Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Приготовление Мейотических хромосомных спредов из сперматозоидов зебрафиш

7.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60671

⸱

3 марта 2020 г.

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, Davis, 2Integrative Genetics and Genomics Graduate Group, University of California, Davis

В этой статье

Краткое содержание

Ядерные поверхностные спреды являются незаменимым инструментом для изучения хромосомных событий во время мейоза. Здесь мы демонстрируем метод подготовки и визуализации мейотических хромосом во время профазы I из сперматозитов зебры.

Аннотация

Meiosis является ключевым клеточным процессом, необходимым для создания гаплоидных гамет для полового размножения. Модельорганизмов сыграли важную роль в понимании хромосомных событий, которые происходят во время мейотической профазы, включая спаривание, синапсис и рекомбинации событий, которые обеспечивают надлежащую сегрегацию хромосомы. Хотя мышь была важной моделью для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе этих процессов, не все мейотические события в этой системе аналогичны человеческому мейозу. Недавно мы продемонстрировали захватывающий потенциал зебры в качестве модели человеческого сперматогенеза. Здесь мы подробно описываем наши методы визуализации мейотических хромосом и связанных с ними белков в хромосомных препаратах. Преимущество этих препаратов позволяет проводить анализ хромосомных хромосомных структур с высоким разрешением. Во-первых, мы описываем процедуру вскрытия яичек от взрослых зебр, а затем диссоциации клеток, лиза и распространения хромосом. Далее мы описываем процедуру обнаружения локализации мейотических хромосомных белков путем обнаружения иммунофлуоресценции и последовательностей нуклеиновых кислот путем флуоресценции на месте гибридизации (FISH). Эти методы представляют собой полезный набор инструментов для цитологического анализа мейотического хроматина архитектуры в системе зебрафиш. Исследователи в сообществе зебры должны быть в состоянии быстро освоить эти методы и включить их в свой стандартный анализ репродуктивной функции.

Введение

Сексуальное размножение происходит через сочетание двух гаплоидных гамет, каждый из которых несет половину хромосомного дополнения соматической клетки. Meiosis является специализированным делением клеток, который производит гаплоидные гаметы через один раунд репликации ДНК и два последовательных раунда сегрегации хромосомы. В профазе I гомологичные хромосомы (омологи) должны пройти спаривание, рекомбинацию и синапсис, последний из которых характеризуется образованием синаптонемного комплекса, состоящего из двух омологовых осей, мостовых поперечной нитью, Sycp1(Рисунок 1A, B). Неспособность должным образом выполнить эти процессы может привести к производству анеуплоидных гамет, которые являются основной причиной выкидышей у людей1. Наши знания о координации между сопряжением, рекомбинации и синапсиса было облегчено исследований в широком диапазоне организмов, таких как дрожжи, C. elegans, мышь, и Drosophila, среди других2. В то время как общий процесс гомологичных хромосомных спаривания с последующим сегрегацией хорошо сохраняется, его зависимость от рекомбинации и синапсиса и порядок этих событий варьируется.

Мейотическое двухструное разрыв (DSB) образование, которое инициирует гомологичную рекомбинацию, происходит вблизи теломер, сгруппированных в букете во время лептотена и синапсиса вытекает вскоре после3,4. Эта конфигурация формирования DSB и синапсис инициации также является характеристикой мужского мейоза у людей, но не в мыши5,6,7,8, предполагая, что зебрафиш может служить моделью для человеческого сперматогенеза. Есть также несколько практических преимуществ изучения зебрафиш мейоз. Как мужчины, так и самки проходят гейттогенез на протяжении всей взрослой жизни, их гонады легко доступны, и сотни потомства генерируются из одного креста. Кроме того, эмбрионы прозрачны и развиваются внешне, что облегчает раннее выявление аберраций в эмбриональном развитии из-за анеуплоидных гамет3,9. Недостатки использования зебры в том, что они медленно достигают половой зрелости (60 дней), а количество материала, необходимого для ядерных поверхностных спредов, должно быть собрано у взрослых животных в зависимости от их размера.

Препараты мейотической хромосомы являются жизненно важным инструментом для изучения динамики хромосом во всех модельных организмах, так как ключевые признаки динамики мейотической хромосомы могут быть исследованы. В зебрафиш, ключевые аспекты прогрессирования мейотической программы и ядерной организации были расчленены путем зондирования ядерных поверхностных спредов, упомянутых здесь как хромосомные спреды, с антителами для иммунофлюоресценции обнаружения белков и / или нуклеиновых кислот FISH3,4,9,10,11,12. Действительно, поляризованная локализация кластерных теломер в букете может быть сохранена в спред-препарате(рисунок 1С). В последнее время мы использовали зебра фишка сперматозоидов хромосомы распространяется вместе с методами обнаружения флуоресценции и супер-разрешение микроскопии, чтобы выяснить детальное прогрессирование динамики теломер зебры, гомологические хромосомы сопряжения, двойной нитны перерыв локализации, и синапс и синапсис на ключевых мейотических переходов3. Здесь мы представляем методы подготовки хромосомных спредов из сперматозитов яичек зебры, а затем окрашиваем их флуоресцентными пептидными нуклеиновыми кислотами (ПНА) зондами для повторных последовательностей теломер и иммунофуфрезесценции, связанных с белками.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, связанные с зебрафиш были выполнены с использованием этических стандартов, утвержденных Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Калифорнийском университете в Дэвисе.

1. Процедура распространения хромосомы

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол предназначен для создания 4-6 слайдов, с сотнями распространенных мейотических ядер на слайд. Количество используемых яичек будет зависеть от размера рыбы. Будьте в состоянии использовать 20 животных на 60 дней после оплодотворения (dpf) и 15 животных на 6 месяцев после оплодотворения (mpf). Для крупных зебр (например, 12 миль на галлон) 10 животных должно быть достаточно. Имейте в виду, что яички некоторых мейотических мутантов (например, spo11-/-) будет несколько меньше3. В этом протоколе один пул яичек рассматривается как единый образец. Параллельно рекомендуется готовить не более 4 образцов.

  1. Сделайте следующие решения перед началом процедуры распространения
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удобно готовить следующие решения в количествах, указанных для использования в будущих экспериментах по распространению.
    1. Подготовьте раствор сахарозы 0,1 М путем растворения 3,42 г сахарозы в 100 мл дистиллированной воды. Принесите сахарозы решение рН 8 с помощью 1 M Tris-HCl, который также на рН 8. Затем фильтр стерилизовать раствор сахарозы. Хранить при комнатной температуре.
    2. Сделать 10x фосфат-буферный солен (PBS) стокового раствора до конечной концентрации 1,37 М NaCl, 27 мМ KCl, 73 мМ Na2HPO4 и 27,6 мМ KH2PO4 в 1,8 л дистиллированной воды. Перемешать до растворения, а затем настроить рН до 7,3 с помощью NaOH и autoclave. Хранить при комнатной температуре.
    3. Сделать 400 мг /мЛ DNase I раствор в стерильной дистиллированной воде. Хранить при -20 градусах по Цельсию. Рекомендуется подготовить 5 мл этого раствора, а затем хранить в качестве 100 аликвот.
  2. Сделать следующие решения в день распространения протокола
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для эффективности времени, лучше всего сделать коллагеназный раствор сразу после вскрытия всех яичек, а затем сделать трипсин и трипсина ингибитор решения в то время, что образцы лечатся в коллагеназе.
    1. Растворите 4 мг коллагеназа в 200 qL модифицированной среды Орла Dulbecco (DMEM) на образец (2% w/v коллагеназа окончательная концентрация). Держите на льду до тех пор, пока это необходимо. Коллагенеза будет разъединять яички.
    2. Растворите 1,4 мг трипсина в 200 ЗЛ DMEM на образец (0,7% w/v конечной концентрации трипсина). Держите на льду до тех пор, пока это необходимо. Трипсин поможет разъединить клетки.
    3. Растворите 10 мг ингибитора трипсина в 500 Л DMEM на образец (2% w/v трипсинингингинг окончательный концентрации). Держите на льду до тех пор, пока это необходимо. Ингибитор трипсина предотвращает трипсин от деградации клеток.
    4. Приготовьте раствор формальдегида 1% (из 16% готового раствора) с 0,15% Triton X-100 в стерильной дистиллированной воде. Держите на льду до тех пор, пока это необходимо. 1% формальдегида может быть подготовлен в то время как яички лечатся с трипсином и DNase I (т.е. во время шага 1.4.7 процедуры распространения).
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид опасен.
  3. Рассечение яичек от взрослых самцов зебры
    1. Эвтанизировать самца зебры (Зgt; 60 dpf), погрузив их в ледяную воду. Рыбу можно хранить в ледяной воде до готовности к вскрытию, однако ее следует как можно скорее вскрыть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм дикого типа AB используется для этой процедуры, но другие штаммы дикого типа также должны быть поддаются. Самое долгое время, когда мы держали рыбу в ледяной воде до вскрытия, составляет 3 ч без какого-либо заметного влияния на протокол.
    2. Обезглавить одну рыбу за один раз с помощью небольших ножниц, а затем использовать микро ножницы, чтобы сократить вдоль брюшной средней линии подвергать полости тела.
    3. Вскрыть яички с помощью щипц (см. Таблица материалов) на 1,65x увеличение под микроскопом. Проведите вскрытия в силиконовой шерсти чашку Петри с покрытым неглубоким бассейном 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Яичный материал находится между плавательным пузырем и кишечником и будет выглядеть легче, чем мышечная ткань(рисунок 2A). Яичек должны иметь 2 доли при удалении из зебры(Рисунок 2B).
    4. Удалите как можно больше жира и окружающих тканей из яичек, как это возможно. Затем добавьте каждый расчлененный яичек непосредственно в трубку 5 мл с 2 мл DMEM и держать на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.3.3 и 1.3.4 должны быть освоены до проведения любых экспериментов.
  4. Диссоциация яичек
    1. Предварительно подогрев10 мл сахарозного раствора 0,1 М до 37 градусов по Цельсию.
    2. Добавьте 200 злколлазе в трубку 5 мл с яичками. Смешайте раствор, инвертируя его несколько раз.
    3. Аккуратно встряхните яички в шейкере-инкубаторе горизонтально при 100 об/мин при 32 градусах по Цельсию в течение 50 минут до тех пор, пока DMEM не будет облачным и яички не будут небольшими кусками. Быстро инвертировать трубку каждые 10 минут, чтобы облегчить диссоциацию.
    4. Чтобы промыть коллагенеза, добавьте DMEM в окончательный объем 5 мл и несколько раз инвертировать трубку. Пеллетя яички на 200 х г в течение 3 мин при комнатной температуре. Удалите 3 мл супернатанта так, чтобы оставалось только 2 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление, удаление и передача DMEM делается с пластиковыми пипетками передачи для всей процедуры распространения хромосомы.
    5. Повторите шаг 1.4.4 в два раза больше для итогового 3 DMEM смывов. Не приостанавливайте действие гранул между dMEM.румает. После последней мытья DMEM, удалить 4 мл супернатанта так, что только 1 мл остается.
    6. Добавьте 1 мл DMEM общим объемом 2 мл и добавьте 200 л раствора трипсина и 20 л раствора DNase I. Перевернуть трубку несколько раз, чтобы смешать раствор.
    7. Горизонтально встряхните трубку при 32 градусах по Цельсию в течение 5-15 мин при 100 об/мин до тех пор, пока раствор DMEM не содержит лишь несколько комков. Быстро инвертировать трубку каждые 5 минут, чтобы облегчить диссоциацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Комки должны быть значительно меньше после встряхивания.
    8. Добавьте 500 зл и 50 0л раствора ингибитора трипсина и 50 Зл раствора DNase I. Перевернуть трубку несколько раз, чтобы смешать, а затем кратко спина вниз на 200 х г в течение 3 мин при комнатной температуре, чтобы удалить жидкость или комки, которые могут придерживаться трубки крышка или стороне трубки.
    9. Поместите трубку на лед и resuspend подвески клетки, неоднократно pipetting вверх и вниз с пластиковой передачи пипетки в течение 2 минут для облегчения диссоциации любых оставшихся сгустков. Не позволяйте подвеске клетки войти в луковицу перекладины. После 2 мин, пипетка подвески обратно в трубку 5 мл.
    10. Предварительно промокните 100 мкм ячейки ситечко с DMEM и поместите его на вершине 50 мл трубки на льду.
    11. Передача подвески ячейки через ситечко одну каплю за один раз с помощью пластиковой передачи пипетки. Убедитесь, что суспензия ячейки не попадает в лампу переносного пипетки.
    12. Перенесите фильтрат с помощью пластиковой трубки передачи на новую трубку 5 мл и добавьте DMEM до конечного объема 5 мл. Обязательно соберите объединенные ячейки, прикрепленные к нижней стороне фильтра, с помощью чистой пластиковой трубки для переноски. Пеллетклетки на 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    13. Удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулы.
    14. Добавьте 5 зл и раствор DNase I непосредственно в гранулы. Затем смешайте гранулы с раствором DNase I, аккуратно соскребая внешнюю нижнюю часть трубки 4-5 раз вдоль пустой 1,5 мл микроцентрифуговой трубки стойки. Слишком жесткое соскоб может привести к уменьшению восстановленных спредов.
    15. Добавьте DMEM в окончательный объем 5 мл и смешайте раствор, несколько раз перевернув трубку. Она является общей для сгустков по-прежнему присутствовать после первого лечения DNase I.
    16. Пеллетия клеточной подвески на 200 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
    17. Повторите шаги 1.4.13-1.4.16 еще 1-3 раза, пока повторно еле не слипаются при добавлении DMEM. После последнего спина, удалить столько супернатант, как это возможно, не нарушая гранулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидать сокращения размера гранул с каждым DNase I лечения; превышение 4 общей DNase I смеет может привести к значительной потере клеток. Если гранулы не видны после DNase I шаги лечения, не приступайте к процедуре. Откажитесь от неиспользованных DNase I.
    18. Добавьте 1 мл 1x PBS и resuspend гранулы, аккуратно соскоб наружную нижнюю часть трубки вдоль пустой 1,5 мл трубки стойки.
    19. Гралет клеточной подвески на 200 х г в течение 5 минут, то удалить столько супернатант, как это возможно, не нарушая гранулы.
    20. Вырезать 3 мм от конца 200 л пипетки отзыв, чтобы расширить диафрагму и resuspend гранулы в 80 qL 0,1 М сахарозы решение пайпеткой вверх и вниз с разрезаpip наконечником. Пусть клеточная подвеска сидит при комнатной температуре в течение 3 мин.
  5. Распространение хромосом на стеклянные горки
    1. Пальто один слайд с 100 л 1% формальдегида с 0,15% Тритон X-100 со стороной кончика пипетки. Затем добавьте 18 л сахарозной подвески клеток на центр слайда по прямой линии перпендикулярно длинному краю. Наклоните горку вперед и назад (60 евро), чтобы облегчить распространение подвески ячейки на все углы.
    2. Поместите слайды плашмя вниз в слегка трещины открытой влажности камеры (Рисунок 3), чтобы предотвратить раствор формальдегида от сушки. Поместите камеру влажности в темный ящик на ночь.
    3. Снимите крышку с камеры влажности и дайте слайдам полностью высохнуть.
    4. Поместите горки в банку Коплин затем заполнить банку Коплин с дистиллированной водой и инкубировать в течение 5 минут с нежной тряски при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды могут быть помещены в банку Коплин в зигзагообразном рисунке, чтобы максимизировать количество слайдов на банку Коплин. Убедитесь, что есть место для жидкости, чтобы пройти между всеми слайдами.
    5. Вылейте воду и заполните банку с 1:250 смачивания агента (см. Таблица материалов). Вымойте 2 раза в течение 5 минут каждый с нежной тряской при комнатной температуре.
    6. Разрешить слайды полностью высохнуть и хранить при -20 градусов по Цельсию, пока они не окрашены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Самый длинный мы сохранили слайды без каких-либо заметных деградации хромосом составляет 2 месяца.

2. Теломер ПНА зонд окрашивания

ПРИМЕЧАНИЕ: Telomere повторяется может быть окрашены с помощью фторофора конъюгированных теломер PNA зондов, которые гибридизируются на ведущих нити теломер повторяется (CCCTAA). Зонды PNA имеют нейтральную основу, что увеличивает сродство гибридизации к отрицательно заряженной ДНК, в результате чего практически нет фона. Шаг зондирования теломер является необязательным. Чтобы перейти к окрашиванию антител, регидратные слайды в 1x PBS, как указано в шаге 2.2.2., а затем перейти непосредственно к "Первичное окрашивание антител".

  1. Сделать PNA зонд реагентов перед началом теломер окрашивания
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удобно готовить следующие решения в количествах, указанных для использования в будущих экспериментах. Условия хранения приведены ниже.
    1. Приготовьте 2 l 20x солен-натрия цитрата (SSC) раствор с окончательной концентрацией 3 M NaCl и 0.3 M цитрат натрия. Автоклав и хранить при комнатной температуре.
    2. Сделайте 50 мл раствора предварительной гибридизации, содержащего перенос РНК, в окончательную концентрацию 50% формамида, 5x SSC, 50 мкг/мл гепарина, 500 мкг/мл переноса РНК, 0,1% Tween 20 и добавить 460 л лимонной кислоты, чтобы довести раствор до рН No 6. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
      ВНИМАНИЕ: Формамид опасен. Подготовьте раствор в дымящийся капюшон.
    3. Сделайте 50 мл раствора предварительной гибридизации, подготовленного так же, как и в шаге 2.1.2 без добавления переноса РНК. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
    4. Зонды PNA telomere TelC-Cy3 и TelC-Alexa647 готовятся в виде 50 запасов мкм в формеамиде в соответствии с инструкциями производителя. Храните зонды PNA в виде аликвот оверок 8 qL при -80 градусах по Цельсию.
    5. Сделать не менее 1 мл 100 мг/мл бульонного раствора бычьего сывороточных вин (BSA) в стерильной дистиллированной воде. Хранить при -20 градусах по Цельсию. При приготовлении более 1 мл акций BSA, храните раствор в виде 1 мл aliquots.
    6. Используя трубку 2 мл, подготовьте 2 мл раствора гибридизации, добавив 27 л 100 мг/мл BSA и 8 л из 50 мм зонда PNA до 1,965 мл раствора предварительной гибридизации, содержащего перенос РНК. Хранить в темноте при -20 градусах по Цельсию.
  2. PNA теломер зонд окрашивания
    1. Разогреть духовку гибридизации до 82 градусов по Цельсию.
    2. Re-гидрат слайды с 500 л 1x PBS на слайд в течение 5 минут в камере влажности при комнатной температуре. Удалите PBS, нажав на сторону слайда на бумажном полотенце.
    3. Нагрейте горки и трубку 2 мл, содержащую раствор гибридизации непосредственно на металлической поверхности в разогретой печи гибридизации в течение 2 мин.
    4. Сохраняя слайды на металлической поверхности, добавьте 100 qL раствора гибридизации на слайд, а затем покройте слайды пластиковыми крышками (25 мм х 75 мм), вырезанными по форме из автоклавного мешка. Пусть слайды сидеть на 82 градусов по Цельсию в течение 10-12 мин.
    5. Поместите горки в камеру влажности в темноте при 37 градусах по Цельсию в течение 16-24 ч. С этого момента и для первичного и вторичного окрашивания антител, слайды должны храниться в темноте, чтобы избежать фотоотбеления сигнала флуоресценции. После инкубационного периода реагенты для окрашивания антител можно подготовить в течение шага 2.2.9.
    6. Удалите крышки с помощью наконечника пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения удаления coverslip, 50-100 qL раствора гибридизации без передачи РНК может быть мягко обойтись между слайдом и крышкой, как coverslip в настоящее время отменены.
    7. Pipette 500 л предварительно гибридизации раствор без передачи РНК на каждом слайде и место слайды в камере влажности в течение 15 минут при комнатной температуре. Удалите раствор, нажав на сторону слайда на бумажное полотенце.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Решение предварительной гибридизации без переноса РНК не предварительно нагревается до добавления на каждый слайд.
    8. Pipette 500 л 50% до гибридизации раствор без передачи РНК в 1x PBS на каждый слайд и место слайды в камере влажности в течение 15 минут при комнатной температуре. Удалите раствор, нажав на сторону слайда на бумажное полотенце.
    9. Перенесите слайды в банку Коплин и промойте 3 раза в 1x PBS с нежной тряской в течение 15 минут за стирку при комнатной температуре.
    10. Удалите слайды из банки Коплин и удалить избыток PBS, нажав сторону слайда на бумажное полотенце. Затем приступаем к шагу 3.2 "Первичное окрашивание антител".

3. Окрашивание антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела, поднятые на известные мейотические белки могут быть использованы для иммунофлуоресценции обнаружения в распространении хромосомы препаратов. Вторичные антитела, спряженные с различными флюорофорами, позволяют одновременно запятнать несколько белков, если первичные антитела были подняты у разных животных.

  1. Сделайте следующие решения в день первичного и вторичного окрашивания антител
    1. Сделать 1 L PBT с 1x PBS и 0,1% Тритон X-100 разбавленной в дистиллированной воде. Хранить при комнатной температуре. Это может быть подготовлено заранее и в больших количествах для будущих экспериментов распространения.
    2. Приготовьте 500 кл блока антител на слайд до конечной концентрации 2 мг/мл BSA и 2% козьей сыворотки в ПБТ.
    3. Чтобы сделать 100 л первичной или вторичной смеси антител на слайд, добавьте соответствующие антитела в правильной концентрации (см. Таблица материалов)в блок антитела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация антител может быть определена эмпирически. В обсуждении, мы включаем список антител мы пробовали с успехом (с разбавления / концентрации) и те, которые мы пытались без успеха.
  2. Первичное окрашивание антител
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кролик анти-человека SCP3 и курица анти-зебрафиш Sycp1, как правило, используются для первичного окрашивания антител.
    1. После удаления избыточного PBS со слайдов, добавить 500 л блока антител на слайд и поместите слайды в камере влажности при комнатной температуре в течение как минимум 20 минут.
    2. Удалите блок антител, нажав на сторону слайда на бумажном полотенце.
    3. Добавьте 100 злитроблоков первичного антитела в блок е антитела на слайд и накройте слайды пластиковым покрытием, сделанным из автоклавного мешка. Поместите горки в камеру влажности на ночь при 4 градусах Цельсия.
    4. Удалите крышки с наконечником пипетки и мыть слайды 2 раза в течение как минимум 5 минут каждый с 1x PBS в банку Коплин с нежной тряской при комнатной температуре.
    5. Удалите PBS, нажав на сторону слайда на бумажном полотенце.
  3. Вторичное окрашивание антител
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конъюгированные козы анти-кролик а анти-кроличьи и анти-куриные антитела к различным флюорофорам используются для окрашивания при концентрации 1:1000.
    1. Добавьте 500 кл. блока антител на слайд и поместите горки в камеру влажности при комнатной температуре в течение как минимум 5 минут.
    2. Удалите блок антител, нажав на сторону слайда на бумажном полотенце.
    3. Добавьте 100 злитровых антител в блок антител на слайд и накройте слайды пластиковым покрытием, сделанным из автоклавного мешка. Поместите горки в камеру влажности на 1 ч при 37 градусах Цельсия.
    4. Удалите крышки с наконечником пипетки и мыть слайды 3 раза в течение как минимум 5 минут каждый с 1x PBS в банку Коплин с нежной тряской при комнатной температуре.
    5. Промыть слайды один раз в течение как минимум 2 мин с дистиллированной водой в банку Коплин с нежной тряской при комнатной температуре.
    6. Воздух сушить горки наклонены, чтобы облегчить сушки.
    7. Поместите 20 зл анти-увядающей монтант с или без DAPI (см. Таблица материалов)в виде 3 равномерно расположенных точек на стеклянных крышках (24 мм х 60 мм).
    8. Поместите слайды лицом вниз на стеклянные крышки затем печать coverslips с лаком для ногтей на краю перекрытия матовый конец слайда.
    9. Храните подготовленные слайды при 4 градусах Цельсия до готовности к визуализации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы наметили метод для подготовки и визуализации зебрафиш сперматоцитов распространения препаратов. При правильном выполнении наша процедура дает хорошо спред, не перекрывающиеся ядра. Чтобы восстановить такие ядра, важно иметь соответствующее количество исходного материала (т.е. яички), лечить яички в течение достаточного периода времени в трипсине и достаточное количество DNase I лечения. Эти спреды могут быть окрашены для теломер и мейотических белков для изучения мейотической прогресси...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем методы зондирования расположения теломер и хромосо-связанных белков в ядерной поверхности распространяется из сперматоцитов, изолированных от яичек зебры. Мы ожидаем, что эти методы будут применимы для анализа сперматоцитов у других видов телеост с корректировкой на размер яичек.

Хотя только несколько антител были подняты на зебрафиш мейотических белков, мы имели успех, используя следующие антитела, поднятые на человека (h) или мыши (м) белков. Наша лаборатория подняла антит...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Трента Ньюмана и Масуду Шарифи за комментарии к рукописи и An Nguyen за помощь в оптимизации методов распространения и окрашивания хромосом от зебры миоцитов. Эта работа была поддержана NIH R01 GM079115, присужденной S.M.B.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл центрифужные пробиркинесколько коммерческих брендов
Штатив для микроцентрифужных пробирок 1,5 млДоступно несколько коммерческих брендов 16
% формальдегида, не содержит метанолаThermoFisher Scientific28908
2 млДоступно несколько коммерческих брендов Стеклянные
покровные стекла 24 x 50 ммCorning2980-245
24 x 60 мм стеклянные покровные стеклаVWR International16004-312
50 мл конические центрифужные пробиркиThermoFisher Scientific363696
Автоклавная сумкаДоступноИспользуется для изготовления пластиковых покровных колпачков.
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Fisher ScientificBP1605-100Приготовьте стоковый раствор 100 мг/мл в стерильной дистиллированной воде.
Сетчатый фильтр, 100 & микро; mFisher Scientific08-771-19
CF405M козий анти-куриный IgY (H+L), высокоадсорбированныйбиотий203775-500 мклИспользование в 1:1000
Куриный анти-zfSycp1Получен лабораторией БерджессаН/ДИспользование в соотношении 1:100
Коллагеназа из Clostridium histolyticumSigma-AldrichC0130-500MG
Баночка коплинаНесколько доступные коммерческие бренды DNase
I, grade II из поджелудочной железы крупного рогатого скотаRoche Diagnostics10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Fisher ScientificMT10014CV
Dumont No. 5 ЩипцыFine Science Tools11252-30Для рассечения яичек требуются два.
Пробирки Eppendorf, 5 млVWR International89429-308
ФормамидFisher ScientificBP228-100
Вторичное антитело против курицы IgY (H+L) у козы, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11039Использование при 1:1000
Вторичное антитело против курицы IgY (H+L) у козы, Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-11042Использование при 1:1000
Козий анти-hDMC1Санта-Круз Биотехнологияsc-8973Не работает в наших руках
Козий антикроличий IgG (H+L) перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11008Используйте в 1:1000
Козий антикроличьи IgG (H+L) перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-11012Используйте в 1:1000
Козья сывороткаSigma-AldrichG9023-10mL
Гепарин натриевая сольSigma-AldrichH3393-100KU
Камеравлажности Fisher Scientific50-112-3683
Гибридизационная печьVWR International230401V (модель 5420)
Шейкер инкубатораBrunswick ScientificModel Classic C25
KClFisher ScientificP217-500
KimwipesKimerbly-Clark Professional34155Используется для камеры
влажности KH2PO4FisherScientificP285-500
МикроскопДоступноДостаточно любого стандартного микроскопа, способного увеличить не менее ~1,65X.
Предметные стекла для микроскопаFisher Scientific12-544-7
Мышь против хомякаSCP3Abcamab97672Не работает в наших руках
Мышь анти-hMLH1BD Biosciences550838Не работает в наших руках
Мышь анти-hRPASigma-AlrichMABE285Не работает в наших руках
Na2HPO4 · 7 H2OFisher ScientificS373-500
NaClFisher ScientificS271-3
Photo-Flo 200 растворЭлектронная микроскопия Sciences74257
Пластиковые трансферные пипеткиДоступно
PNA TelC-Alexa647PNA Bio IncF1013Подготовка в соответствии с производителями' .
PNA TelC-Cy3PNA Bio IncF1002Подготовьте в соответствии с инструкциями производителя.
ProLong Diamond Anti-fade MountantThermoFisher ScientificP36970
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPIThermoFisher ScientificP36971
Rabbit anti-hRPABethylA300-244AИспользование в 1:300
Rabbit anti-hSCP3Abcamab150292Использование в 1:200
Rabbit anti-hRad51GeneTexGTX100469Использование в 1:300
Цитрат натрияFisherScientific S279-500
СахарозаFisher ScientificS5-500
Supercut Ножницы, угол 30 градусов, 10 смFisher Scientific50-822-353Можно также использовать любую пару маленьких ножниц.
Набор SylgardFisher ScientificNC9897184Prepare в соответствии с инструкциями производителя.
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100Разведите в стерильной дистиллированной воде до получения 20% рабочего раствора. Хранить при комнатной температуре. Triton X-100 при разведении в воде образует осадок; Осадок растворяется за ночь.
ТрипсинУортингтон БиохимическийLS003708
Ингибитор трипсина из белка куриного яйцаSigma-AldrichT9253-500MG
Tween 20Bio-Rad170-6531Разведите в стерильной дистиллированной воде до получения 20% рабочего раствора. Хранить при комнатной температуре.
Весенние ножницы Vannas - 4 мм (микроножницы)Fine Science Tools15018-10
Доступно несколько коммерческих брендов New несколько коммерческих марок несколько коммерческих брендов

Ссылки

  1. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
  2. Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
  3. Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730(2019).
  4. Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
  5. Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
  6. Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075(2013).
  7. Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442(2014).
  8. Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
  9. Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
  10. Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
  11. Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
  12. Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
  13. Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378(2017).
  14. Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
  15. Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
  16. Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773(2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Диссекция семенниковдиссоциация клетокприготовление препаратов хромосомных разворотовиммунофлуоресцентная детекцияфлуоресцентная гибридизация in situобработка ДНказой Iраствор сахарозыформальдегид-Triton X-100
Приготовление Мейотических хромосомных спредов из сперматозоидов зебрафиш
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.