Визуализация макрофаг Lytic Cell Смерти во время микобактериальной инфекции в эмбрионах зебрафиш а через интравитальную микроскопию

Микобактериальная инфекция была продемонстрирована, чтобы вызвать смерть иммунных клеток хозяина¹. Например, ослабленный штамм вызовет апоптоз у макрофагов и содержит инфекцию. Тем не менее, вирулентный штамм вызовет литическую гибель клеток, вызывая бактериальное распространение^1,2. Учитывая влияние этих различных типов клеточной смерти на принимающей анти-микобактериальной реакции, подробное наблюдение макрофаг клеток смерти во время микобактериальной инфекции in vivo необходимо.

Обычные методы измерения смерти клеток используют пятна мертвых клеток, такие как Annnexin V, TUNEL, или acridine оранжевый / пропидий йодид окрашивания^3,4,5. Однако эти методы не в состоянии пролить свет на динамичный процесс гибели клеток in vivo. Наблюдение смерти клеток in vitro уже способствовало живой визуализации⁶. Однако, являются ли результаты точно имитировать физиологические условия остается неясным.

Зебрафиш были отличной моделью для изучения принимающих анти-микобактерии ответов. Он имеет высоко консервированную иммунную систему, похожую на иммунную систему человека, легко манипулировать геном, и ранние эмбрионы прозрачны, что позволяет жить изображения^7,8,9. После заражения M. marinum, взрослые зебра образуют типичные зрелые структуры гранулы, а эмбриональные зебры образуют раннюю гранулему, как структуры^9,10. Динамический процесс взаимодействия врожденных иммунных клеток-бактерий был изучен ранее в модели инфекции зебрафиш M. marinum ^11,12. Однако, из-за высокой пространственно-временной потребности в разрешении, детали, связанные со смертью врожденных иммунных клеток остаются в значительной степени неопределенными.

Здесь мы описываем, как визуализировать процесс макрофаговлистической клеточной смерти клеток, вызванной микобактериальной инфекцией in vivo. Этот протокол также может быть применен к визуализации клеточного поведения in vivo во время развития и воспаления.

Зебрафиш был воспитан в стандартных условиях в соответствии с лабораторными руководящими принципами для животных для этического обзора благополучия животных (GB/T 35823-2018). Все эксперименты по зебрафиш в этом исследовании были одобрены (2019-A016-01) и проведены в Шанхайском клиническом центре общественного здравоохранения, Университет Фудан.

1. М. Маринум Одноклеточная Инокулум Подготовка(Рисунок 1)

1. Оттепель Церулеан-флуоресцентный M. marinum глицерол бульон от -80 кВ и прививать 7H10 агар пластины с 10% (v/v) OADC, 0,25% глицерола и 50 мкг /мЛ гигромицин. Инкубировать тарелку при 32 градусах По Цельсию в течение 10 дней.
2. Выберите колонию, выражающую положительную флуоресценцию и привить 3 мл среды 7H9 с 10% OADC, 0,5% глицерола и 50 мкг/мл гигромицина.
   1. Инкубировать прививку при 32 градусах Цельсия и 100 оборотах в минуту (об/ ч) в течение 4-6 дней, пока культура не достигнет логарифмической фазы (OD₆₀₀ и 0,6-1.0).
   2. Субкультура (1:100) в 30 мл свежей среды 7H9 с 10% OADC, 0,5% глицерола, 0,05% Tween-80, и 50 мкг/мл до OD₆₀₀ достигает 1,0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для высочайшего качества культуры рекомендуется шаг субкультуры. По нашему опыту, добавление клона непосредственно в большой объем среды приведет к образованию бактериальных сгустков.
3. Соберите клетки M. marinum, описанные ниже.
   1. Центрифуга на 3000 х г в течение 10 минут, чтобы собрать M. marinum как гранулы. Откажитесь от всех, кроме 300 л супернатанта, и используйте его для повторной приостановки гранул.
   2. Добавьте 3 мл 7H9 среды с 10% глицерола для дальнейшего повторного повторного повторного гранулы, а затем sonicate подвески в водяной бане на 100 Вт на 15 с ON, 15 с OFF в общей сложности 2 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель sonication является достижение одной клетки гомената для инокулума, который предотвратит блокировку иглы микроинъекции.
4. Перенесите бактериальную суспензию в шприц 10 мл, затем пройдите через фильтр номинала 5 мкм, чтобы удалить любые бактериальные комки.
5. Измерьте оптическую плотность (OD) подвески с помощью спектрофотометра и разбавьте ее до OD₆₀₀ и 1.0 с 7H9 носителями, содержащими 10% глицерола. Разделите подвеску на 10 аликотов и храните при -80 градусов морозильник для использования в будущем.
6. Подтвердите бактериальную концентрацию инокулума (cfu/mL) путем последовательного разбавления и покрытия бактериального бульона на агарной пластине 7H10, содержащей 10% (v/v) ОАдК, 0,5% глицерола и 50 мкг/мл гигромицина.

2. Подготовка эмбрионов зебрафиш

1. За день до нереста, создать зебры разведения пар в камере размножения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте только одну пару к каждой камере размножения.
2. Сбор эмбрионов на следующее утро в течение 1 ч после оплодотворения (hpf). Тщательно промыть эмбрионы дистиллированной водой и перенести до 100 эмбрионов в 100 мм чашку Петри, содержащую 30 мл среды E3. Инкубировать при 28,5 градуса х х х.
3. После 12 ч наблюдайте под микроскопом и отбрасывайте неоплодотворенные или поврежденные яйца.
4. На 24 л.с., изменить средний на свежий E3 среды с N-фенилтиуреа (PTU, 0,2 нм конечной концентрации), чтобы предотвратить развитие пигмента. Инкубировать эмбрионы при 28,5 градуса х до тех пор, пока эмбрионы не будут готовы к микроинъекциям.

3. Инфекция с помощью бактериальной микроинъекции

1. Подготовка borosilicate стекла микрокапиллярных игл инъекций, как ранее описано в ссылке¹³.
2. Эмбрионы зебры, растущие для инфекции
   1. Микроволновая печь 100 мл 1% (w/v) и 100 мл 0,5% (w/v) низкоплавленная агароза в автокклавизированной среде E3 до полного расплавленного агарозы. Разделите на 1 мл аликвотных труб и храните при 4 градусах по Цельсию для использования в будущем.
   2. Перед использованием нагрейте агарозу в нагревательном блоке 95 градусов по Цельсию до тех пор, пока он полностью не расплавлен. Поддерживайте агарозу в жидкой форме, поместив его в нагревательный блок 45 градусов по Цельсию(рисунок 2).
   3. Монтаж для внутримышечной инфекции в области ствола
      1. Создайте нижний слой агарозы, вылив 0,5 мл 1% (w/v) агарозы равномерно на стеклянную горку. Поместите на ледяную коробку или холодную поверхность в течение 3 мин, чтобы затвердеть.
      2. Анестезия эмбрионов зебры (48-72 л.с.) в яичной воде с трикаином (200 мкг/мл) и ПТУ в течение 5 минут до монтажа. Поместите до 60 эмбрионов зебры на нижний слой агарозы и аккуратно выложите их в два ряда(рисунок 2B).
      3. Удалите оставшуюся воду на нижнем слое агарозы с помощью салфетки, прежде чем добавить 0,3 мл 0,5% (w/v) агарозы для создания верхнего слоя. Убедитесь, что эмбрионы полностью встроены в агарозу. Вернуть стеклянную горку в ледяную коробку снова, чтобы укрепить агарозу и предотвратить обезвоживание.
      4. Держите верхний слой агарозы влажным, покрывая поверхность дополнительной водой e3 яйцо.
   4. Монтаж для инфекции среднего мозга
      1. Обложка паз одного вогнутости стеклянной микроскопии слайд с 1% (w/v) агарозы, а затем передать 4-6 трикаин-анестезируется эмбрионов в агарозу.
      2. Расположите голову каждого эмбриона вверх осторожно с 10 G иглы(Рисунок 2C).
      3. Как только все положения эмбрионов будут зафиксированы, перенесите стеклянную горку на ледяную коробку или холодную поверхность, чтобы агароуз затвердевал.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте разбавления агарозы низкого плавления, минимизируя объем переноса яичной воды с эмбрионами.
3. Препарат бактерий для инфекции
   1. Добавьте 1 qL стерильного фильтрованного фенола красного (10x) к аликвуту бактериального запаса (сделанному в шаге 1) и смешайте путем краткого вихря.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация может быть скорректирована с помощью стерильных PBS.
   2. Sonicate препарат с использованием 100 Вт на 10 с ON, 10 с OFF в течение 1 мин, чтобы разбить любые сгустки, которые, возможно, сформировали¹⁴.
4. Инфекция с помощью микроинъекций
   1. Отрегулируйте микроинжектор и микроманипулятор в нужное положение и настройки для микроинъекции, как сообщалось ранее^13.
   2. Передача 3 Зл бактериального препарата с помощью микропогрузчика в подготовленную иглу (см. шаг 3.1). Пипетка медленно и осторожно, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
   3. Для инфекции области ствола, введите 100 cfu в область ствола(рисунок 3A). Избегайте инъекций бактерий в нотохорд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Cfu для инъекции оценивается по формуле cfu и бактериальной концентрации запасов х фактор разбавления х объем капли инъекции. Фактический cfu подтверждается покрытием одной капли бактериального инокулума на агарной пластине 7H10, содержащей 10% (v/v) ОАдК, 0,5% глицерола и 50 мкг/мл гигромицина.
   4. Для инфекции среднего мозга, вводить около 500 cfu в области среднего мозга(Рисунок 3B).
   5. После микроинъекции тщательно промыть эмбрионы зебры в пресноячную яичную воду с помощью пластиковой пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гора эмбрионов в стеклянной нижней блюдо как можно скорее, чтобы покрыть наблюдение очень рано врожденной иммунной реакции клеток.

4. Live Изображение инфекции

1. Рыба монтаждля для живой визуализации
   1. Перенесите до 10 трикаин-анестезиированных эмбрионов к середине стеклянной нижней 35-мм тарелки. Откажитесь от дополнительной среды E3.
   2. Обложка блюдо с 1% низкой точки плавления агарозы и ориентировать эмбрионы зебры тщательно с помощью 10 G иглы. Инкубировать стеклянное дно блюдо на льду в течение 10 с, чтобы укрепить агарозу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для инъекции среднего мозга, эмбрионы должны быть установлены в агарозе с головой, направленной вверх(Рисунок 4A). Для внутримышечной инфекции области ствола эмбрионы должны быть установлены боково в агарозе(рисунок 4В).
   3. После того, как он полностью затвердел, накройте агарозу слоем яичной воды (плюс 1 х трикаин и ПТУ).
2. Трехцветная с высоким разрешением промежуток времени конфокальной микроскопии
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги оперируются на конфокальной микроскопии, оснащенной ультрафиолетовой линзой 63.0x 1.40.
   1. Установите температуру экологической камеры до 28,5 градусов по Цельсию. Поместите немного влажной бумаги ткани внутри камеры, чтобы обеспечить влажность и предотвратить испарение яичной воды(Дополнительная рисунок 1).
   2. Поместите 35-мм стеклянное дно блюдо с зебрафишем в экологической камере.
   3. Откройте конфокическое программное обеспечение и инициализировать сцену. Переключитесь на уф-объектив 63.0 x 1.40 oil UV и найдите зебры с помощью яркого полевого канала с контрастным дифференциальным интерференцией (DIC).
   4. Откройте лазер 405 Diode, Argon (20% мощности) и DPSS 561 нм. Настройка соответствующих параметров лазерной мощности и спектра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие настройки спектра для cerulean (возбуждение 405 нм; выбросы - 456-499 нм), eGFP (возбуждение 488 нм; выбросы - 500-550 нм), DsRed2 (возбуждение - 561 нм; выбросы - 575-645 нм).
   5. Выберите режим приобретения"XY"иустановите формат изображений на512 x 512 пикселей"(Дополнительная диаграмма 2A).
   6. Переключитесь на режим«Живых данных». Целевой позиции первого зебры и пометить "Начало" и "Конец" Повторите этот процесс для каждого из оставшихся эмбрионов. "Пауза"может быть добавлена в конце программы(Дополнительная цифра 2С).
   7. Определите цикл и цикл программы.
   8. Сохранить файл.

5. Одноклеточное ультрафиолетовое облучение, чтобы вызвать апоптоз и живое изображение

1. Маунт рыбы, как описано в шаге 4.1.
2. Изображение средней области мозга 3 дней после оплодотворения (dpf) макрофаг конкретных трансгенных Tg (mfap4-eGFP) эмбрион¹⁵
3. Выберите область, представляющий интерес для одного флуоресцентно помечены макрофаг и сканирования на скорости 400 Гц и 6% УФ лазерной мощности для 50 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость сканирования и время должны быть оптимизированы на основе индивидуального микроскопа. Время сканирования должно быть оптимизировано, чтобы вызвать обширные повреждения ДНК, которые впоследствии вызовут апоптоз клеток, но не фотоотрах всей клетки.
4. Повторите вышеуказанный шаг, чтобы облучить больше целевых ячеек.
5. Выполните промежуток времени изображения области среднего мозга, как описано в разделе 4.

6. Обработка изображений

1. Выполните "Максимальная проекция" для приобретенных изображений.
2. Найдите и пометьте положение XY и время целевых ячеек под представлением«Максимальная проекция».
3. Вернитесь к стандартному представлению, чтобы найти и отметить положение целевых ячеек.
4. Обрезать однослойное изображение целевых ячеек.
5. Экспорт накладной канал и яркое поле в виде видео в формате AVI.
6. Обрезать область интереса канала наложения и яркое поле в ImageJ.
7. Объедините два видео на последнем шаге вертикально и сохраните как одно видео формата AVI в ImageJ.

Микобактерия инфекции может вызвать различные реакции хозяина в зависимости от маршрутов инфекции. В этом протоколе, эмбрионы зебры инфицированы внутримышечной микроинъекции флуоресцентно помечены бактерии в среднем мозге или стволе(Рисунок 3) и наблюдается конфокальные живой визуализации. Инфекция через эти два маршрута будет локально ограничить инфекцию, вызывающую врожденный набор иммунных клеток и последующей смерти клеток.

Визуализация деталей врожденной иммунной смерти клетки является сложной задачей. Литические смерти клеток происходит в течение очень короткого времени и требует микроскопии высокого разрешения для наблюдения. Кроме того, высокая подвижность врожденных иммунных клеток позволяет им мигрировать из зоны наблюдения. В этом протоколе мы решаем эту проблему, параллельно наблюдая за несколькими эмбрионами. Массив эмбрионов зебры может быть установлен на одном стеклянном микроскопе слайд для инфекции, и до 10 эмбрионов могут быть установлены на том же 35 мм стеклянной нижней блюдо для живой визуализации (Рисунок 4). Воспользовавшись живой моделью данных конфокальной микроскопии, одновременно можно наблюдать более одного эмбриона. Это повышает эффективность живой визуализации и значительно увеличивает вероятность захвата всего процесса смерти литических клеток.

Врожденная иммунная система является первой линией защиты от микобактериальной инфекции, и двумя ключевыми компонентами являются макрофаг и нейтрофил. Здесь мы используем ранее сообщалось Tg (coro1a:eGFP;lyzDsRed2) и Tg (mpeg1:loxP-DsRedx-loxP-eGFP;lyz:eGFP) для различения макрофагов и нейтрофилов в vivo16,17,18. Макрофаг сильно engorged с бактериями стал круглым и отображается снижение подвижности, с возможной цитоплазматической опухолью, разрыв клеточной мембраны, и быстрое распространение цитоплазмического содержания. Эти события являются типичными морфологическими изменениями гибели литических клеток, как сообщалось ранее(Рисунок 5A)16. УФ облучение было использовано для запуска клеток пройти апоптоз в зебрафиш20,21. В соответствии с этим понятием, УФ облученные макрофаги показали типичные фенотипы апоптотической клетки, такие как усадка клеток, ядерная фрагментация и конденсация хроматина(рисунок 5B)22,23. В сочетании с использованием церулеан-флуоресцентных M. marinum19, три цветные живые изображения взаимодействия между макрофагом, нейтрофил, и М. Маринум был достигнут в vivo. Мы также отметили, что макрофаги могут активно фагоцитози и распространения M. marinum (Дополнительная рисунок 3A). Тем не менее, нейтрофилы имели ограниченные фагоцитные возможности и быстро прошли литическую гибель клеток без очевидной бактериальной engorgement(Дополнительная рисунок 3B). Нейтрофилы могут быть вызваны фагоцитозом лишь нескольких мертвых M. marinum, которые не выражают церулеан-флуоресценции, или просто фагоцитоз ограниченного мертвого мусора клетки.

Рисунок 1: Схематическая диаграмма подготовки одноклеточных бактерий. Одноклеточные церулеан-флуоресцентные запасы M. marinum были получены после описанного процесса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Диаграмма эмбриона зебры, монтажа для микроинъекции. (A) Схематическая диаграмма процесса монтажа. (B) Эмбрионы зебрафиш были установлены боковой для заражения области ствола. (C) Зебрафиш эмбрионы были установлены с их головы направлены вверх для заражения среднего мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Позиционирование для микроинъекций. (A) Красная стрелка указывает место инъекции для заражения области ствола. (B) Красная стрелка указывает место инъекции для инфекции среднего мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Монтаж эмбрионов зебры для живой визуализации. (A) Для инфекции среднего мозга, зебры эмбрионы были установлены с их головы направлены вниз. (B) Для инфекции области ствола, эмбрионы зебры были установлены боково с местом инъекции близко к нижней части стеклянного дна блюдо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Типичные морфологические изменения в инфекции M. marinum индуцированной макрофаглитической клеточной смерти и УФ индуцированных макрофаг апоптоз. (A) Промежуток времени изображения макрофага (Mac) претерпевая литической клеточной смерти, как только он сильно engorged с M. marinum. Средний мозг 3 dpf Tg (coro1a:eGFP;lyzDsRed2) зародышевой рыбы заражен церулеан-флуоресцентным M. marinum (500 cfu) с помощью микроинъекции. Предоставляются изображения как для канала наложения (верхняя панель), так и для канала DIC (нижняя панель). T 00:00 составляет 5 ч 20 мин после инфекции. Белые пунктиры линий и контур клеточной мембраны; черные пунктирные линии и отек цитоплазмы; черные стрелки и разорванная клеточная мембрана; красные линии пунктирной и быстро потеряли цитоплазмическое содержание. (B) Промежуток времени изображения УФ облученных макрофагов. Одна ячейка ГФПЗ в области среднего мозга 3 dpf Tg (mfap4:eGFP) облучается УФ-излучением и сопровождается промежуток времени. Белые пунктиры линий и контур клеточной мембраны; черные стрелы - ядерная фрагментация и хроматин конденсация. Шкала бар 15 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная рисунок 1: Экологическая камера, созданная для живой визуализации. (A) Установите цифровой контроллер, чтобы держать температуру на уровне 28.5 C. (B) Установите влажные салфетки внутри камеры, чтобы обеспечить влажность и предотвратить испарение яичной воды. (C) Закройте крышку камеры и подождите, по крайней мере 30 минут для стабилизации температуры перед началом живой визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная рисунок 2: Настройка конфокальной панели для живой визуализации. (A) Представление настройки панели приобретения. (B) Представление лазерной мощности и настроек спектра. (C) Представление нескольких заданий и настройки цикла в режиме данных в реальном времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная рисунок 3: Макрофаги распространяют инфекцию и нейтрофилы подвергаются литической смерти клеток после инфекции M. marinum. (A) Макрофаг, распространяющий M. marinum в стволе 2 dpf Tg (coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) зародыш зебры, инфицированный церулеан-флуоресцентным М. маринумом (No100 cfu). (B) Нейтрофил (Neu) переживает литические клеточной смерти без очевидного M. marinum груженый в области ствола 3 dpf Tg (mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) зебрафиш эмбриона инфицированных церулеан-флуоресцентные M. marinum (100 cfu) с помощью микроинъекции. Зеленый цвет присваивается LRLG и красный цвет присваивается eGFP для лучшей визуализации процесса смерти литических клеток. Стрелки в циане указывают на клетки-мишени. Стрелки в красном указывают на клетки, которые собираются выпустить содержимое цитоплазмы в следующем кадре. Стрелки в зеленом указывают на мертвые клетки, которые только что потеряли содержание цитоплазмы. Шкала бар 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Видео 1: Макрофаг сильно нагруженный M. marinum подвергается литической клеточной смерти, связанные с рисунком 5A. Time-lapse изображений (63x цель) для 9 мин и 18 с на 3 кадра в секунду (fps) в середине мозга области 3 dpf Tg (coro1a:eGFP;lyzDsRed2) зебрафиш эмбриона инфицированных церулеан-флуоресцентные M. маринум. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).

Видео 2: Макрофаг подвергается апоптозу после облучения УФ-излучения, связанного с рисунком 5B. Time-lapse изображений (63x цель) 74 мин на 6 кадров в секунду от области среднего мозга 3 dpf Tg (mfap4:eGFP) зебры эмбриона. Одна клетка ГФПЗ в области среднего мозга эмбрионов облучается УФ-излучением и сопровождается визуализацией промежуток времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).

Видео 3: Макрофаг распространяется M. marinum, связанные с дополнительной рисунок 3A. Time-lapse изображений (63x цель) 24 мин на 3 fps области ствола 2 dpf Tg (coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) зебрафиш эмбриона, инфицированного церулеан-флуоресцентных М. Маринум. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).

Видео 4: Нейтрофил подвергается гибели литической клетки без очевидного M. marinum engorgement, связанный с дополнительной фигурой 3B. Time-lapse изображений (63x цель) 7 мин 30 с на 3 fps области ствола 3 dpf Tg (mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) зебрафиш эмбриона, инфицированного церулеан-флуоресцентных М. Маринум. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).

Авторам нечего раскрывать.