Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Приготовление SNS Cobalt (II) Пинцер Модель комплексов печени Алкоголь Дегидрогеназы

6.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60668

⸱

19 марта 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Fairfield University, 2Department of Chemistry, Keene State College

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлена подготовка модельных комплексов SNS-клещевого кобальта (II) дегидрогеназы печени. Комплексы могут быть подготовлены путем реагирования на лигандовый предшественник с CoCl2No6H2O, а затем могут быть recrystallized, позволяя диэтил эфир медленно диффузного раствора, который содержит комплекс кобальта.

Аннотация

Химические модельные комплексы подготовлены для представления активного участка фермента. В этом протоколе, семейство трезубца клещевых лиганских прекурсоров (каждый из которых обладает двумя серными и одними атомными функциональными возможностями атома азотного донора (SNS) и на основе бис-имидазола или бис-триазола соединений) металлоконструкции с CoCl26H2O, чтобы позволить себе трезубца SNS pincer кобальта кобальта (II) комплексов. Приготовление кобальтовых (II) модельных комплексов для дегидрогеназы печени является легкой. На основе быстрого изменения цвета при добавлении CoCl2No 6H2O в ацетонитрил решение, которое содержит лиганд овый предшественник, комплекс формируется быстро. Формирование металлического комплекса завершено после того, как раствор может рефлюкс ночь. Эти кобальтовые (II) комплексы служат образцом для активного участка цинка в дегидрогеназе печени (LADH). Комплексы характеризуются с использованием однокристаллической рентгеновской дифракции, масс-спектрометрии электроспрей, ультрафиолетовой видимой спектроскопии и элементарного анализа. Для точного определения структуры комплекса необходимо определить его единую кристаллическую структуру. Одиночные кристаллы комплексов, пригодных для рентгеновской дифракции, затем выращиваются с помощью медленного распространения диэтилового эфира в раствор ацетонитрила, который содержит комплекс кобальта (II). Для кристаллов высокого качества, recrystallization типично осуществляет над периодом 1 недели, или более длиной. Метод может быть применен к подготовке других модельных координационных комплексов и может быть использован в учебных лабораториях. Наконец, считается, что другие могут найти этот метод рекристаллизации для получения отдельных кристаллов полезным для их исследований.

Введение

Целью представленного метода является подготовка маломолекулярных аналогов LADH для дальнейшего понимания каталитической активности металлоэнзимов. LADH является димерическим ферментом, который содержит кофакторно-связывающий домен и цинк (II) металлосодержащий каталитический домен1. LADH, в присутствии кофактора NADH, может уменьшить кетоны и альдегиды до их соответствующих производных алкоголя2. В присутствииNAD, LADH может выполнять обратный катализ окисления спиртов кетонов и альдегидов2. Кристаллическая структура активного участка LADH показывает, что его цинк (II) металлический центр связан с одним атомом азота, предоставляемым гистидиновой боковой цепью и двумя атомами серы и предлагаемых двумя цистеиновыми лигандами3. Дальнейшие исследования показали, что центр цинка металла ligated с молекулой воды лабильно, в результате чего псевдо-тетраэдральной геометрии вокруг металлического центра4.

Мы ранее сообщали и использовали Прекурсоры SNS pincer ligand, а также металлоконструкции лигандовых прекурсоров с комплексами NCl2, чтобы сформировать комплексы ,n(II), которые содержат прекурсор трезубца ligand5,,6,7. Эти лиганды предшественники показаны на рисунке 1. Эти цинковые комплексы продемонстрировали активность для стойхиометрического сокращения электроно-бедных альдегидов и, таким образом, являются модельными комплексами для LADH. Впоследствии, синтез и характеристика серии медных (I) и медных (II) комплексов, которые содержат Прекурсоры SNS ligand были зарегистрированы8,,9,10.

Хотя LADH является ферментом цинка (II), мы заинтересованы в подготовке кобальтовых (II) модельных комплексов LADH для получения дополнительной спектроскопической информации об аналогах кобальта (II) LADH. Комплексы кобальта (II) окрашены, в то время как цинковые (II) комплексы небелые. Поскольку комплексы кобальта (II) являются цветными, можно получить ультрафиолетовые видимые спектры комплексов, в которых также можно собирать информацию о прочности лигандного поля в комплексах кобальта (II). Используя информацию из гауссских расчетов и экспериментально полученные ультрафиолетовые видимые спектры, можно вывести информацию о прочности лигандного поля. Cobalt (II) является хорошей заменой цинка (II), так как оба иона имеют аналогичные ионные радиусы и аналогичные кислотыЛьюис1,12.

Представленный метод включает в себя синтез и характеристику модельных комплексов, чтобы попытаться имитировать естественное каталилитическое поведение LADH5,6. Ранее мы металлизировали семейство лигандовых прекурсоров2 с модельными комплексами цинка (II) LADH, которые смоделировали структуру и реактивность активного участка цинка в LADH4. Благодаря многочисленным экспериментам, эти лиганды клещей оказались надежными в различных условиях окружающей среды и остались стабильными с разнообразной коллекцией прикрепленных R-групп. 5,6

Tridentate лиганды предпочтительнее по сравнению с монодентатными лигандами, потому что они оказались более успешными с металлированием из-за сильных эффектов хелата трезубца. Это наблюдение связано с более благоприятствования энтропии tridentate клещевых лиганд формирования по сравнению с монодентатом лиганд13. Кроме того, tridentate клещи лиганды, вероятно, для предотвращения димеризации металлических комплексов, что является благоприятствования, поскольку димеризация, вероятно, замедлит каталитической активности комплекса14. Таким образом, использование трезубца клещевых лигандов оказалось успешным в органометрической химии при подготовке каталитических активных и надежных комплексов. Комплексы SNS клещи были менее изучены, чем другие системы клещевого, так как комплексы клещевого содержания обычно содержат второе и третьеряду переходные металлы15.

Это исследование металлоэнзиминов может помочь дальнейшему пониманию их ферментатической активности, которая может быть применена к другим областям биологии. Этот метод синтеза модельных комплексов по сравнению с альтернативным методом (синтез всего белка LADH) является благоприятным по ряду причин. Первое преимущество заключается в том, что типовые комплексы имеют низкую молекулярную массу и по-прежнему способны точно представлять каталитической активности и условия окружающей среды активного участка природного фермента. Во-вторых, типовые комплексы проще работать с надежными и релятивируемыми данными.

Данная рукопись описывает синтетическую подготовку и характеристику двух комплексов моделей клещевого клещевого кобляка LADH. Оба комплекса оснащены лиганом, который содержит атомы серы, азота и серы донора. Первый комплекс(4)основан на предшественнике имидазола, а второй (5) основан на предшественнике триазола. Комплексы показывают реактивность для снижения стоихиометрии электронов бедных альдегидов в присутствии водородного донора. Эти результаты реактивности будут сообщены в последующей рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Синтез хлоро-(n3-S,S,N)--2,6-бис(N-изопропил-N'-метиленимидазол-2-тион)пиридин-кобальт (II)тетрахлорокобалтате

  1. Для подготовки комплекса 4,добавить 0,121 г (3,12 х 10-4 моль) из 2,6-бис (N-изопропил-N'-метиленимидазол-2-тион)пиридин (C19H25N5S2)6 до 15 мл ацетонитрила в 100 мл круглой нижней части. Далее, к этому решению, добавьте 0,0851 г (3,58 х 10-4 моль) гексагидрата кобальта (II) (CoCl2Х6H2O). Реакционный раствор должен изменить цвет с светло-желтого на изумрудно-зеленый сразу после добавления гексагидрата хлорида кобальта(II).
  2. Добавьте в колбу перемешиваемую штангу. Рефлюкс и перемешать реакцию на 20 ч, чтобы обеспечить полную реакцию. Удалите растворитель с помощью ротовапа под пониженным давлением.

2. Рекристаллизация хлоро-(n3-S,S,N)-2,6-бис (N-изопропил-N'-метиленеймидазол-2-тион)пиридина-кобальта (II)тетрахлорокобал

  1. Растворите растворите в ацетонитриле (7,5 мл), процедите раствор и равномерно поместите раствор в 1 драм-флаконы. Заполните каждый флакон 1,5 мл раствора ацетонитрила.
    1. Добавьте хлопок, чтобы крышка флаконы, что позволяет медленно диффузии пара. Fit хлопка плотно в отверстие в верхней части флакона.
    2. Поместите флаконы в банку 240 мл, содержащую 50 мл диэтилового эфира. Закройте банку крышкой.
    3. Разрешить кристаллы расти в течение 1 недели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Релкристаллизация может занять больше, чем 1 день.

3. Синтез хлоро-(n3-S,S,N)--2,6-бис (N-изопропил-N'-метиленетриазол-2-тион)pyridine-cobalt (II)тетрахлорокобалтат

  1. Для подготовки комплекса 5,добавить 0,183 г (4,70 х 10-4 моль) из 2,6-бис (N-изопропил-N'-метиленетриазол-2-тион) пиридин (C17H23N7S2)6 до 15 мл ацетонитрила в 100 мл круглой нижней части. К этому раствору добавьте 0,223 г (9,37 х 10-4 моль) гексагидрата хлорида кобальта (CoCl2Х6Н2O). Раствор реакции должен изменить цвет от светло-желтого к королевскому голубому немедленно после гексагидрата хлорида кобальта(II).
    1. Добавьте в колбу перемешиваемую штангу. Рефлюкс и перемешать реакцию на 20 ч, чтобы обеспечить полную реакцию. Удалите растворитель с помощью ротовапа под пониженным давлением.

4. Рекристаллизация хлоро-(n3-S,S,N)--2,6-бис (N-изопропил-N'-метиленетриазол-2-тион)pyridine-cobalt(II)tetrachlorocobaltate

  1. Растворите растворите в ацетонитриле (9,0 мл), процедите раствор и равномерно поместите раствор в 1 драм-флаконы. Заполните каждый флакон 1,5 мл раствора ацетонитрила.
    1. Добавьте хлопок, чтобы крышка флаконы, что позволяет медленно диффузии пара. Fit хлопка плотно в отверстие в верхней части флакона.
    2. Поместите флаконы в банку, содержащую 50 мл диэтилового эфира. Закройте флакон крышкой.
    3. Разрешить кристаллы расти в течение 1 недели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Релкристаллизация может занять больше, чем 1 день.

5. Рентгеновская кристаллография

  1. Установите кристалл 4 на нейлоновой петле. Соберите данные о диффрактометре Ригаску Оксфорд-Дифраклф. Здесь данные рентгеновской дифракции собираются по адресу 173(2) K. Решите кристаллическую структуру с помощью программ структурных решений Olex216 и ShelXT17 с использованием прямых методов. Уточните структуру пакетом уточнения ShelXL18, используя минимизацию наименьших квадратов.
  2. Установите кристалл 5 на нейлоновой петле. Соберите данные рентгеновской дифракции на диффракметре Ригаску Оксфорд-Дифраклбы. Здесь данные рентгеновской дифракции собираются по адресу 173(2) K. Решите кристаллическую структуру с помощью программ структурных решений Olex216 и ShelXT17 с использованием прямых методов. Уточните структуру пакетом уточнения ShelXL18, используя минимизацию наименьших квадратов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Синтез
Синтезы комплексов 4 и 5 были успешно проведены путем реагирования на раствор ацетонитрила, содержащий предшественник бис-тионлига с хобальным гексагидратом хлорида(рисунок 2). Эта реакция произошла при рефлюксной температуре в присутствии воздуха. В целом, комплексы 4 и 5 были замечены растворимыми в ацетонитриле, диметилсулькоксиде, дихлорметане и метаноле. Комплекс 4 был зеленог...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Подготовка комплексов 4 и 5 является легкой. Ключевым шагом является добавление твердого CoCl2No6H2O в ацетонитрил решение, которое содержит соответствующий лигный предшественник. Раствор становится темно-зеленым в течение нескольких секунд после добавления CoCl2No6H2O, чтобы сформировать комплекс 4. Раствор становится ярко-синим после добавления CoCl2No6H2O в комплекс 5. Для обеспечения п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Джон Мичниковски получил финансовую поддержку от следующего для этого проекта: Коннектикут НАСА космических грантов альянса (награда номер P-1168), Фэрфилд университет Научный институт, Колледж искусств и наук Издательский фонд, Фэрфилд Летний научно-исследовательский стипендий факультета университета, и Национальный научный фонд-основные исследовательские инструменты программы (Грант номер CHE-1827854) для средств для приобретения 400 МГц NMR спектрометр. Он также благодарит Теренса Ву (Yale University) за помощь в приобретении электроспрей масс-спектра. Джерри Jasinski признает Национальный научный фонд-основные исследовательские инструменты программы (Грант номер CHE-1039027) для средств на покупку рентгеновского диффрактометра. Шейла Бонитатибус, Эмильсе Альманза, Рами Харбуш и Саманта Зигмонт признают, что программа ученых Хардимана предоставляет свои летние стипендии на исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Колба с круглым дном 100 млChem GlassCG150691100 мл Колба с круглым дном с одним горлышком, 19/22 Наружный шарнир
АцетонитрилFisherHB9823-4ВЭЖХ класса
рото-вейпаLaudaL000638Alpha RA 8
Хлорид кобальта гексагидратAcros OrganicsAC423571000Диэтиловый эфир
Acros OrganicsFisherE-138-1Диэтиловый эфир Anhydorus
градуированный цилиндрFisherS6345625 мл градуированный цилиндр
конфоркаFisher11-100-49SHIsotemp Основная мешалка конфорка
банкиFisher05-719-481250 мл банки
Лиганд----------Синтезировано ранее профессором Мечниковски
медиум ватные шарикиFisher22-456-80средние ватные шарики
один драм флаконыFisher03-339один драм флаконы с TFE Lined Cap
пипетка Fisher13-678-20B5,75 дюймов пипетки пипетки
лампыFisher03-448-21Fisher Brand Латексная лампа для пипетки
рекристаллизующая чашка для песочной ванныFisher08-741 D325 мл рекристаллизационная чашка для песчаной ванны
рефлегматор конденсаторChem GlassCG-1218-A-22Конденсатор с внутренним шарниром 19/22
RotovapHeidolph Collegiate36000090Brinkmann; Роторный испаритель Heidolph Collegiate с эко-ванной Heidolph WB Роторный испаритель Heidolph
песок для песочной ванныAcros Organics612355000промытый морской песок для песочной ванны
МешалкаFisher07-910-23Яйцевидная магнитная мешалка
Вакуумная смазкаFisher14-635-5DDow Corning Высоковакуумная смазка
вакуумный насос для ротацииHeidolph Collegiate36302830Управление клапанами Хейдольфа Ротоваца
Охладитель для морской

Ссылки

  1. Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology. Chemical Reviews. 96 (7), 2239-2314 (1996).
  2. Ibers, J. A., Holm, R. H. Modeling coordination sites in metallobiomolecules. Science. 209 (4453), 223-235 (1980).
  3. Kannan, K. K., et al. Crystal structure of human erythrocyte carbonic anhydrase B. Three-dimensional structure at a nominal 2.2-A resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 72 (1), 51-55 (1975).
  4. Eklund, H., Brändén, C. I. Structural differences between apo- and holoenzyme of horse liver alcohol dehydrogenase. Journal of Biological Chemistry. 254, 3458-3461 (1979).
  5. Miecznikowski, J. R., et al. Syntheses, Characterization, Density Functional Theory Calculations and Activity of Tridentate SNS Zinc Pincer Complexes. Inorganica Chimica Acta. 376, 515-524 (2011).
  6. Miecznikowski, J. R., et al. Syntheses, Characterization, Density Functional Theory Calculations, and Activity of Tridentate SNS Zinc Pincer Complexes Based on Bis-Imidazole or Bis-Triazole Precursors. Inorganica Chimica Acta. 387, 25-36 (2012).
  7. Sunderland, J. R., et al. Investigation of liver alcohol dehydrogenase catalysis using an NADH biomimetic and comparison with a synthetic zinc model complex. Polyhedron. 114, 145-151 (2016).
  8. Miecznikowski, J. R., et al. Synthesis and characterization of three- and five-coordinate copper(II) complexes based SNS ligand precursors. Polyhedron. 80, 157-165 (2014).
  9. Miecznikowski, J. R., et al. Synthesis, Characterization, and Computational Study of Three-Coordinate SNS Copper(I) Complexes based on Bis-Thione Ligand Precursors. Journal of Coordination Chemistry. 67, 29-44 (2014).
  10. Lynn, M. A., et al. Copper(I) SNS Pincer Complexes: Impact of Ligand Design and Solvent Coordination on Conformer Interconversion from Spectroscopic and Computational Studies. Inorganica Chimica Acta. 495, (2019).
  11. Web Elements. , Available from: https://www.webelements.com/zinc/atom_sizes.html (2019).
  12. Web Elements. , Available from: https://www.webelements.com/cobalt/atom_sizes.html (2019).
  13. Caballero, A., Díez-Barra, E., Jalón, F. A., Merino, S., Tejeda, J. 1,1'-(pyridine-2,6-diyl)bis(3-benzyl-2,3-dihydro-1H-imidazol-2-ylidine), a new multidentate N-heterocyclic bis-carbene and its silver(I) complex derivative. Journal of Organometallic Chemistry. 617-618, 395-398 (2001).
  14. Albrecht, M., van Koten, G. Platinum Group Organometallics Based on "Pincer" Complexes: Sensors, Switches, and Catalysis. Angewandte Chemie International Edition. 40 (20), 3750-3781 (2001).
  15. Peris, E., Crabtree, R. H. Key factors in pincer ligand design. Chemistry Society Reviews. 47, 1959-1968 (2018).
  16. Dolomanov, O. V., Bourhis, L. J., Gildea, R. J., Howard, J. A. K., Puschmann, H. A complete structure, solution, refinement, and analysis program. Journal of Applied Crystallography. 42, 339-341 (2009).
  17. Sheldrick, G. M. Integrated Space Group and Crystal Structure Determination. Acta Crystallography. 71, 3-8 (2015).
  18. Sheldrick, G. M. Crystal Structure Refinement with SHELXL. Acta Crystallography. 71, 3-8 (2015).
  19. Pauling, L. Metal-metal bond lengths in complexes of transition metals. Proceedings of the National Academies of the Sciences of the United States of America. 73, 4290-4293 (1976).
  20. Trzhtsinskaya, B. V., Abramova, N. D. Imidazole-2-Thiones: Synthesis, Structure, Properties. Sulfur Reports. 10 (4), 389(1991).
  21. Schneider, G., Eklund, H., Cedergren-Zeppezauer, E., Zeppezauer, M. Crystal structure of the active site in specifically metal-depleted and cobalt substituted horse liver alcohol dehydrogenase derivatives. Proceedings of the National Academies of the Sciences of the United States of America. 80, 5289-5293 (1983).
  22. Yang, L., Powell, D. R., Houser, R. P. Structural variation in copper(I) complexes with pyridylmethylamide ligands: structural analysis with a new four-coordinate geometry index, τ4. Dalton Transactions. , 955-964 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

SNSII
Приготовление SNS Cobalt (II) Пинцер Модель комплексов печени Алкоголь Дегидрогеназы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.