Визуализация развивающегося мозга в жизни зебрафиш с помощью Brainbow и замедленного Confocal imaging

Summary

In vivo изображение является мощным инструментом, который может быть использован для исследования клеточных механизмов, лежащих в основе развития нервной системы. Здесь мы описываем метод использования замедленной конфокальной микроскопии для визуализации большого количества многоцветных Brainbow-маркированных клеток в режиме реального времени в развивающейся нервной системе зебры.

Abstract

Развитие позвоночной нервной системы требует точной координации сложного клеточного поведения и взаимодействий. Использование методов визуализации с высоким разрешением vivo может обеспечить четкое окно в эти процессы в живом организме. Например, за делением клеток и их потомством можно следовать в режиме реального времени по мере образования нервной системы. В последние годы технические достижения в области многоцветных методов расширили типы вопросов, которые могут быть исследованы. Многоцветный подход Brainbow может быть использован не только для различения между подобными клетками, но и для цветового кода нескольких различных клонов родственных клеток, каждый из которых происходит из одной клетки-прародителя. Это позволяет мультиплекс линии анализа многих различных клонов и их поведения одновременно во время разработки. Здесь мы описываем метод использования замедленной конфокальной микроскопии для визуализации большого количества многоцветных Brainbow-маркированных клеток в реальном времени в развивающейся нервной системе зебры. Это особенно полезно для следующих клеточных взаимодействий между клетками, которые трудно обозначить дифференциально с помощью традиционных промоутер-управляемых цветов. Наш подход может быть использован для отслеживания отношений линии между несколькими различными клонами одновременно. Большие наборы данных, генерируемые с помощью этого метода, предоставляют богатую информацию, которую можно количественно сравнить с генетическими или фармакологическими манипуляциями. В конечном счете полученные результаты могут помочь ответить на систематические вопросы о том, как развивается нервная система.

Introduction

На ранних стадиях развития пулы специализированных клеток-прародителей делятся повторно в пролиферативных зонах, производя различные массивы дочерческих клеток. Клетки, рожденные в течение этого периода развития, затем дифференцируются и путешествуют, чтобы сформировать зарождающиеся органы. В нервной системе, прародители, такие как радиальная глия привести к незрелых нейронов в желудочковых зонах. По мере того как нейроны мигрируют от желудочков и созревают, расширяющаяся ткань в конечном итоге образует очень сложные структуры мозга^1,,2,,33,4

Protocol

Процедуры, касающиеся животных, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) в Колледже Льюиса и Кларка.

1. Микроинъекция эмбрионов зебрафиш

1. Настройка дикого типа, взрослых зебры в секс-сегрегированных спаривания танков во второй половине дня до выполнения микроинъекций^39,40.
2. Подготовьте раствор ДНК утром микроинъекций. Разбавить hsp:Зебрабоу¹¹ плазмид ДНК в концентрации 10 нг / Л в 0,1 мМ KCl, наряду с 2,5% фенола красного и 3,75U Cre recombinase фермента.
3. Выполните микроинъекц....

Results

В этом разделе иллюстрируются примеры результатов, которые можно получить с помощью описанного здесь многоцветного подхода in vivo. Мы показываем, что Brainbow цветные клоны клеток в пролиферативной желудочковой зоне развивающихся зебры задний мозг¹⁴ (Рисунок 1).

Как правило, когда Brainbow помечены клетки были расположены вдоль конкретного радиального волокна, они разделяют тот же цвет(рисунок 1D), которые мог.......

Discussion

Этот протокол описывает метод визуализации клонов клеток-прародителей и нейронов в развивающихся задней мозг зебры и следовать за ними in vivo с помощью Brainbow и замедленной конфокальной микроскопии¹¹. Основным преимуществом этого протокола по сравнению с исследованиями in vitro или ex vivo является способность непосредственно наблюдать за пролиферативной зоной мозга позвоночных в его естественной среде с течением времени. Этот метод основан на предыдущих исследованиях, которые помечены одного к.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Переводная пипетка объемом 1,5 мл (тонкий наконечник)	Globe Scientific, Inc.	134020
1-фенил-2-тиомочевина (PTU)	Alfa Aesar	L06690	Разведенный до 0,2 мМ в E3 для предотвращения пигментации эмбриона
50 мл конические трубки	Corning	352070	Для термошока эмбрионов
6 фунтов нейлоновая леска	SecureLine	NMT250	Для изготовления манипуляторов для
переноса эмбрионов 7,5 мл перенос пипеток	Globe Scientific, Inc.	135010
CaCl2	Sigma	C3881	Для
ватных палочек	Puritan	867-WC NO GLUE	Для изготовления манипуляторов
эмбрионов Cre recombinase	New England Biolabs	M0298M
Цифровая сухая ванна	Genemate	490016-616	Используется для хранения LMA при температуре 42 ° C
			для эпифлуоресцентной диссекции
Стеклянные капиллярные трубки	World Precision Instruments	TW100F-4
Инкубатор	Forma Scientific	3158	Для сохранения эмбрионов при температуре 28 градусов и градусов; C
Формы для литья под давлением	Adaptive Science Tools	TU-1
Isotemp водяная баня	Fisher Scientific	2320	Для термошока эмбрионов
KCl	AMRESCO	0395	Для E3 и для ДНК раствор для инъекций
Лазерно-сканирующий конфокальный микроскоп	Zeiss	LSM710
LE agarose	Genemate	E3120	Для создания пластины для впрыска агарозы
с низким содержанием расплава (LMA)	AMRESCO	J234
Сопрягаемые резервуары	Aquaneering, Inc.
Метиленовый синий	Sigma	M9140	для E3
MgSO4	Sigma	9397	для
микроманипулятора	World Precision Instruments	M3301
Пуллер микропипеток	Sutter Instrument Co.	P-97
MS-222 Трикейн-С	Вестерн Кемикал, Инк.		Бульон изготовлен из расчета 4 мг/мл в воде обратного осмоса (RO), затем добавлен по каплям в E3 до конечной концентрации 0,2 мМ для обезболивания эмбрионов
NaCl	J.T. Baker	4058-01	Для E3
чашки Петри (90 мм, 60 мм)	Genesee Scientific	32-107G	Для размещения эмбрионов и создания камеры визуализации (60 мм)
Phenol red Sigma		P0290
Маркеры	для колец с мягким швомКлевер Иглкрафт, Инк.	354	Для создания камеры визуализации с чашкой Петри
Супер клей (Ultra gel control)	Loctite	1363589	Для изготовления манипуляторов эмбрионов
Иглы шприцевые	Beckton Dickinson	BD329412	Для дехорионизации эмбрионов