Method Article

Идентификация регуляторов транскрипционных факторов с использованием средне-пролимчатого скрининга архиерейных библиотек и репортера на основе двойной люциферазы

DOI:

10.3791/60582

⸱

March 27th, 2020

 , 
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для выявления новых регуляторов транскрипционных факторов, мы разработали подход к экрану массивных лентивирных или ретровирусных рнки библиотек с помощью двойной люциферазы основе транскрипционного репортера ассс. Такой подход предлагает быстрый и относительно недорогой способ проверки сотен кандидатов в одном эксперименте.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Транскрипционные факторы могут изменить экспрессию многочисленных генов-мишеней, которые влияют на различные процессы вниз по течению, что делает их хорошими мишенями для противораковой терапии. Однако, непосредственно ориентации транскрипционных факторов часто трудно и может вызвать неблагоприятные побочные эффекты, если транскрипционный фактор необходим в одной или нескольких взрослых тканей. Выявление восходящих регуляторов, которые аберантно активируют транскрипционные факторы в раковых клетках, предлагает более осуществимую альтернативу, особенно если эти белки легко смягчены. Здесь мы описываем протокол, который может быть использован для объединения массивных среднесрочных лентивирных библиотек и двухлюциферазы основе транскрипционного репортера асссы для выявления новых регуляторов транскрипционных факторов в раковых клетках. Наш подход предлагает быстрый, простой и недорогой способ тестирования сотен генов в одном эксперименте. Чтобы продемонстрировать использование этого подхода, мы выполнили экран массивной лентивирусной библиотеки РНК, содержащей несколько регуляторов ассоциированного белка Yes (YAP) и транскрипционного со-активатора с pd'-связывающим мотивом (ТАЗ), двумя транскрипционными коактиваторами, которые являются эффекторами вниз по течению пути Гиппо. Однако этот подход можно было бы изменить для проверки для регуляторов практически любого фактора транскрипции или со-фактора, а также можно было бы использовать для проверки библиотек CRISPR/CAS9, cDNA или ORF.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этого ассеса заключается в использовании вирусных библиотек для выявления регуляторов транскрипционных факторов относительно быстрым и недорогим способом. Аномальная транскрипционная активность связана с раком и метастазами1,,2,,3,,44,5,,6,поэтому таргетинг факторов транскрипции в раковых клетках является перспективным терапевтическим подходом. Тем не менее, транскрипционные факторы часто трудно ориентировать фармакологически7, и многие из них ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое резюме этого протокола показано на рисунке 1.

1. Подготовка лентивирусной векторной библиотеки

ПРИМЕЧАНИЕ: На продемонстрированный экран использовался массивная библиотека shRNA, приобретенная в качестве глицерола в 96-колодцах, но библиотеки также могут быть собраны вручную на основе списка кандидатов. Соответствующие элементы управления должны быть рассмотрены и включены в любую библиотеку. Это включает в себя нетаргетинг контроля shRNA (shNTC), контроль shRNA ориентации транскрипции фактор расследуется, и, если возможно, шРНК ориентации светлячок luciferase....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наша конструкция репортера YAP/TA'-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,,15) содержит минимальный промоутер SV-49 с 5 повторами канонического связывающего элемента TEAD (MCAT)15 за рулем гена светлячком luciferase(рисунок 1). Он совместно трансфицируется в клетки вместе с PRL-TK контрольный вектор (Промега), который выражает Ренилья люцифера.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы демонстрируем подход к скринингу средней пропускной связи массивных вирусных библиотек в сочетании с анализом транскрипционного репортера на основе двойной люциферазы, который может быть использован для выявления и тестирования новых регуляторов транскрипционных факторов. Очень важно охарактеризовать и оптимизировать систему репортеров для каждой ячейки перед любым экраном. Эксперименты должны проводиться для подтверждения того, что репортер реагирует на измененную активность исследуемого транскрип.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Эмили Нортон и Микаэлан Куччарре-Стулигсу за помощь в подготовке векторов шРНК. Эта работа была частично поддержана Сьюзен Г. Komen Карьера Катализатор Грант, который присуждается JML (#CCR17477184).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,0 мл 96-луночный глубокий луночный полипропиленовый планшетСША Scientific1896-2000Для бактериального мини-препарата
Трипсин - 2,50%Gibco15090-046Компонент трипсина-ЭДТА
96 луночный плоский дно белый планшет для анализаCorning3922Для анализа на двойную люциферазу
Ампициллин - 100 мг/млSigma-Aldrich45-10835242001-EAДля бактериального мини-препарата
Бакто-триптон - порошокSigma-Aldrich95039Компонент LB бульона
Двойная люцифераза репортерная система анализа, которая включает в себя реагент LAR II (реагент А), стоп и Glo substrate (реагент B substrate) и Stop & Glo buffer (реагент B buffer) - НаборPromegaE1960Для анализа на двойную люциферазу
фосфатный буферный физиологический раствор Дульбекко без кальция, магния и фенола красного - 9,6 г/лHimediaTS1006Для PBS
EDTA - 0,5 МVWR97061-406Компонент трипсина-ЭДТА
Этанол - 100%Pharmco-AAPER111000200Для бактериального мини-препарата
Foetal Бычья сыворотка - 100%VWR97068-085Компонент полной питательной среды
Гексадиметрина бромид (полибрен) - 8 мг/млSigma-Aldrich45-H9268При вирусной инфекции
HyClone DMEM/High glucose - 4 мМ L-глутамин; 4500 мг/л глюкозы; пируват натрияGE Healthcare Life SciencesSH30243.01Компонент полной питательной среды
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EAМолекулярные приборыДля анализа на двойную люциферазу
L-глютамин - 200% мМGibco25030-081Компонент полной питательной среды
Липофектамин 3000 (Реагент для трансфекции 2) - 100%Life technologiesL3000008Для трансфекций
Молекулярная биология Вода - 100%VWR02-0201-0500Для разведения вектора shRNA для упаковки вируса
NaCl - порошокBDHBDH9286Компонент LB бульона
NanoDrop Один микрообъемный УФ-Вид спектрофотометрТермонаучныйДля измерения концентрации векторной ДНК
Opti-MEM (Буфер для трансфекции) - 100%Gibco31985-062Для трансфекций
Пенициллин Стрептомицин - 10 000 Ед/мл (Пенициллин); 10 000 &; г/мл (Стрептомицин)Gibco15140-122Компонент полной питательной среды
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - НаборThermo Fisher ScientificK210010Для бактериального мини-препарата
Puromycin - 2,5 мг/млSigma-Aldrich45-P7255Для подбора антибиотиков после инфекции
TC20 автоматический счетчик клетокBio-RadДля подсчета клеток
X-tremeGENE 9 Реагент для трансфекции ДНК (Реагент для трансфекции 1) - 100%Roche6365787001Для упаковки вирусов
Экстракт дрожжей - порошокVWRJ850Компонент LB бульон
P3000 (Реагент для трансфекции 3) - 100%Life technologiesL3000008Для трансфекций

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transcription Factor RegulatorsMedium Throughput ScreeningArrayed Lentiviral LibrariesDual Luciferase ReporterYAP TAZ RegulationHippo Pathway ScreeningRNAi Library ScreeningViral Vector ProductionLuciferase Activity AssayPuromycin Selection

Related Articles