Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изоляция, Культура и адипогенная индукция нейронных Креста Оригинальные жировые стволовые клетки из периаортных жировой ткани

5.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/60691

⸱

2 марта 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiao Tong University, 2Shanghai Institute of Nutrition and Health, Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 3Shanghai Key Laboratory of Hypertension, Shanghai Institute of Hypertension, Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 4Department of Cardiology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 5Department of Cardiology, Shanghai Key Laboratory of Clinical Geriatric Medicine, Huadong Hospital Affiliated to Fudan University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протокол для изоляции, культуры и адипогенной индукции нервного гребня полученных жировые стволовые клетки (NCADSCs) из периаортной жировой ткани Wnt-1 Cre/-; Мышей Rosa26RFP/'. NCADSCs может быть легко доступным источником ADSCs для моделирования адипогенеза или липогенеза в пробирке.

Аннотация

Чрезмерное количество жировой ткани, окружающих кровеносные сосуды (периваскулярная жировая ткань, также известная как PVAT) связано с высоким риском сердечно-сосудистых заболеваний. ADSCs, полученные из различных жировые ткани показывают различные особенности, и те из PVAT не были хорошо охарактеризованы. В недавнем исследовании, мы сообщили, что некоторые ADSCs в периаортной арки жировой ткани (PAAT) спуститься из нервных клеток гребня (NCCs), переходной популяции мигрирующих клеток, происходящих из эктодерма.

В этой работе мы описываем протокол для изоляции красного флуоресцентного белка (RFP) с маркировкой NCCs от PAAT Wnt-1Cre Мышей Rosa26RFP/' и индуцирование их адипогенной дифференциации in vitro. Вкратце, стромальная сосудистая фракция (SVF) ферментативно отделена от PAAT, а RFPи нервный гребень, полученный ADSCs (NCADSCs), изолированы флуоресценцией активированной сортировки клеток (FACS). NCADSCs дифференцировать в коричневые и белые адипоциты, могут быть криоконсервированы, и сохранить их адипогенный потенциал для 3-5 проходов. Наш протокол может генерировать обильные ADSCs из PVAT для моделирования PVAT адипогенез или липогенез в пробирке. Таким образом, эти NCADSCs могут обеспечить ценную систему для изучения молекулярных переключателей, участвующих в дифференциации PVAT.

Введение

Распространенность ожирения растет во всем мире, что увеличивает риск связанных с ними хронических заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания и диабет1. PVAT окружает кровеносные сосуды и является основным источником эндокринных и паракринных факторов, участвующих в функции сосудов. Клинические исследования показывают, что высокое содержание PVAT является независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний2,3, и его патологическая функция зависит от фенотипа составных жирового стволовых клеток (ADSCs)4.

Хотя линии клеток ADSC, такие как murine 3T3-L1, 3T3-F442A и OP9, являются полезными клеточными моделями для изучения адипогенеза или липогенеза5, регулирующие механизмы адипогенеза различаются между клеточными линиями и первичными клетками. ADSCs в стромальной сосудистой клетки фракции (SVF) изолированы непосредственно из жировой ткани и индуцированных дифференцировать в адипоциты, скорее всего, резюмировать in vivo адипогенез и липогенез6. Тем не менее, хрупкость, плавучесть, и различия в размерах и иммунофенотипов ADSCs сделать их прямой изоляции сложной задачей. Кроме того, различные процедуры изоляции может также существенно повлиять на фенотип и адипогенной потенциальной способности этих клеток7, таким образом подчеркивая необходимость протокола, который поддерживает целостность ADSC.

Жировая ткань, как правило, классифицируется как либо морфологически и функционально различные белые жировой ткани (WAT), или коричневой жировой ткани (BAT)8, который гавани различных ADSCs9. В то время как ADSCs изолированы от perigonadal и паховой подкожной WATs были охарактеризованы в предыдущих исследованиях9,10,11,12, меньше известно в отношении ADSCs от PVAT, который в основном состоит из BAT13.

В недавнем исследовании, мы обнаружили, что часть резидентов ADSCs в периаортной арки жировой ткани (PAAT) являются производными от нервных клеток гребня (NCCs), переходной популяции мигрирующих клеток-прародителей, которые происходят из эктодерма14,15. Wnt1-Cre трансгенных мышей были использованы для отслеживания развития нервных гребня клеток16,17. Мы пересекли Wnt1-Creмышей с Rosa26RFP / мышей для создания Wnt-1 Cre/-; Мышей Rosa26RFP/, в которых НКК и их потомки помечены красным флуоресцентным белком (RFP) и легко отслеживаются в vivo и in vitro15. Здесь мы описываем метод изоляции нервного гребня производных ADSCs (NC-производных ADSCs, или NCADSCs) от мыши PAAT и побудить NCADSCs дифференцировать в белые адипоциты или коричневые адипоциты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол о животных был рассмотрен и одобрен Комитетом по уходу за животными Шанхайского университета Цзяо Тонг.

1. Поколение Wnt-1Cre Rosa26RFP/' Мыши

  1. Крест Wnt-1 CreNo /- мышей16 с Rosa26RFP / мышей 18 для создания Wnt-1Cre Мышей Rosa26RFP/'. Домашние мыши под 12 ч свет / темный цикл в патоген-свободной объекта на 25 кВ и 45% влажности, пока они не 4-8 недель.

2. Рассечение ПААТ

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1.

  1. Стерилизовать все хирургические инструменты (например, хирургические ножницы, стандартные щипцы и микрохирургические ножницы и щипцы) путем автоматического автоматического при 121 градусах Цельсия в течение 30 мин.
  2. Подготовьте среду пищеварения (Высокоглюкоза Dulbecco в модифицированный eagle Medium (HDMEM), содержащий 2 мг/мл коллагеназа типа I). Подготовьте культурную среду (HDMEM, содержащую 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% v/v пенициллин-стрептомицин (PS). Стерилизовать с помощью фильтра шприца 0,22 мкм перед использованием.
  3. Стерилизовать реагенты клеточной культуры с использованием УФ, этанола, фильтрации или пара, по мере необходимости.
  4. Приготовьте блюдо Петри с помощью сбалансированного соленого раствора Хэнкса (HBSS) и конической трубки 15 мл с 10 мл HBSS, дополненной 1% v/v раствора PS. Держите обоих на льду.
  5. Анестезия мышей15 с изофлуран и жертвоприношения шейки матки дислокации. Погрузите тела в стакан, наполненный 75% алкоголем (200 мл) в течение 5 минут для стерилизации поверхности кожи.
  6. Вырезать и отделить кожу на животе и вырезать вдоль брюшной средней линии от таза до шеи. Откройте живот и переместить печень, чтобы разоблачить диафрагму19.
  7. Вырезать диафрагмы и ребер с обеих сторон средней линии и подвергать сердца и легких, пилинг назад ребра.
  8. Удалить легких и тимуса и извлечь PAAT вместе с аортой и сердцем.
  9. Отрежьте аорту у корня аорты, чтобы удалить сердце. Сделайте разрез между аортатической аркой и нисходящей аортой и тщательно отделите жировую ткань, окружающую обе структуры и левую и правую общую сонную артерии, от задней грудной стенки. Перенесите ткань в ледяной буфер HBSS в чашке Петри.
  10. Используя стерильные щипцы, удалите как можно больше сосуд (например, аорты, общих сонных артерий и других мелких сосудистой) и фасции, а также перенесите жировую ткань в 2 мл труб Eppendorf содержат 0,5 мл ледяного буфера HBSS на льду.

3. Изоляция СВФ

Соберите PAAT 5-6 мышей в одну микроцентрифугую трубку 2 мл, содержащую 1 мл свежеприготовленной среды пищеварения и фарш ткани с помощью хирургических ножниц в трубке Eppendorf при комнатной температуре (RT).

  1. Перенесите смесь в трубки 50 мл, содержащие 9 мл среды пищеварения. Гомогенизировать ткани путем pipetting вверх и вниз с 1 мл пипетки 10x.
  2. Инкубировать трубки при 37 градусах Цельсия при постоянной тряске при 100 об/мин в течение 30-45 мин и проверяйте каждые 5-10 минут, чтобы предотвратить переварение желудка. Это имеет решающее значение для повышения жизнеспособности и урожайности клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошее пищеварение ткани приведет к однородной, светло-желтый жировой ткани, которая видна невооруженным глазом на мягко закрученного трубки.
  3. Остановить пищеварение, добавив 5 мл HDMEM, содержащий 10% FBS и 1% v/v PS на RT и хорошо перемешать путем пипеттинга.
  4. Центрифуга подвески ячейки на 500 х г в течение 5 мин на RT. SVF будет виден как коричневатый гранулы. Тщательно аспирируйте плавающие адипоциты и осечки оставшиеся супернатанты, не нарушая SVF. Растворите гранулы SVF в 10 мл культуры среды и фильтр через 70 мкм ячейки ситечко.
  5. Centrifuge клеточной подвески на 500 х г в течение 5 минут, удалить супернатант, и осторожно resuspend гранулы в 5 мл из буфера лиза эритроцита в 15 мл конической трубки в течение 10 минут на RT.
  6. Остановите реакцию, добавив 10 мл 1x PBS, содержащий 1% FBS. Centrifuge клеточной подвески на 500 х г в течение 5 минут при 4 кв С, удалить супернатант, и resuspend гранулы в 10 мл 1x PBS, содержащий 1% FBS.
  7. Центрифуге клетки снова на 500 х г в течение 5 мин при 4 кв. C. Удалите супернатант и resuspend гранулы в 5 мл культуры среды в 15 мл конической трубки при 4 градусах Цельсия.
  8. После заключительного раунда центрифугации (500 х г в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию) переприостановите пеллетные клетки в 5 мл буфера FACS (PBS, содержащего 10% FBS, 100 единиц/мл ДНК I и 1% v/v PS) на льду и подсчитайте клетки гемоцитометром.

4. Изоляция NCADSCs ФАКС

  1. Настройка и оптимизация сортировки ячейки после инструкции. Выберите сопло площадью 100 мкм, стерилизуйте трубки для сбора, установите необходимое устройство сбора и установите боковые потоки20.
  2. Для сортировки клеток RFPрекомендуется 561 нм желтого/зеленого лазера и оптического фильтра 579/16. Выполните компенсацию с использованием отрицательного контроля и одноцветного положительного контроля. См Рисунок 2А для схемы gating.
  3. Фильтр клетки через 40 мкм ситечко, центрифуга на 500 х г в течение 5 минут, и повторной работы клеток в 2 мл буфера FACS при плотности 0,5-1 х 107/мл. Перенесите клетки на четко обозначенные 5 мл круглых нижних полистироловых труб и загрузите в сортировку.
  4. Запустите экспериментальный образец трубки при 4 градусах Цельсия, включите плиты отклонения и сортируйте в коническую трубку 15 мл, предварительно покрытую RPMI, содержащей 1% FBS и 1% v/v PS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите образцы от сильного света, чтобы свести к минимуму закалку RFP.

5. Культура NCADSCs

  1. Плита отсортированных клеток при плотности 5000 клеток / см2 в 12 хорошо культуры пластины в полной среде культуры и инкубировать при 37 градусов по Цельсию во влажной атмосфере с 5% CO2 для 20-24 ч.
  2. Удалите культурную среду, промойте клетки с преропарированным (37 градусов по Цельсию) PBS, чтобы удалить мусор клеток и добавить свежую среду культуры.
  3. После того, как клетки 80-90% сливаются, переварить монослой с помощью 0,25% трипсин EDTA раствор при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе в течение 3-5 мин, и нейтрализовать с 2 мл культуры среды.
  4. Центрифуги собранных клеток в течение 15 минут при 250 х г на РТ, удалить супернатант, и resuspend клеток в 1 мл культуры среды. Подсчитайте клетки гемоситометром.
  5. Семена клеток в 12 хорошо культуры пластины при плотности 5000 клеток / см2.
  6. Приостанавливать оставшиеся клетки в культурной среде, содержащей 10% ДМСО, заморозить и хранить в жидком азоте.

6. Адипогенная индукция NCADSCs

  1. Индуцировать адипогенную дифференциацию NCADSCs на 80-90% confluency и стандартных условиях культуры21.
  2. Для коричневой адипогенной индукции сначала обработайте культивированные клетки коричневым адипогенным индукционным носителем (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 мМ/Л IBMX, 0,1 мкм/дексаметазон, 1 мкм/л розиглитазон, 10 нмоль/l триодотиронин. Вымойте клетки с PBS 2x и заменить свежей среде (HDMEM, 10% FBS, 1% V/v PS, 1 мкм / L розиглитазон, 10 нмоль / l трийодтиронин, и 1 мкг /мЛ инсулина). Изменение этой среде каждые 2 дня в общей сложности 3-5x.
  3. Для белой адипогенной индукции сначала обработайте клетки с белой адипогенной индукционной средой (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 мМ/л IBMX, 0,1 мкм/л-дексаметазон и 1 мкг/мл инсулина) в течение 2 дней. Вымойте клетки с PBS 2x и заменить свежей среде (HDMEM, 10% FBS, 1% V/V PS, и 1 мкг /мл инсулина). Изменение этой среде каждые 2 дня в общей сложности 3-5x.
  4. Анализ адипогенных клеток по мере необходимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте нежны при мытье клеток с PBS. Дифференцированные адипоциты могут легко смыть.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя описанный выше протокол, мы получили 0,5-1,0 х 106 ADSCs от 5-6 Wnt-1 Cre/-; Мышей Rosa26RFP/) (48 недель, мужчины или женщины).

Диаграмма потока сбора PAAT от мышей представлена на рисунке 1. Морфология NCADSCs была похожа на ADSC от других мышей жировой ткани. Культурные NCADSCs достигли 80-90% стоек после 7-8 дней культуры, и NCADSCs была расширена фибробластоподобной морфологии(рисунок 2<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании мы представляем надежный метод изоляции, культуры и адипогенной индукции NCADSCs, извлеченных из PVAT Wnt-1Cre Трансгенные мыши Rosa26RFP/', предназначенные для производства РППи ADSC. Предыдущие доклады показывают, что нет существенной разницы в выражении общих многопотентных мезенхимальных стволовых клеток (MSCs) маркеров в NCADSCs и не NCADSCs22, и что NCADSCs имеют большой потенциал, чтобы дифференцировать в адипоциты в пробирке

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Национальная программа исследований и разбивки по естественным исследованиям Китая (2018YFC1312504), Национальный фонд естественных наук Китая (81970378, 81670360, 81870293) и Научно-техническое управление муниципалитета Шанхая (17411971000, 17140902402) предоставили средства для этого исследования .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4% PFABBI медико-биологические наукиE672002-0500Лот #: EC11FA0001
AgaroseABCONE (Китай)A479021% рабочая концентрация
Anti-cebp/αABclonalA09041:1000 рабочая концентрация
Антимышиный IgG, HRP-связанныйCST70761:5000 рабочая концентрация
АнтиперилипинAbcamAB616821 μ г/мл рабочей концентрации; лот #: GR66486-54
Anti-PPARyСАНТА КРУЗSC-72730.2 μ г/мл рабочая концентрация
Antirabbit IgG, HRP-связанныйCST70741:5000 рабочая концентрация
Anti-β-тубулинCST21461:1000 рабочая концентрация
BSAVWR life sciences0332-100G50 мг/мл рабочая концентрация; лот #: 0536C008
коллагеназа, тип IGibco17018029
дексаметазонSigma-AldrichD49020.1 &микро; M рабочая концентрация
Erythrocyte Lysis BufferInvitrogen00-4333
FBSCorningR35-076-CV50 мг/мл рабочая концентрация; лот #: R2040212FBS
HBSSGibco14025092
HDMEMGelifesciencesSH30243.01Лот #: AD20813268
IBMXSigma-AldrichI70180.5 мМ рабочий концентрация
инсулинаSigma-AldrichI3536 1μ г/мл рабочей концентрации
Микрохирургические щипцыSuzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (Китай)MR-F201A-1
Suzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (Китай)MR-H121A
Oil Red O solutionSigma-AldrichO15160,3% рабочая концентрация
PBS (фосфатно-солевой буфер)ABCONE (Китай)P41970
Пенициллин-стрептомицинGibco15140122
набор реактивов PrimeScript RTTAKARARR047AЛот #: AK4802
RNeasy kitTAKARA9767Лот #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ мышиJAXNo.007909C57BL/6 backgroud; самец и самка
RosiglitazoneSigma-AldrichR24081 μ M рабочая концентрация
Стандартные щипцыSuzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (Китай)MR-F424
Хирургические ножницыSuzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (Китай)MR-S231
SYBR Premix ExTaq TAKARARR420AЛот #: AK9003
ТрийодтиронинSigma-AldrichT287710 нМ рабочая концентрация
Wnt1-Cre+; PPARγ flox/flox мышиJAXNo.009107C57BL/6 backgroud; самец и самка
Микрохирургические ножницы

Ссылки

  1. Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
  2. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  3. Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200(2012).
  4. Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
  5. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
  6. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).
  7. Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
  8. Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
  9. Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
  10. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  11. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
  12. Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886(2016).
  13. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
  14. Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
  15. Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
  16. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
  17. Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
  18. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  19. Tan, P., Pepin, É, Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026(2018).
  20. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546(2010).
  21. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
  22. Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206(2013).
  23. Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  24. Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Стволовые клеткипроизводные жировой ткани нервного гребнявыделение периаортальной жировой тканистромально-васкулярная фракциясортировка клеток с помощью флуоресцентной активацииадипогенная дифференцировкаиндуцирование коричневых адипоцитовиндуцирование белых адипоцитовмечение флуоресцентным белкомпротокол культивирования клетоккриоконсервация и хранение
Изоляция, Культура и адипогенная индукция нейронных Креста Оригинальные жировые стволовые клетки из периаортных жировой ткани
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.