Методическая статья

Мониторинг PD-1-Блокирование антител, связанных с Т-клеток, полученных от капли периферической крови

5.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60608

⸱

5 февраля 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine and Clinical Immunology, Osaka University Graduate School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Мы разработали простой анализ цитометрии потока для оценки связывания PD-1-блокирующих антител к Т-клеткам, требуя только капли периферической крови от онкологических больных.

Аннотация

Ингибиторы иммунных контрольных точек, в том числе PD-1-блокирующие антитела, значительно улучшили результаты лечения при различных видах рака. Фармакологическая эффективность этих иммунотерапевтических препаратов является длительной, простирающейся даже после прекращения их инъекций, из-за постоянной концентрации крови. Здесь мы разработали простой анализ цитометрии потока для оценки Т-клеточного связывающего статуса PD-1-блокирующих антител ниволумаба и пембролизумаба. Как тест глюкозы, этот анализ требует только одну каплю периферической крови. Визуализация связывания антител на Т-клетках надежнее, чем измерение концентраций в крови антител. Кроме того, при необходимости, мы можем потенциально проанализировать многие отличительные иммунных маркеров на Т-клеток, связанных с PD-1-блокирующих антител. Таким образом, это простая и минимально инвазивная стратегия для анализа фармакологического эффекта PD-1-блокирование антител у онкологических больных.

Введение

PD-1-блокирующие антитела стали стандартным выбором для лечения различных видов рака, в том числе немелкоклеточного рака легких (NSCLC)1,2,3,4. Они показывают замечательный терапевтический эффект в подмножестве больных раком, которые не ответили на обычные цитотоксические химиотерапии. Тем не менее, ингибиторы иммунной контрольной точки (ИКИ), которые включают PD-1-блокирующие антитела, может вызвать уникальный и четкий спектр побочных явлений, называемых иммунных побочных явлений (irAEs)5. Хотя irAEs может повлиять почти на все ткани, они чаще всего наблюдаются в желудочно-кишечном тракте, эндокринных желез, кожи и печени, и они могут вызвать зуд, сыпь, тошнота, диарея, и расстройства щитовидной железы6,7. В целом, большинство irAEs появляются в течение 1 до 2 месяцев после начала ИКИ. Однако в некоторых случаях они могут возникнуть позднее, чем через 1 год после начала лечения или даже после прекращения лечения6,7. Они также вызывают различные симптомы, которые могут быть трудно дискриминировать от других патологий. Таким образом, это может быть сложной задачей для оперативной диагностики irAEs и лечить их надлежащим образом. irAEs может повлиять на все ткани, и их начало сильно зависит от циркулирующих иммунных клеток, особенно Т-клеток, связанных с PD-1-блокирующих антител. Таким образом, простой и минимально инвазивный метод для мониторинга антител целевых Т-клеток имеет важное значение в клинических условиях.

Здесь мы разработали простой метод оценки связывания PD-1-блокирующих антител к Т-клеткам с помощью капли периферической цельной крови от онкологических больных, которые получали ниволумаб или пембролизумаб. Используя этот подход, мы смогли контролировать каждый из следующих: 1) продолжительность связывания антител к Т-клеткам, 2) заполняемость т-клеток PD-1 молекул терапевтических антител, и 3) состояние активации и иммунологические особенности Т-клеток. Этот метод является модификацией ранее сообщалось техники8. Количество крови требуется почти так же, как и необходимо для теста глюкозы, и подход не требует моноядерного обогащения клеток или со-культивирования с PD-1-блокирующих антител. Мы подтвердили, что этот метод также может быть выполнен с использованием замороженных образцов, в том числе периферических моноядерных клеток крови (PBMCs) и клеток из плеврального выпота, перикардиального выпота, бронхоальвеолярной жидкости для лаважа и спинномозговой жидкости, предполагая, что эта стратегия может быть полезна в контексте многоцентрового исследования. Этот метод может облегчить раннюю диагностику irAEs, а также помочь определить соответствующие иммуносупрессивные методы лечения для контроля их симптомов и определить оптимальное время для начала последующей терапии после ингибиторов PD-1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Выборка проводилась во время обычных клинических процедур. Все образцы человека были получены после получения информированного согласия субъектами в соответствии с Хельсинкской декларацией и с одобрения совета по этике Высшей школы медицины, Университета Осаки, Япония (15383 и 752).

1. Подготовка образца крови и окрашивание

  1. Сбор образцов всей крови в трубки для сбора крови, содержащие этилен диамин тетра-ацетической кислоты (ЭДТА).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор крови может быть выполнен с помощью обычной иглы или крови ланцет.
  2. Передача 20 Зл образцов цельной крови в 5 мл круглого дна полистирола потока цитометрии труб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для уменьшения неспецифической связывания клеток к трубам, 1 мл 2% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) в фосфат буферном сольнике (PBS) добавляется в трубки и вихрей в течение 10 с до нанесения на образцы.
  3. Добавьте 20 зл 2% FBS в PBS.
  4. Добавьте 10 злителк реагента для блокирования fcR для конкретных людей. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
  5. Добавьте 500 л буфера лиза из красных кровяных телец. Хорошо перемешайте и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
  6. Добавьте 4 мл 2% FBS в PBS и вращайте вниз клетки при 400 х г (1500 об/мин) в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Удалите супернатант по аспирации.
  7. Повторите процесс мытья и аспирации, описанный в шаге 1.6.
  8. Повторно приостановить клетки в 100 Л л 2% FBS в PBS и разделить на две трубки по 50 л каждый.
  9. Добавить поверхностный маркер антител(Таблица 1). Хорошо перемешайте и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При профилировании иммунного статуса Т-клеток, количество маркеров может быть увеличено на основе качества цитометрии цитометрии потока.
  10. Вымойте образцы 2x, как описано в шаге 1.6.
  11. Повторное отемки клеток в 200 л 2% FBS в PBS.

2. Циклометрический анализ потока

  1. Вставьте трубки в цитометр потока и приобретете клетки, в основном следуя рекомендуемому протоколу9.
  2. Запись 10000 событий, как лимфоцитов ворота (Рисунок 1А) и данные о потоке экспорта, как файлы .fcs для анализа.
  3. Откройте файлы в программном обеспечении для анализа. Визуализация клеток на переднем рассеянии (FSC) (A) против бокового рассеяния (SSC) (A) участка и лимфоцитов ворот(рисунок 1A).
  4. После выбора одиночных ячеек с использованием FSC (H) против FSC (W) и SSC (W)(рисунок 1B)и отображения их на CD3 против CD8 или CD3 против cd4 сюжета, ворота CD8 T-клеток и CD4 T-клеток, соответственно(рисунок 1C).
  5. После выбора закрытых ячеек и отображения их на PD-1 против человека IgG4 участок, определить PD-1-блокирование антител связаны CD8 и CD4 Т-клетки на основе контроля изотипа(Рисунок 1D).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Стратегия gating и анализ цитометрии потока(Рисунок 1) может обнаружить PD-1-блокирующий связывание антител к Т-клеткам, полученным от капли периферической крови пациента NSCLC. Перед PD-1-блокирующий антитела вводят, нет человека IgG4-положительных CD8 или CD4 Т-клетки присутствуют, и PD-1 выражение может быть подтверждено PD-1-обнаружение антитела (EH12.1) (Рисунок 2A). После введения ниволумаба или пембролизумаба, IgG4 (ниволумаб, пембролизум...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье мы сообщаем метод с помощью цитометра потока для обнаружения PD-1-блокирующих антител, связанных с Т-клетками, полученными из капли периферической крови, которую мы первоначально разработали для обнаружения ниволумаба10. Хотя этот метод очень прост и прост в выполнении, следует отметить два важных момента для получения точных результатов. Один из них заключается в том, что для обнаружения молекул PD-1 следует использовать соответствующее антитело, которое конкурирует с ниволумабом и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами С.К. от Японского общества содействия науке KAKENHI (JP17K16045) и Японского агентства медицинских исследований и разработок (JP18cm0106335 и 19cm0106310).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10X Буфер для лизиса эритроцитов (многовидовой)Thermo Fisher Scientific00-4300-5450 мл
APC/Cyanine7 антитела к CD4 человекаBioLegend300518клон RPA-T4
BD FACS Canto II проточный цитометрBD
Brilliant Violet 510 антитело против человеческого CD8aBioLegend301048клон RPA-T8
фосфата Дульбекко Буферный физиологический растворnacalai tesque14249-95500 мл
Falcon Круглодонные полистирольные пробиркиSTEMCELL Technologies3520585 мл
FcR Блокирующий реагент, человеческийMiltenyi Biotec130-059-9012 мл
FLOWJOBD
Gibco Фетальная бычья сывороткаThermo Fisher Scientific12676029500 мл
Мышь IgG1 моноклональная - контроль изотипаabcamab81200
Мышь моноклональная Античеловек IgG4 Fcabcamab99825Клон HP6025
Тихоокеанская голубая мышь Античеловек CD3BD558117Клон UCHT1
PE-Cy7 Мышь против человека CD279 (PD-1)BD561272Клон EH12.1
PE-Cy7 Мышь IgG1 κ Управление изотипомBD557646

Ссылки

  1. Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8(2018).
  2. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  3. Brahmer, J., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).
  4. Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
  5. Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade. The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).
  6. Weber, J. S., et al. Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).
  7. Champiat, S., et al. Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper. Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).
  8. Brahmer, J. R., et al. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).
  9. Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma. Journal of Biological Methods. 6 (2), 112(2019).
  10. Osa, A., et al. Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients. JCI Insight. 3 (19), 59125(2018).
  11. Zelba, H., et al. Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).
  12. Simoni, Y., et al. Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates. Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).
  13. Chiu, H. H., et al. Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS. Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи