют решающее значение для большинства функций, зависящих от YAP и ТАЗ. Наш репортер конструирует светлячок luciferase от YAP/ТАЗ-TEAD-реакционный промоутер и предыдущие изучения показали что оно верно обнаруживает изменения в YAP-TEAD и транскрипционной деятельности TA'-TEAD2,14,15.

Наш подход является быстрым, средней пропускной способностью и не требует скрининга, автоматизированных роботов или глубокого секвенирования объединенных библиотек. Затраты являются относительно низкими, и есть множество коммерчески доступных библиотек на выбор. Необходимое оборудование и реагенты также являются относительно стандартными в большинстве лабораторий. Он может быть использован для проверки для регуляторов практически любого фактора транскрипции, если luciferase основе репортер существует или генерируется. Мы используем этот подход для скрининга shRNAs в раковых клетках, но любая клеточная линия, которая может быть трансфицирована с разумной эффективностью, может быть использована с любым типом массивной библиотеки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое резюме этого протокола показано на рисунке 1.

1. Подготовка лентивирусной векторной библиотеки

ПРИМЕЧАНИЕ: На продемонстрированный экран использовался массивная библиотека shRNA, приобретенная в качестве глицерола в 96-колодцах, но библиотеки также могут быть собраны вручную на основе списка кандидатов. Соответствующие элементы управления должны быть рассмотрены и включены в любую библиотеку. Это включает в себя нетаргетинг контроля shRNA (shNTC), контроль shRNA ориентации транскрипции фактор расследуется, и, если возможно, шРНК ориентации светлячок luciferase.

  1. Добавьте 1,3 мл бульона Лурии (LB) (1% бакто-триптон, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl, pH 7.5), содержащий 100 мкг/мл ампициллина к каждой скважине 96-лугодовой скважины. Прививать каждый колодец с 2 л глицерола бульона и расти на 37 градусов по Цельсию в одночасье с постоянным волнением на 225 об/мин.
  2. Перенесите каждую бактериальную культуру в центрифугу мощностью 1,5 мл и гранулы бактерии центрифугированием при 21 000 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
  3. Очистите каждый вектор с помощью бактериального мини-подготовительного комплекта, следуя протоколу производителя.
  4. Определите концентрацию каждого вектора с помощью спектрофотометра.
  5. Храните плазмиды при -20 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.

2. Упаковка массивной лентивирусной библиотеки

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся работа, связанная с лецивирусом, включая упаковку, инфекцию и последующую культивирование инфицированных клеток, должна строго следовать институциональным правилам и положениям о биобезопасности.

  1. Расширить 293FT клетки с помощью полного роста средств (Dulbecco в модифицированных Eagle среды (DMEM), содержащий 4 мМ L-глютамин, 4500 мг/л глюкозы и пирувата натрия, дополненный 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мЛ стрептомицина антибиотики и 2 мМ L-глютамин).
  2. Для каждого вектора в библиотеке от шага 1.4, семена один 24-ну с 1 х 105 293FT клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы некоторые дополнительные скважины контрольного вирусного вектора были упакованы и использованы для проверки титра вируса до начала шага 3 (см. ниже).
  3. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 на 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий протокол для упаковки лентивирус, который был описан ранее14 был сокращен до 24 скважин для этого протокола. Он использует psPAX2 для лентивирусной упаковки и VSVG в качестве белка пальто. Если пожелает экстропный вирус, вектор доставки Эко может быть использован вместо VSVG. Настоятельно рекомендуется, чтобы этот протокол был оптимизирован для достижения вирусного титра, который дает между 30%-70% эффективность инфекции целевых клеток (см. Обсуждение). Дополнительная таблица 1 для списка всех используемых векторов.
  4. Настроите трансфекционную смесь для каждого вирусного вектора из шага 1.4, как описано ниже. Каждый трансфекциондолжений должен содержать 250 нг вирусного вектора, 125 нг psPAX2, 125 нг VSVG, 1,25 л трансфекционного реагента 1, и 23,75 л буфера трансфекции (см. Таблица материалов).
    1. Разбавить каждый lentiviral вектор до 50 нг / Л с нуклеазой свободной воды, а затем передать 5 кЛ (250 нг) в колодец 96-хорошо ПЦР пластины.
    2. Сделать трансфекционный супер микс, смешивая 1,25 л х трансфекционного реагента 1 и 23,75 л X предварительно подогретого трансфекционного буфера, где "X" является общее количество трансфекций плюс несколько дополнительных для учета потери объема во время трубач.
    3. Инкубировать трансфекционную супермикст при комнатной температуре в течение 5 мин.
    4. Добавьте 125 нг х psPAX2 и 125 нг Х VSVG в трубку трансфекционного супер микса от шага 2.4.3 и аккуратно пайпет вверх и вниз, чтобы смешать. Быстро перейдите к шагу 2.4.5.
    5. Немедленно aliquot смесь от шага 2.4.4 в каждую пробку прокладки PCR, и после этого используйте multi-channel пипетку для того чтобы перенести 25 qL смесь в каждую наилучшим образом содержа вирусный вектор от шага 2.4.1.
    6. Инкубировать при комнатной температуре 20 мин.
    7. Перенесите все 30 КЛ с каждого 96-хорошо от шага 2.4.6 в колодец из 24-ну, содержащей 293 клетки FT от Step 2.3.
  5. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 на 24 ч, а затем заменить средства массовой информации в каждом колодце 24-хорошо пластины с 500 qL свежих средств полного роста. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 еще на 24 ч.
  6. Используя многоканальный пипетка, соберите вирусный супернатант из каждой скважины и aliquot 220 QL (достаточно для 1 инфекции в шаге 3 плюс дополнительный объем) в два 96-колодца каждый. Это массивные вирусные супернатантные пластины.
  7. Храните массивные вирусные супернатантные пластины при -80 градусах По Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Также рекомендуется протестировать некоторые из дополнительных вирусов контроля, который был упакован (см. выше) на клетках, чтобы быть инфицированы, прежде чем приступить к шагу 3. Это необходимо для того, чтобы титр был достаточен для достижения по крайней мере 30% эффективности инфекции.

3. Заражение клеток для экрана

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки меланомы человека (A375) были использованы, чтобы продемонстрировать этот подход, но этот метод может быть применен к любым клеткам приверженцев, которые заражают лентивирусом. Тем не менее, клеточная культура и условия покрытия должны быть оптимизированы для каждой клеточной линии (см. Обсуждение).

  1. Расширьте клетки для заражения в носителях полного роста.
  2. Семена 24-ну с тарелками с 1 х 105 клетками в 0,5 мл полного роста носителя в скважине. Семена один хорошо для каждого вирусного вектора, которые будут проверены (в том числе контроля) и включают в себя дополнительные хорошо, что не будет инфицирован, который будет служить в качестве контроля для выбора наркотиков в шаге 3.7.
  3. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 на 24 ч.
  4. Заразить каждый колодец от шага 3.2 с различными вирусных супернатант из замороженных массивных lentiviral супернатант следующим образом.
    1. Подготовьте полный рост носителя, который содержит 20 мкг/мл полибрена.
    2. Оттепель массивных лентивирусной библиотеки supernatants от шага 2.7 до комнатной температуры.
    3. Аспирировать рост средств массовой информации из 24-коловидной пластины от шага 3.2 и сразу же добавить 200 зл полибреносодержащих средств роста к каждой скважине.
    4. Используя многоканальный пипетку, перенесите 200 qL вирусного супернатанта с каждого 96-хорошо с шага 3.4.2 на 24 скважины от шага 3.4.3.
  5. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 на 24 - 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые клеточные линии могут потребовать сят более 24 ч, чтобы выразить шРНК и стать пуромицин устойчивостью. Вирусный вектор, используемый здесь, обеспечивает Turbo-GFP-IRES-puroR с miR30 основе shRNA в 3'UTR puroR (Рисунок 1). Эффективность инфекции и экспрессия гена устойчивости пуромицин и shRNA были проверены зеленым флуоресцентным белком.
  6. Подготовьте полный рост носителя, который содержит 2,5 мкг/мл пуромицин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация отбора пуромицина варьируется между клеточными линиями. Рекомендуется, чтобы кривая убийства антибиотика была выполнена для каждой линии клеток, чтобы быть проверены до экрана.
  7. Аспирируйте средства массовой информации из каждой скважины и заменить 500 л пуромицин-содержащих полный рост средств массовой информации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте также добавить пуромицин в контроль неинфицированных хорошо, которые могут быть использованы в последующих шагах для обеспечения выбора пуромицин завершена.
  8. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 на 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего выбрать для 48 ч, так что плотность покрытия и вирусный титр должны быть оптимизированы таким образом, чтобы клетки не пересохли до 48 ч.
  9. Убедитесь, что инфицированные клетки зеленые под флуоресцентным микроскопом, и что клетки на контроле неинфицированных хорошо обработаны пуромицин все мертвы, прежде чем приступить к Шаг 4.

4. Посевные клетки для трансфекции двойного люциферазы репортер

ПРИМЕЧАНИЕ: Тест трансфекции должно быть сделано, чтобы определить оптимальную плотность посева для каждой новой линии клеток.

  1. Трипсинизуить каждый колодец от шага 3.9 и передать примерно 1 х 105 клеток в скважины в соответствующем положении на новой 24-хорошо пластины следующим образом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для скрининга библиотек с сотнями shRNAs, так что это не представляется возможным подсчитать каждый колодец инфицированных клеток. Таким образом, приведенные ниже шаги использовались для оценки числа ячеек в каждой скважине, чтобы обеспечить примерно равную плотность покрытия.
    1. Группируйте скважины от шага 3.9 до 3 - 4 групп так, что все скважины в группе имеют сходную плотность клеток.
    2. Трипсинизировать 1 представитель хорошо от каждой группы с 200 зл и л трипсин-EDTA (1x PBS дополнены 0,5 мМ EDTA и 0,1% трипсин) в течение 5 мин при 37 градусов по Цельсию. Затем нейтрализуйте трипсин-ЭДТА, добавив 400 л пуромицина, содержащего полный рост носителей.
    3. Считайте каждого представителя хорошо, чтобы определить общее число клеток и разбавить подвеску ячейки от каждого представителя хорошо 2 х 105 ячеек / мл с помощью полного роста средств массовой информации.
    4. Семена 0,5 мл (1 х 105 клеток) каждого колодца от шага 4.1.3 в соответствующее положение на новой 24-хорошей пластине и инкубировать эту новую 24-колодную пластину при 37 кв с 5% CO2 на 24 ч.
    5. Для каждой группы из шага 4.1.1 используйте общее число клеток, определенное в шаге 4.1.3, чтобы вычислить объем трипсина-EDTA, чтобы добавить к каждой скважине, так что результирующая суспензия ячейки будет 1 х 106 ячеек/мл.
    6. Добавьте соответствующий объем трипсина-ЭДТА к каждой скважине и инкубировать в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для большего экрана рекомендуется, чтобы 24-колодские пластины были промыты и перенапарты в группах, а не все сразу, чтобы обеспечить жизнеспособность клеток.
    7. Во время вышеуказанной инкубации используйте многоканальный пипетку, чтобы добавить 400 qL пуромицинсодержащих полных носителей роста к соответствующим скважинам на новой 24-хорошей пластине.
    8. Передача 100 злиц клеточной подвески (примерно 1 х 105 ячеек) из каждой скважины в соответствующее положение на новых 24-колодцах, подготовленных в шаге 4.1.7.
    9. Повторите шаги 4.1.6 до 4.1.8 для всех плит сгруппированных колодцев от Шага 4.1.1, по одной пластине за раз.
  2. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 на 24 ч.

5. Трансфекция двойного люциферазы репортер

  1. Transfect каждый из шага 4.2 с двойной люциферазы репортер строит следующим образом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество ДНК и оптимальное соотношение светлячковии репортер вектор для контроля Ренилья люциферазы вектор должен быть определен до начала этого анализа. Здесь, 400 нг ДНК смеси, которая содержит 20 частей светлячок luciferase репортер и 1 часть управления Ренилья luciferase был использован.
    1. Сделать трансфекционно-разбавленную смесь (Труба А) и смесь разбавления репортера (Труба B) путем смешивания указанных объемов каждого реагента (Таблица 1) умножается на общее количество трансфекций (плюс несколько дополнительных).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для трансфекционного реагента 2 (см. Таблицу Материалов). Если используется другой трансфекционный реагент, трансфекция должна быть оптимизирована до этого шага.
    2. Смешайте смесь трансфекционного разбавления (Tube A) со смесью разбавления репортера (Труба B) и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут для производства трансфекционной смеси.
    3. Во время вышеуказанной инкубации, промыть каждый 24-хорошо от шага 4.2 с 0.25 мл фосфатного буфера соления (PBS), и добавить 447 л полных носителей роста к каждой скважине.
    4. После инкубации в 15 минут используйте многоканальный пипетки для распределения 53 кЛ трансфекционной смеси для каждой скважины из 24-колодцев.
  2. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 на 24 ч.

6. Количественная оценка активности двойной люциферазы

  1. Измерьте активность luciferase с помощью считывателя пластин и двойного люциферазы репортер ассес комплект, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для указанного набора репортира (см. Таблица материалов)и соответствует рекомендуемому протоколу производителя.
    1. Подготовьте достаточное количество буфера 1x пассивного лизиса для всех скважин плюс несколько дополнительных (75 л необходимо в скважине) путем разбавления 5x пассивный буфер лизиса (при условии в комплекте) от 1 до 5 с деионизированной водой. Также оттепель реагента А и реагента B Buffer (при условии, в комплекте, 100 л каждого необходимо для каждой скважины).
    2. Аспирируй средства массовой информации от каждой скважины из 24-хорошо пластины от шага 5.2.
    3. Добавьте 75 кВ 1x пассивный буфер лисиса к каждой скважине и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут с иногда встряхивания.
    4. Подготовка реагента B путем разбавления 50x реагент B субстрата (при условии, в комплекте) 1:50 с оттаять реагентом B буфера.
    5. Добавьте 30 qL 1x пассивного лисиса буфера на 4 скважины для зачистки (см. Дополнительную таблицу 2).
    6. Передача 30 л lysate от шага 6.1.3 в дубликат скважины 96-хорошо плоский нижний белый асссе пластины.
    7. Используйте многоканальный пипетка, чтобы добавить 50 зл реагента К каждому хорошо и читать светлячок luciferase сигнал с плитой читателя.
    8. Используйте многоканальный пипетка, чтобы добавить 50 qL реагента B от шага 6.1.4 к каждому хорошо и читать сигнал Renilla luciferase с считывателей пластин.
  2. Обработка исходных данных следующим образом (для подробного описания см. Дополнительную таблицу 2).
    1. Исключить образцы с очень низким сигналом Luciferase Ренилья как низкие значения указывают на то, что вирусная конструкция была токсичной или что слишком мало трансинфицированных клеток были анализированы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как поясняется в обсуждении, значительно "низкий" сигнал Ренилья люциферазы может привести к аномальным результатам. Здесь были исключены скважины, в которых сигнал Рениллы люциферазы был более чем на 1 стандартное отклонение ниже среднего (см. Дополнительную таблицу 2). Это было основано на предыдущих исследованиях, проведенных с помощью этой системы репортера в этих клетках14, но может отличаться в других клеточных линиях.
    2. Нормализация сырья светлячок luciferase значение каждого колодца в сырье Ренилья luciferase значение же хорошо, чтобы получить светлячок /Ренилья соотношение.
    3. Средний светлячок /Ренилья отношения всех репликации контрольных скважин, а затем разделить светлячок /Ренилья соотношение любой другой хорошо, что число, чтобы получить раз изменения.
    4. Назначайте контрольный образец и установите его значение соотношениясветлячков/Рениллы к 1.
    5. Среднее соотношениесветлячков/Ренильи дублирующих скважин и участка со стандартным отклонением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартное отклонение не используется для статистического анализа, а вместо этого в качестве средства для выявления скважин, где репликации значительно отличаются.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наша конструкция репортера YAP/TA'-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,,15) содержит минимальный промоутер SV-49 с 5 повторами канонического связывающего элемента TEAD (MCAT)15 за рулем гена светлячком luciferase(рисунок 1). Он совместно трансфицируется в клетки вместе с PRL-TK контрольный вектор (Промега), который выражает Ренилья люцифера...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы демонстрируем подход к скринингу средней пропускной связи массивных вирусных библиотек в сочетании с анализом транскрипционного репортера на основе двойной люциферазы, который может быть использован для выявления и тестирования новых регуляторов транскрипционных факторов. Очень важно охарактеризовать и оптимизировать систему репортеров для каждой ячейки перед любым экраном. Эксперименты должны проводиться для подтверждения того, что репортер реагирует на измененную активность исследуемого транскрип...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Эмили Нортон и Микаэлан Куччарре-Стулигсу за помощь в подготовке векторов шРНК. Эта работа была частично поддержана Сьюзен Г. Komen Карьера Катализатор Грант, который присуждается JML (#CCR17477184).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,0 мл 96-луночный глубокий луночный полипропиленовый планшетСША Scientific1896-2000Для бактериального мини-препарата
Трипсин - 2,50%Gibco15090-046Компонент трипсина-ЭДТА
96 луночный плоский дно белый планшет для анализаCorning3922Для анализа на двойную люциферазу
Ампициллин - 100 мг/млSigma-Aldrich45-10835242001-EAДля бактериального мини-препарата
Бакто-триптон - порошокSigma-Aldrich95039Компонент LB бульона
Двойная люцифераза репортерная система анализа, которая включает в себя реагент LAR II (реагент А), стоп и Glo substrate (реагент B substrate) и Stop & Glo buffer (реагент B buffer) - НаборPromegaE1960Для анализа на двойную люциферазу
фосфатный буферный физиологический раствор Дульбекко без кальция, магния и фенола красного - 9,6 г/лHimediaTS1006Для PBS
EDTA - 0,5 МVWR97061-406Компонент трипсина-ЭДТА
Этанол - 100%Pharmco-AAPER111000200Для бактериального мини-препарата
Foetal Бычья сыворотка - 100%VWR97068-085Компонент полной питательной среды
Гексадиметрина бромид (полибрен) - 8 мг/млSigma-Aldrich45-H9268При вирусной инфекции
HyClone DMEM/High glucose - 4 мМ L-глутамин; 4500 мг/л глюкозы; пируват натрияGE Healthcare Life SciencesSH30243.01Компонент полной питательной среды
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EAМолекулярные приборыДля анализа на двойную люциферазу
L-глютамин - 200% мМGibco25030-081Компонент полной питательной среды
Липофектамин 3000 (Реагент для трансфекции 2) - 100%Life technologiesL3000008Для трансфекций
Молекулярная биология Вода - 100%VWR02-0201-0500Для разведения вектора shRNA для упаковки вируса
NaCl - порошокBDHBDH9286Компонент LB бульона
NanoDrop Один микрообъемный УФ-Вид спектрофотометрТермонаучныйДля измерения концентрации векторной ДНК
Opti-MEM (Буфер для трансфекции) - 100%Gibco31985-062Для трансфекций
Пенициллин Стрептомицин - 10 000 Ед/мл (Пенициллин); 10 000 &; г/мл (Стрептомицин)Gibco15140-122Компонент полной питательной среды
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - НаборThermo Fisher ScientificK210010Для бактериального мини-препарата
Puromycin - 2,5 мг/млSigma-Aldrich45-P7255Для подбора антибиотиков после инфекции
TC20 автоматический счетчик клетокBio-RadДля подсчета клеток
X-tremeGENE 9 Реагент для трансфекции ДНК (Реагент для трансфекции 1) - 100%Roche6365787001Для упаковки вирусов
Экстракт дрожжей - порошокVWRJ850Компонент LB бульон
P3000 (Реагент для трансфекции 3) - 100%Life technologiesL3000008Для трансфекций

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
  3. Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
  4. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
  5. Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
  6. Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
  7. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
  8. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  9. Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
  10. Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
  11. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
  12. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  13. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
  16. Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
  17. Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
  18. de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
  19. Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
  20. Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
  21. Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
  22. Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
  23. Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
  24. Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
  25. Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
  26. Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
  27. Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
  28. Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
  29. Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519(2015).
  30. Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
  31. Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
  32. Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
  33. Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
  34. Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
  35. Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
  36. Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
  37. Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269(2018).
  38. Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
  39. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  40. Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
  41. Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren's syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
  42. Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
  43. He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
  44. Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
  45. Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
  46. Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
  47. Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
  48. Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
  49. Pefani, D. E., O'Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
  50. Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976(2013).
  51. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  52. Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
  53. Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
  54. Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
  55. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transcription Factor RegulatorsMedium Throughput ScreeningArrayed Lentiviral LibrariesDual Luciferase ReporterYAP TAZ RegulationHippo Pathway ScreeningRNAi Library ScreeningViral Vector ProductionLuciferase Activity AssayPuromycin Selection

Related Articles