Несмотря на давний интерес к происхождению разнообразия животных, мы имеем ограниченное представление о генетических изменениях, лежащих в основе эволюции морфологии, физиологии и поведения. Мексиканская тетра, Astyanax mexicanus, стала мощной моделью для дальнейшего понимания того, как развиваются черты. Этот вид рыб существует в виде двух морфотипов: глазая речная морфа (поверхностная рыба), которая в изобилии встречается в реках Мексики и Южного Техаса, и безглазая пещерная морфа (пещерная рыба), которая процветает в вечно темных известняковых пещерах в регионе Сьерра-дель-Абра на северо-востокеМексики. Известно 29 пещерных популяций, которые произошли по крайней мере от двух независимых наземных инвазий рыб 2,3. Пещерные и речные морфы остаются взаимоплодородными и их легко разводить в лаборатории, что позволяет исследователям генетически отобразить черты, которые развиваются в ответ на уникальное селективное давление в пещере. Например, отсутствие света привело к регрессии глаз 4,5,6,7,8,9, пигмента 10,11,12,13,14 и сна 15,16,17,18,19; Ограничение питательных веществ выбрано для переедания20, набора веса21 и накопления жира22; А навигация в темноте способствовала повышению способности ощущать окружающую среду 23,24,25,26,27,28. Все большее число исследователей используют эту рыбу для изучения генетических основ эволюции. Поскольку некоторые черты, которые являются адаптивными у пещерных рыб, вредны для человека, пещерная рыба также стала привлекательной для биомедицинских исследований 21,29,30,31. С целью повышения воспроизводимости и предоставления платформы для новых исследователей, эта коллекция методов JoVE предоставляет методы для содержания животных, измерения признаков и изучения активности генов.
В качестве отправной точки можно привести процедуру экстракорпорального оплодотворения, продемонстрированную Peuß et al. Фиг.32 служит нескольким целям, поскольку он обеспечивает способ получения 1) гибридов пещеры/поверхности, которые могут быть трудно разводить, 2) эмбрионов на одноклеточной стадии для микроинъекций и 3) образцов для анализа эмбриональных фенотипов. A. mexicanus обычно нерестится ночью. Peuß et al. Опишите систему для изменения цикла света и темноты и получения рыб, подготовленных к сбору гамет в обычное рабочее время. Их визуальная демонстрация сбора гамет особенно полезна, поскольку этот шаг требует тщательной техники. Их статья имеет важное значение для ряда последующих приложений, включая сравнение паттернов экспрессии генов во время эмбриогенеза.
Luc et al. На фиг.33 представлен надежный протокол гибридизации in situ, оптимизированный для визуализации экспрессии генов в эмбрионах A. mexicanus . Они упрощают эту многодневную процедуру с помощью контрольного списка (предоставляется в виде дополнительного файла) и делятся рекомендациями по устранению неполадок. В дополнение к этому методу, Riddle et al. 34 показано, как исследовать экспрессию генов и локализацию белков у вылупившихся рыб с помощью иммуногистохимии Wholemount. Чтобы сделать значимые сравнения между морфотипами после вылупления и начала кормления, необходимо контролировать условия роста. Они показывают, как разводить взрослых особей с помощью естественного нереста и выращивать личинок с фиксированной плотностью на диете коловраток, которая имеет значительные преимущества по содержанию питательных веществ и стоимости по сравнению с другими источниками пищи. Их протокол иммуноокрашивания успешно распознает антигены в мозге, кишечнике и поджелудочной железе уже через 12 дней после вылупления, что позволяет исследовать поздние стадии развития и функции органов. Важно отметить, что они предоставляют список антител, которые были успешно использованы у A. mexicanus. Комбинированные методы Luc et al. и Riddle et al. полезны для анализа эффектов генетических манипуляций.
В этой коллекции методов Шталь и др. 35 описываются различные способы манипулирования функцией генов у A. mexicanus , в том числе: микроинъекция морфолино, мутагенез, опосредованный CRISPR-Cas9, и Tol2-опосредованный трансгенез. В дополнение к демонстрации пикоинъекции и скрининга инъекционных эмбрионов, они предоставляют полезные рекомендации по конструированию морфолин, направляющих РНК и трансгенов. Они делятся результатами, которые подтверждают каждый из этих методов. Например, нацеливание на гипокретин/орексин (HCRT) с помощью морфолино, блокирующего сплайсинг, снижает локомоторную активность и увеличивает сон у пещерных рыб; редактирование oca2 (причинный локус альбинизма пещерных рыб) у поверхностных рыб с использованием CRISPR/Cas9 приводит к образованию поверхностных рыб-альбиносов; а введение генетически кодируемого индикатора кальция, управляемого паннейрональным промотором данио-рерио с использованием трансгенеза Tol2, позволяет достичь почти повсеместной экспрессии нейронов у мексиканской тетры. Они отмечают, что многие генетические инструменты, разработанные у рыбок данио, могут быть напрямую переданы пещерным рыбам из-за их схожих геномов. Их статья является важным ресурсом для исследователей, проводящих функциональные исследования A. mexicanus , и дополняет дополнительные статьи, посвященные измерению фенотипов, включая поведение.
У пещерных рыб резко сократился сон и изменился циркадный ритм 36,37,38. Это дает прекрасную возможность исследовать вклад генетики и окружающей среды в изменение сна у позвоночных. Jaggard et al. 39 показано, как построить систему из недорогих материалов, которую можно использовать для записи сна на разных этапах жизни и в разных контекстах. Кроме того, они описывают, как автоматизировать отслеживание рыбы в этой системе и получить количественные измерения сна и локомоции. Их метод применим для высокопроизводительного скрининга лекарств и генетического скрининга, а также для традиционных исследований генетического картирования.
В дополнение к снижению сна, у пещерных рыб развились различия в локомоторной активности, связанной с поиском пищи, включая изменение угла кормления и вибрационное притяжение 16,30,40. Центральное место в понимании того, как развивались эти виды деятельности, является связь их с изменениями в развитии. Worsham et al. 41 представлены методы регистрации поведения и корреляции их с изменениями в невромастах; внешние механосенсорные структуры, которые реагируют на поток воды. Сначала они показывают, как создавать камеры для регистрации вибрации, притяжения и сна, а также подробно описывают, как количественно оценить поведение с помощью свободного программного обеспечения и настраиваемых скриптов. Затем они демонстрируют, как визуализировать невромасты у живых взрослых рыб с помощью флуоресцентного митохондриального окрашивания, и снова, используя бесплатное программное обеспечение, как количественно определить количество невромастов полуавтоматическим способом. Вибрационное притяжение и число нейромачты коррелируют23; Их метод обеспечивает пошаговый протокол для исследования этой взаимосвязи. Методы Джаггарда и Уоршема могут быть использованы для выявления дополнительных моделей поведения, а также могут быть применены к другим видам рыб. Эти методы дают количественные и последовательные результаты, которые необходимы для открытия генетической основы поведенческой эволюции.
Современные методы измерения и манипулирования функциями генов подтолкнули эволюционные исследования от сравнительных к механистическим. В совокупности статьи этого сборника методов служат руководством для проведения исследований функции генов у A. mexicanus. В то время как исследователи обнаружили удивительные различия в морфологии, физиологии и поведении между поверхностными и пещерными морфами, есть много особенностей, которые еще предстоит изучить подробно и, вероятно, еще больше обнаружить. По мере того, как будет проделана дополнительная работа, эта маленькая рыбка будет продолжать оказывать большое влияние на наше понимание эволюции.