Ядерные поверхностные спреды являются незаменимым инструментом для изучения хромосомных событий во время мейоза. Здесь мы демонстрируем метод подготовки и визуализации мейотических хромосом во время профазы I из сперматозитов зебры.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Приготовление Мейотических хромосомных спредов из сперматозоидов зебрафиш
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Meiosis является ключевым клеточным процессом, необходимым для создания гаплоидных гамет для полового размножения. Модельорганизмов сыграли важную роль в понимании хромосомных событий, которые происходят во время мейотической профазы, включая спаривание, синапсис и рекомбинации событий, которые обеспечивают надлежащую сегрегацию хромосомы. Хотя мышь была важной моделью для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе этих процессов, не все мейотические события в этой системе аналогичны человеческому мейозу. Недавно мы продемонстрировали захватывающий потенциал зебры в качестве модели человеческого сперматогенеза. Здесь мы подробно описываем наши методы визуализации мейотических хромосом и связанных с ними белков в хромосомных препаратах. Преимущество этих препаратов позволяет проводить анализ хромосомных хромосомных структур с высоким разрешением. Во-первых, мы описываем процедуру вскрытия яичек от взрослых зебр, а затем диссоциации клеток, лиза и распространения хромосом. Далее мы описываем процедуру обнаружения локализации мейотических хромосомных белков путем обнаружения иммунофлуоресценции и последовательностей нуклеиновых кислот путем флуоресценции на месте гибридизации (FISH). Эти методы представляют собой полезный набор инструментов для цитологического анализа мейотического хроматина архитектуры в системе зебрафиш. Исследователи в сообществе зебры должны быть в состоянии быстро освоить эти методы и включить их в свой стандартный анализ репродуктивной функции.
Введение
Сексуальное размножение происходит через сочетание двух гаплоидных гамет, каждый из которых несет половину хромосомного дополнения соматической клетки. Meiosis является специализированным делением клеток, который производит гаплоидные гаметы через один раунд репликации ДНК и два последовательных раунда сегрегации хромосомы. В профазе I гомологичные хромосомы (омологи) должны пройти спаривание, рекомбинацию и синапсис, последний из которых характеризуется образованием синаптонемного комплекса, состоящего из двух омологовых осей, мостовых поперечной нитью, Sycp1(Рисунок 1A, B). Неспособность должным образом выполнить эти процессы может привести к произв....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все методы, связанные с зебрафиш были выполнены с использованием этических стандартов, утвержденных Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Калифорнийском университете в Дэвисе.
1. Процедура распространения хромосомы
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол предназначен для создания 4-6 слайдов, с сотнями распространенных мейотических ядер на слайд. Количество используемых яичек будет зависеть от размера рыбы. Будьте в состоянии использовать 20 животных на 60 дней после оплодотворения (dpf) и 15 животных на 6 месяцев после оплодотворения (mpf). Для крупных зебр (например, 12 миль на галлон) 10 жив....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы наметили метод для подготовки и визуализации зебрафиш сперматоцитов распространения препаратов. При правильном выполнении наша процедура дает хорошо спред, не перекрывающиеся ядра. Чтобы восстановить такие ядра, важно иметь соответствующее количество исходного материала (т.е. яички), лечить яички в течение достаточного периода времени в трипсине и достаточное количество DNase I лечения. Эти спреды могут быть окрашены для теломер и мейотических белков для изучения мейотической прогресси.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем методы зондирования расположения теломер и хромосо-связанных белков в ядерной поверхности распространяется из сперматоцитов, изолированных от яичек зебры. Мы ожидаем, что эти методы будут применимы для анализа сперматоцитов у других видов телеост с корректировкой на размер яичек.
Хотя только несколько антител были подняты на зебрафиш мейотических белков, мы имели успех, используя следующие антитела, поднятые на человека (h) или мыши (м) белков. Наша лаборатория подняла антит.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Трента Ньюмана и Масуду Шарифи за комментарии к рукописи и An Nguyen за помощь в оптимизации методов распространения и окрашивания хромосом от зебры миоцитов. Эта работа была поддержана NIH R01 GM079115, присужденной S.M.B.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,5 мл центрифужные пробирки | несколько коммерческих брендов | ||
| Штатив для микроцентрифужных пробирок 1,5 мл | Доступно несколько коммерческих брендов 16 | ||
| % формальдегида, не содержит метанола | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 мл | Доступно несколько коммерческих брендов Стеклянные | ||
| покровные стекла 24 x 50 мм | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 мм стеклянные покровные стекла | VWR International | 16004-312 | |
| 50 мл конические центрифужные пробирки | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Автоклавная сумка | Доступно | Используется для изготовления пластиковых покровных колпачков. | |
| Бычий сывороточный альбумин (БСА) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Приготовьте стоковый раствор 100 мг/мл в стерильной дистиллированной воде. |
| Сетчатый фильтр, 100 & микро; m | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M козий анти-куриный IgY (H+L), высокоадсорбированный | биотий | 203775-500 мкл | Использование в 1:1000 |
| Куриный анти-zfSycp1 | Получен лабораторией Берджесса | Н/Д | Использование в соотношении 1:100 |
| Коллагеназа из Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Баночка коплина | Несколько доступные коммерческие бренды DNase | ||
| I, grade II из поджелудочной железы крупного рогатого скота | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Щипцы | Fine Science Tools | 11252-30 | Для рассечения яичек требуются два. |
| Пробирки Eppendorf, 5 мл | VWR International | 89429-308 | |
| Формамид | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Вторичное антитело против курицы IgY (H+L) у козы, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Использование при 1:1000 |
| Вторичное антитело против курицы IgY (H+L) у козы, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Использование при 1:1000 |
| Козий анти-hDMC1 | Санта-Круз Биотехнология | sc-8973 | Не работает в наших руках |
| Козий антикроличий IgG (H+L) перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Используйте в 1:1000 |
| Козий антикроличьи IgG (H+L) перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Используйте в 1:1000 |
| Козья сыворотка | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Гепарин натриевая соль | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Камера | влажности Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Гибридизационная печь | VWR International | 230401V (модель 5420) | |
| Шейкер инкубатора | Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Используется для камеры |
| влажности KH2PO4Fisher | Scientific | P285-500 | |
| Микроскоп | Доступно | Достаточно любого стандартного микроскопа, способного увеличить не менее ~1,65X. | |
| Предметные стекла для микроскопа | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Мышь против хомякаSCP3 | Abcam | ab97672 | Не работает в наших руках |
| Мышь анти-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Не работает в наших руках |
| Мышь анти-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Не работает в наших руках |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 раствор | Электронная микроскопия Sciences | 74257 | |
| Пластиковые трансферные пипетки | Доступно | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Подготовка в соответствии с производителями' . |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Подготовьте в соответствии с инструкциями производителя. |
| ProLong Diamond Anti-fade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Использование в 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Использование в 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Использование в 1:300 |
| Цитрат натрия | Fisher | Scientific S279-500 | |
| Сахароза | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Ножницы, угол 30 градусов, 10 см | Fisher Scientific | 50-822-353 | Можно также использовать любую пару маленьких ножниц. |
| Набор Sylgard | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare в соответствии с инструкциями производителя. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Разведите в стерильной дистиллированной воде до получения 20% рабочего раствора. Хранить при комнатной температуре. Triton X-100 при разведении в воде образует осадок; Осадок растворяется за ночь. |
| Трипсин | Уортингтон Биохимический | LS003708 | |
| Ингибитор трипсина из белка куриного яйца | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Разведите в стерильной дистиллированной воде до получения 20% рабочего раствора. Хранить при комнатной температуре. |
| Весенние ножницы Vannas - 4 мм (микроножницы) | Fine Science Tools | 15018-10 |
Ссылки
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs dur....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
