Методическая статья

Количественная оценка цитотоксичности золотистого стафилококка против полиморфонеклеарных лейкоцитов человека

DOI:

10.3791/60681

⸱

3 января 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Montana State University, 2University Communications, Montana State University

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод очищения полиморфонъеклеарных лейкоцитов из всей человеческой крови и два различных анализа, которые количественно цитотоксичность золотистости стафилококка против этих важных врожденных иммунных клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Золотистый стафилококк способен выделять широкий спектр лейкоцидинов, которые нацелены и нарушают целостность мембраны полиморфонеклеарных лейкоцитов (ПМН или нейтрофилов). Этот протокол описывает как очищение человека PMNs и количественной оценки S. aureus цитотоксичности против PMNs в трех различных разделах. В разделе 1 подробно описана изоляция ПМН и сыворотки от крови человека с помощью центрифугации плотности. Раздел 2 тестирует цитотоксичность внеклеточных белков, производимых S. aureus против этих очищенных человеческих ПМН. Раздел 3 измеряет цитотоксичность против человека PMNs после фагоцитоза живого S. aureus. Эти процедуры измеряют нарушение целостности плазменной мембраны PMN S. aureus leukocidins с помощью анализа цитометрии потока ПМН, обработанных пропидий йодидом, ДНК связывающей фторофор, который является клеточной мембраной непроницаемой. В совокупности эти методы имеют преимущество быстрого тестирования цитотоксичности S. aureus против первичных ПМН и могут быть легко адаптированы для изучения других аспектов взаимодействия хозяина и патогена.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Золотистый стафилококк является грамположительных бактерий, что вызывает широкий спектр заболеваний у людей. Этот выдающийся патоген производит многочисленные факторы вирулентности, которые способствуют различным аспектам инфекции. К ним относятся молекулы поверхности, которые позволяют S. aureus придерживаться различных типов ткани хозяина1, внеклеточные белки, которые мешают принимающей иммунной реакции2, и массив выделяемых токсинов, которые нацелены на различные типы клеток-хозяев3. В этом докладе мы описываем метод, который количественно цитотоксичность внеклеточных белков, производимых S. aureus против человека полиморфоядерных лейкоцитов (PMNs или нейтрофилов), первичных эффекторных клеток врожденного иммунного ответа хозяина.

ПМН являются наиболее распространенными лейкоцитами у млекопитающих. Эти циркулирующие иммунные клетки быстро завербованы к месту оскорбления ткани хозяина в ответ на сигналы опасности произведенных резидентными клетками или соединениями уникально к вторгаясь микробам. Внеклеточный вход от этих молекул и от прямых контактов с активированными клетками-резидентами во время экстравазации увеличивает состояние активации ПМН в процессе, известном как грунтовка4,5. Primed PMNs, которые достигли проблемных тканей, то выполнить важные врожденные иммунные реакции, направленные на предотвращение создания инфекции. Они включают в себя связывание и интернализации, или фагоцитоз, вторжения микроорганизмов, что вызывает каскад внутриклеточных событий накапливания в микробов уничтожения батареи мощных противомикробных соединений5.

PMN играют важную роль защиты людей от вторжения патогенов и особенно важны для предотвращения s. aureus инфекции4. Тем не менее, эта бактерия производит широкий спектр вирулентных генов, которые препятствуют различным функциям PMN. К ним относятся внеклеточные белки, которые блокируют распознавание сигнальных молекул, предотвращают адгезию для размещения тканей, препятствуют выработке противомикробных соединений и компрометируют целостность плазменной мембраны4. S. aureus организует временное выражение этих генов вирулентности через коллективный вход из нескольких двухкомпонентных сенсорных систем, которые распознают специфические экологические сигналы. Двухкомпонентная система SaeR/S является основным регулятором транскрипции гена S. aureus virulence во время инфекции6,7,8,9,10,11. В частности, эта двухкомпонентная система, как было показано, имеет решающее значение для производства двухкомпонентных лейкоцидинов, которые специально нацелены на человека PMNs12.

Этот протокол разбит на три разных раздела. В первом разделе описывается очищение ПМН от крови человека с использованием центрифугии градиента плотности с использованием протокола, который был адаптирован из методов, установленных Бёйм13 и Nauseef14. Во втором и третьем разделах подробно описаны два различных метода изучения цитотоксичности S. aureus; один опьяняет PMNs внеклеточными белками, вырабатываемыми S. aureus, в то время как другой исследует способность живых бактерий повреждать ПМин после фагоцитоза. Эти процедуры используют пропидий йодид для измерения потери целостности плазменной мембраны PMN, вызванной S. aureus пор-образующих токсинов. Propidium йодид является ДНК-связывающей флюорофор, который, как правило, клеточная мембрана непроницаемой, но может пересекать плазменные мембраны, которые были нарушены S. aureus токсинов. Анализ цитометрии потока позволяет быстро количественно измерить пропидий йодид-положительных ПМН для измерения относительной цитотоксичности штаммов S. aureus. Метициллин-резистентный S. aureus (MRSA), идентифицированный как импульсный полевой гель электрофорез типа USA300 и изогенный мутант удаления saeR/S в этом штамме (USA300saeR/S),были использованы в качестве моделей, чтобы продемонстрировать, как эти процедуры могут количественно количественно цитотоксичность S. aureus.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гепаринизированная венозная кровь у здоровых доноров была собрана в соответствии с протоколом, утвержденным Институциональным наблюдательным советом по правам человека при Университете штата Монтана. Все доноры дали письменное согласие на участие в этом исследовании.

1. Очищение полиморфонеклических лейкоцитов человека и изоляция сыворотки человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты должны регулярно проверяться на наличие эндотоксина с помощью коммерчески доступного эндотоксинного комплекта обнаружения и должны содержать эндотоксины для предотвращения нежелательных грунтовок ПМН.

  1. Принесите 50 мл 3% dextran-0.9% NaCl (w/v), 35 мл 0,9% NaCl (w/v), 20 мл 1,8% NaCl (w/v), 12 мл 1,077 г/мл градиента плотности, и 20 мл воды для воды комнатного класса.
  2. Чтобы изолировать сыворотку человека, инкубировать 4 мл свеженарисованной человеческой крови без антикоагулянта при 37 градусах Цельсия в стеклянной трубке объемом 15 мл в течение 30 мин. После инкубации, центрифуга образца на 2000-3000 г в течение 10 минут при комнатной температуре. Перенесите верхний слой сыворотки в свежую коническую центрифугу объемом 15 мл и поместите на лед.
  3. Комбинат 25 мл свеженарисованной гепаринозированной (1000 единиц/мл) цельной человеческой крови с 25 мл комнатной температуры 3% dextran-0.9% NaCl (1:1 отношение) в двух репликации 50 мл конических центрифуговых труб (50 мл общего объема на трубку). Смешайте, осторожно качая каждую коническую трубку 50 мл, а затем дайте постоять при комнатной температуре в течение 30 минут.
  4. После инкубации при комнатной температуре появятся два отдельных слоя. Перенесите верхний слой каждой смеси декекненной крови в новые конические трубки мощностью 50 мл и центрифугу при температуре 450 х г в течение 10 мин при комнатной температуре с низкими тормозами или без них.
  5. Тщательно аспирируйте как супернацианты, так и отбрасывайте, не нарушая клеточные гранулы. Аккуратно приостановите каждую клетку гранулв в 2 мл комнатной температуры 0,9% NaCl, объединить повторной гранулы в одной 50 мл конической трубки, а затем добавить оставшиеся 0,9% NaCl (окончательный объем 35 мл).
  6. Тщательно подкладка 10 мл комнатной температуры 1,077 г/мл градиента раствора плотности под клеточной подвеской с помощью ручной пипетки. Спин при 450 х г в течение 30 мин при комнатной температуре с низким и без тормозов. Аккуратно аспирируйте супернатант, не нарушая клеточные гранулы. Супернатант будет содержать периферийные моноядерные клетки крови, которые могут быть собраны, как ранее описано14.
  7. Выщелачить красные кровяные тельца, приостанавливая клеточные гранулы в 20 мл воды комнатной температуры. Смешайте осторожно, качая трубку в течение 30 с. Лизис красных кровяных телец будет сопровождаться явным снижением мутности.
  8. Сразу же добавить 20 мл 1,8% NaCl (при комнатной температуре »RT» и центрифуги образца на 450 й г в течение 10 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно свести к минимуму время, что PMNs остаются в воде только после красных кровяных клеток лиза для максимизации урожайности PMN и предотвращения PMN lysis и / или активации.
  9. Тщательно аспирируйте супернатант, не нарушая клеточные гранулы. Аккуратно приостановите действие клеточной гранулы в 2 мл РТ RPMI 1640 среднего и место на льду.
  10. Подсчитайте клетки с помощью гемоситометра. Оттачивайте очищенные ПМН в концентрации 1 х 107 ячеек/мл с ледяным RPMI и держите на льду.
  11. Объедините 100 зл очищенных ПМН (1 х 106 ячеек) с 300 злителами фосфатно-буферизированного солей Дульбекко (DPBS), содержащего 1 зл и пятна пропидий йодида в двух промотируемых трубках цитометрии потока. Для положительного контроля за повреждением плазменной мембраны добавьте 40 qL 0,5% растворtriton X-100 в одну из труб цитометрии потока и тщательно перемешайте.
  12. Используйте цитометрию потока для измерения переднего рассеяния, бокового рассеяния и окрашивания йодида пропидиума (возбуждение/излучение максима на уровне 535/617 нм) очищенных клеток(рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ переднего и бокового рассеяния позволит выявить нежелательные популяции лимфоцитов и моноцитов. Пропидий йодид будет только пятно клеток с скомпрометированной плазменной мембраны и очищенных ПМН, которые имеют выраженные популяции пропидий йодид положительных клеток не должны использоваться. Для этих исследований, очищенные PmNs были использованы только в том случае, если они составили йgt;98% очищенных клеток и lt;5% окрашенных положительный для пропидий йодида.
  13. Подготовьте 96-колодую пластину для анализов цитотоксичности PMN, покрывая отдельные скважины, которые будут использоваться в этом анализе с 100 зл/л из 20% изолированной человеческой сыворотки, которая была разбавлена DPBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие PMNs непосредственно на пластик или стекло вызовет активацию клеток. Будьте уверены, чтобы включить по крайней мере один отрицательный контроль хорошо, что будет получать только средства массовой информации и по крайней мере один положительный контроль хорошо, что будет получать 0,05% Triton X-100.
  14. Инкубировать тарелку при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин. После инкубации, мыть покрытые колодцы дважды с ледяной DPBS, чтобы удалить излишки сыворотки. Аккуратно коснитесь тарелки вверх дном, чтобы удалить все остаточные DPBS и поместите на лед.
  15. Аккуратно добавьте 100 л очищенных человеческих ПМН на 1 х 107 ячеек/мл к каждому хорошо покрытому (1 х 106 PMNs/хорошо). Разрешить PMNs поселиться в колодцах, инкубируя пластины на льду, по крайней мере 5 мин. Держите уровень пластины, чтобы равномерное распределение клеток в каждой скважине и оставить на льду, чтобы избежать нежелательной активации PMNs.

2. Анализ цитотоксичности внеклеточных белков S. aureus против полиморфонеклеарных лейкоцитов человека

  1. Культура S. aureus на ночь в триптическом соевом бульоне (TSB) с помощью дрожащего инкубатора, установленного при 37 градусах Цельсия. Для этих исследований, 20 мл TSB в отдельных 150 мл Эрленмайер фляги были привиты с замороженными культурами S. aureus штаммов USA300 или USA300saeR /S и выращены примерно за 14 л с тряской при 250 об/мин.
  2. Субкультура S. aureus, выполняя 1:100 разбавления ночной бактериальной культуры со свежими средствами массовой информации. Инкубировать при 37 градусах Цельсия с встряхиванием до тех пор, пока бактерии не достигнут ранней стационарной фазы роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих экспериментов, 20 мл триптического соевого бульона в 150 мл Эрленмейер фляги были привиты с 200 л ночь культивируемых USA300 или USA300saeR /S и инкубируется при 37 градусов по Цельсию с тряской при 250 об/мин в течение 5 ч.
  3. Когда бактерии достигли ранней стационарной фазы роста, перенос 1 мл субкультуры S. aureus в микроцентрифугную трубку 1,5 мл и центрифугу при температуре 5000 и г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. После центрифугации перенесите супернатант в шприц 3 мл. Пройдите супернатанты через фильтр 0,22 мкм и в новую микроцентрифуговую трубку мощностью 1,5 мл на льду.
  5. Выполните серийные разбавления супернационов с ледяными носителями, используемыми для культуры S. aureus.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для показанных экспериментов, supernatants от США300 и USA300saeR/S прошли 4 последовательных разбавления журнала 1/2 с ice-cold TSB.
  6. Аккуратно добавьте образцы супернатанта или носители только (для отрицательного и положительного контроля) в отдельные скважины из 96-колодца пластины, содержащей ПМин на льду со ступени 1.15. Для этих экспериментов, 10 л ИЗ США300 или USA300saeR /S супернатант образцов были добавлены к каждой скважине. Аккуратно каменная пластина для распределения супернациантов в колодцах и инкубации при 37 градусах Цельсия.
  7. В нужное время снимите тарелку с инкубатора и поместите на лед. Добавьте 40 qL 0.5% Triton X-100 к положительному управлению хорошо.
  8. Аккуратно пипетка образцы вверх и вниз в каждой скважине, чтобы полностью снять все PMNs придерживаются пластины, а затем передать образцы течь цитометрии труб на льду, которые содержат 300 Зл льда DPBS с 1 Л пропидий йодида.
  9. Измерьте долю пропидий йодид-положительных ПМН с помощью цитометрии потока(рисунок 2A). При привязке к ДНК, пропидий йодид имеет возбуждение / выброс на 535/617 нм.

3. S. aureus цитотоксичность асссы против человека полиморфонядерных лейкоцитов после фагоцитоза

ПРИМЕЧАНИЕ: Кривые роста, определяемые оптической плотностью в 600 нм (OD600) и концентрация бактерий должны быть определены эмпирически для штаммов S. aureus, которые должны быть проверены перед началом этого исследования. Успех этих экспериментов требует последовательного сбора равных концентраций каждого штамма S. aureus, испытанного на среднеэкспоненциальной фазе роста с использованием OD600 субкультурных бактерий.

  1. Начните ночные культуры штаммов S. aureus и субкультурных бактерий, описанных в шагах 2.1.1 и 2.1.2.
  2. Урожай субкультурный S. aureus, когда он достиг среднего экспоненциального роста путем передачи 1 мл культивированных бактерий в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки и центрифугирования на 5000 г в течение 5 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В наших условиях роста, USA300 и USA300saeR/S достигли среднеэкспоненциальной фазы роста после примерно 135 мин инкубации6.
  3. Вымойте S. aureus после центрифугации, засаживая супернатанта, resuspending гранулированных бактерий в 1 мл DPBS, вихрь образца для 30 с, и центрифугирование на 5000 г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Опсонизобит S. aureus, переопродлив бактериальные гранулы в 1 мл 20% человеческой сыворотки, разбавленной DPBS и инкубируя при 37 градусах Цельсия с возбуждением в течение 15 мин.
  5. Центрифуга опсонизированных бактерий на 5000 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Вымойте S. aureus после центрифугации, успокоив супернатанта, resuspending гранулированных бактерий в 1 мл DPBS, затем вихрь образец, пока бактериальные гранулы полностью разбита на части плюс дополнительные 30 секунд. Бактерии центрифуги при температуре в 5000 г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  6. Приостановить опсонизированные штаммы S. aureus в 1 мл RPMI, вихрь образца до тех пор, пока бактериальные гранулы полностью разбита на части, а затем еще 30 с. Поместите бактерии на лед.
  7. Разбавить опсонизированные S. aureus штаммов до желаемой концентрации с ледяной RPMI. Вихрь за 30 с и место на льду.
  8. Подтвердите концентрацию опсонизированного S. aureus путем покрытия 1:10 серийных разбавлений бактерий на триптическом соевом агаре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Потому что различия в концентрации бактерий, используемых в этом анализе может иметь большое влияние на последующие PMN плазменной мембраны проницаемость(Рисунок 3A), это очень важно, что концентрация каждого штамма испытания определяется для каждого эксперимента и эквивалентно между штаммами.
  9. Аккуратно добавьте 100 л/колодец каждого штамма S. aureus или RPMI (для положительного и отрицательного контроля) в PMNs в 96-колодской пластине на льду со ступени 1.14. Аккуратно каменная пластина для распространения S. aureus в колодцах.
  10. Синхронизируйте фагоцитоз, центрифугируя пластину на 500 г в течение 8 мин при 4 КК15. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия сразу после центрифугации (Т 0).
  11. В нужное время снимите тарелку с инкубатора и поместите на лед. Добавьте 40 qL 0.5% Triton X-100 к положительному управлению хорошо.
  12. Аккуратно пипетка образцы вверх и вниз в каждой скважине, чтобы полностью снять все PMNs придерживаются пластины, а затем передать образцы течь цитометрии труб на льду, содержащем 200 Зл льда DPBS с 1 Л пропидий йодида.
  13. Анализ образцов для окоидирования пропидиума йодида с использованием цитометрии потока, как описано в шаге 2.9.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы продемонстрировали, как процедуры, описанные выше, могут быть использованы для относительной количественной количественной оценки цитотоксичности S. aureus против человека PMNs с помощью MRSA PFGE типа USA300 и изогенного мутанта удаления saeR/S в этом штамме (USA300saeR/S), порожденных в предыдущих исследованиях6. PMN изолированы с использованием процедур, описанных в разделе 1 этого протокола были окрашены пропидий йодида и рассмотрены с использованием потока цитометрии. Передние и боковые рассеивания участки были использованы для иллюстрации загрязнения очищенных ПМН моноцитами или лимфоцитами(Рисунок 1A,B) и целостность PMN была определена с помощью окрашивания пропидиума йодида(рисунок 1C). Описанный метод очистки PMN человека может последовательно давать 0,5 х 107 до 1 х 10 х 10PMNs, которые являются чистыми и являются отрицательными.

Цитотоксичность внеклеточных белков, производимых USA300 и USA300saeR/S, была протестирована против очищенных ПМН(рисунок 2)после процедур, описанных в разделе 2 этого протокола. Эти эксперименты демонстрируют концентрацию зависимого увеличения в пропидий йодид окрашивания очищенных ПМН после 30 мин интоксикации с внеклеточными белками производства USA300 (Рисунок 2B). Предыдущие исследования показали, что двухкомпонентная система SaeR/S имеет важное значение для выражения многочисленных двухкомпонентных лейкоцидинов, нацеленных на человека PMNs6,10,11,16. Конгруэнтно с этими предыдущими заключениями, очень немногие propidium iodide-положительные PMN были обнаружены после подвержения к внеклеточному протеинам произведенным USA300saeR/S (Рисунок 2B). Дальнейшие эксперименты продемонстрировали устойчивый рост доли лизои ПМН после интоксикации внеклеточными белками USA300, которые вытесывали примерно через 30 мин(рисунок 2C). Минимальный лизс человека PMNs был отмечен во всех временных точках после воздействия внеклеточных белков, производимых USA300saeR/S. Эти результаты иллюстрируют полезность этого исследования для относительной количественной оценки цитотоксичности внеклеточными белками S. aureus против человеческих ПМН.

Мы протестировали USA300 и USA300saeR/S с помощью S. aureus cytotoxicity asay против человека PMNs после фагоцитоза, который описан в разделе 3 этого протокола (Рисунок 3). Концентрация зависимого увеличения доли пропидий йодид положительных PMNs наблюдалось 90 мин после фагоцитоза USA300(Рисунок 3A). Значительное снижение наблюдалось в пропорции PMNs, которые были propidium йодида положительные после фагоцитоза USA300saeR / S (Рисунок 3A), поддерживая другие результаты, которые указывают на SaeR / S двухкомпонентной системы имеет важное значение для цитотоксичности S. aureus против человека PMNs (Рисунок 2)7,11. Как уже упоминалось и показано на рисунке 3А,различия в концентрации S. aureus оказывают заметное влияние на ализп PMN после фагоцитоза. Перечисление USA300 и USA300saeR/S инокулум, используемый в каждом из этих экспериментов, показало, что контраст в цитотоксичности между этими штаммами не был обусловлен различиями в концентрации используемых бактерий (Рисунок 3B). Эти результаты показывают, как S. aureus цитотоксичность анализ против человека PMNs после фагоцитоза может быть использован для оценки способности различных штаммов S. aureus скомпрометировать человека PMN плазменной мембраны целостности.

figure-results-1
Рисунок 1: Анализ цитометрии потока очищенных ПМН. Представитель потока цитометрии точек участков (A) очищенных человеческих ПМН и (B) PMNs, которые были намеренно загрязнены периферических моноядерных клеток крови. (C) Представитель потока цитометрической гистограммы, демонстрирующей минимальное окрашивание йодида пропидия (Злт;1%) очищенных ПМН (затененный серый) по сравнению с ПМН, обработанными 0,05% Triton X-100 (затененный красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Анализ цитометрии потока ПМН, опьяненных внеклеточными белками, вырабатываемыми S. aureus. (A) Представитель потока цитометрической гистограммы PMNs окрашенных пропидий йодид после 30 минут инкубации с медиа-контроля (затененный синий), фильтрованный USA300 супернатант в окончательной концентрации 1:110 (затененный серый), или 0,05% Тритон X-100 (затененный красный). (B) Доля propidium iodide положительных PMNs после 30 минут инкубации с различными концентрациями USA300 или USA300saeR/S supernatants. (C) Доля propidium iodide положительных PMNs с течением времени после инкубации с USA300 или USA300"saeR / S супернатант в окончательной концентрации 1:110. Данные представлены в виде среднего значения - SEM, по крайней мере, 3 отдельных экспериментов с р 0,05 и р 0,005, как это определено двуххвостым t-тестом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Анализ цитометрии потока PMNs после фагоцитоза S. aureus. ()Доля пропидий йодид положительных PMNs 90 мин после фагоцитоза различных концентраций USA300 или USA300saeR/S. (B) Концентрация опсонизированных S. aureus штаммов, используемых для экспериментов, показанных в панели A. Данные представлены как среднее - SEM 4 отдельных экспериментов с p . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает очищение ПМН от крови человека и два различных анализа, которые используют йодид пропидия для количественной оценки цитотоксичности S. aureus против этих важных врожденных иммунных клеток. Успех этих процедур будет зависеть от качества очищенных ПМН и надлежащей подготовки S. aureus и внеклеточных белков, вырабатываемых этим патогеном. Для изоляции ПМН важно свести к минимуму активацию ПМН во время и после очистки с помощью реагентов, свободных от эндотоксинного загрязнения, мягко горит клеточных препаратов и удерживает клетки при соответствующей температуре. Признаки, указывающие на активацию ПМН, включают слипание клеток во время очистки и когда более 5% изолированных клеток пятно положительное для пропидий йодида. Из-за относительно короткой продолжительности жизни ПМН, эти клетки должны быть изолированы от человеческой крови и проверены в тот же день. PMNs начнет проявлять признаки спонтанного апоптоза, если оставить на льду более 3 ч после очистки. Как упоминалось ранее, очень важно, чтобы каждый препарат PMN тщательно оценивался с помощью анализа цитометрии потока переднего и бокового рассеяния, а также окрашивания йодида пропидиума для обеспечения чистоты и целостности изолированных клеток.

Выражение двухкомпонентных лейкоцидинов S. aureus отвечает за большинство скомпрометированной целостности плазменной мембраны PMN, которая наблюдается с помощью анализов, описанных в этом протоколе. Вариации в выражении этих токсинов и других порообразующих пептидов, таких как фенолрастворимые модулины, между штаммами S. aureus будут производить различия в цитотоксичности против человека PMNs. Значительные отклонения во время роста in vitro между штаммами S. aureus также повлияют на выражение порообразующего токсина и последующего цитотоксичности. Кроме того, соотношение S. aureus к PMNs в анализах фагоцитоза оказывает значительное влияние на последующую проницаемость плазменной мембраны PMN(рисунок 3A),и эти эксперименты требуют последовательного сбора равных концентраций каждого штамма S. aureus, испытанного в середине экспоненциального роста с использованием OD600 субкультурных бактерий. Учитывая эти соображения, очень важно определить кривые роста для всех штаммов, которые будут рассмотрены до начала анализов цитотоксичности. Мы не рекомендуем эти методы для анализа S. aureus цитотоксичность с штаммами, которые демонстрируют значительные различия роста в пробирке.

USA300 является вирулентным изолятом MRSA, который, как известно, является высоко цитотоксическим против человека PMNs15 и потеря SaeR /S в этом штамме резко снижает транскрипцию многочисленных би-компонентных лейкоцидинов, которые нацелены на человека PMNs6,12, что делает эти штаммы идеальными моделями для сравнения цитотоксичности с помощью анализов описано. Тем не менее, существует обширная генетическая вариация между различными изолятами S. aureus, и параметры, описанные в этих протоколах, могут не привести к существенным изменениям цитотоксичности против пРяд человека при тестировании других штаммов S. aureus. Портирование условий роста, объемы супернатантов добавил, или отношение бактерий к PMNs может потребоваться для успеха с этими методами с использованием других штаммов S. aureus.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения США гранты NIH-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371, а также средства от Университета штата Монтана сельскохозяйственной экспериментальной станции, а также оборудование гранта от Мердок благотворительный фонд .

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% хлорида натрия для инъекций, USP, 500 мл VIAFLEX пластиковый контейнерBaxter2B1323QPMN очистка
микроцентрифуг 1,5 мл с защелкивающимися крышкамиVWR89000-044Используется в промывке клеток
1,8% раствор хлорида натрияSigma-AldrichS5150PMN очистка
12x75 мм Культуральные пробиркиVWR60818-430Используется в качестве проточной цитометрии пробирки
20% (вт/в) ДекстранСигма-ОлдричD8802PMN очистка
3125 Ручной счетчикотслеживаемых продуктов3125CCДля подсчета клеток
50 мл конические центрифужные пробиркиVWR89039-656Для дозирующих сред
Bacto Tryptic Соевый бульон, соя-казеиновый дигедят Среда для расщепленияFischerScientific211823Для выращивания клеточных культур
BD Одноразовые шприцы с наконечниками Luer-Lok, 3 млFischerScientificBD 309657Для фильтрации надосадочной жидкости
Bright-Line ГемоцитометрSigma-AldrichZ359629Аппарат для подсчета клеток
DPBS, 1x (фосфатный буферный раствор Дульбекко) с кальцием и магниемCorning21-030-CVИспользуется в промывочных ячейках
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02ПМН очистка
Fisherbrand Стерильный полистирол Одноразовые серологические пипеткиFischerScientific13-678-11EДля аспирационной жидкости
Greiner CELLSTAR 96 луночные пластиныMillipore SigmaM0687Пластина для хранения экспериментальных образцов
OMICRON Шприцевые фильтрыOmicron ScientificSFPV13RДля фильтрации надосадочной жидкости
Propidium йодидThermoFisher ScientificP3566Мембранный непроницаемый краситель
ДНК PYREX Brand 4980 Колба ЭрленмейераCole-ParmerEW-34503-24Для выращивания клеточных культур
RPMI 1640, 1X без L-глютамина, фенол красныйCorning17-105-CVИспользуется для суспендирования клеток
Стерильная вода для орошения, USPBaxter2F7113PMN очистка
Насос для пипетокBel-Art ProductsF37898Для аспирации жидкости
Triton X-100Sigma-AldrichX100Целостность мембраны с положительным контролем

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Foster, T. J., Geoghegan, J. A., Ganesh, V. K., Höök, M. Adhesion, invasion and evasion: The many functions of the surface proteins of Staphylococcus aureus. Nature Reviews Microbiology. , (2014).
  2. Thammavongsa, V., Kim, H. K., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcal manipulation of host immune responses. Nature Reviews Microbiology. 13 (9), 529-543 (2015).
  3. Otto, M. Staphylococcus aureus toxins. Current Opinion in Microbiology. , (2014).
  4. Guerra, F. E., Borgogna, T. R., Patel, D. M., Sward, E. W., Voyich, J. M. Epic Immune Battles of History: Neutrophils vs. Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, (2017).
  5. Nygaard, T., Malachowa, N., Kobayashi, S. D., DeLeo, F. R. Phagocytes. Management of Infections in the Immunocompromised Host. , 1-25 (2018).
  6. Nygaard, T. K., Pallister, K. B., Ruzevich, P., Griffith, S., Vuong, C., Voyich, J. M. SaeR Binds a Consensus Sequence within Virulence Gene Promoters to Advance USA300 Pathogenesis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 241-254 (2010).
  7. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. J Infect Dis. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  8. Borgogna, T. R., et al. Secondary Bacterial Pneumonia by Staphylococcus aureus Following Influenza A Infection Is SaeR/S Dependent. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  9. Guerra, F. E., et al. Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1-6 (2016).
  10. Zurek, O. W., et al. The role of innate immunity in promoting SaeR/S-mediated virulence in Staphylococcus aureus. J Innate Immun. 6 (1), 21-30 (2014).
  11. Nygaard, T. K., et al. Aspartic Acid Residue 51 of SaeR Is Essential for Staphylococcus aureus Virulence. Frontiers in Microbiology. 9, at https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2018.03085 3085(2018).
  12. Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors. Nature Reviews Microbiology. , (2017).
  13. Bøyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory. , (1968).
  14. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. , (2014).
  15. Voyich, J. M., et al. Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils. J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).
  16. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. The Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Исправление

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
Posted by JoVE Editors on 6/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes. The title was updated.

The title was updated from:

Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

to:

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

Теги

Staphylococcus aureus CytotoxicityPolymorphonuclear Leukocytes IsolationFlow Cytometry AnalysisPropidium Iodide StainingDensity Gradient CentrifugationExtracellular Protein AssaysPhagocytosis Cytotoxicity TestHuman Neutrophil PurificationS aureus Virulence FactorsHost Pathogen Interaction

Похожие статьи