Этот метод описывает оценку глобальных изменений в топологии цепи убиквитина. Оценка проводится с помощью подхода, основанного на масс-спектрометрии, целенаправленной протеомики.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Убиквитин Цепной Анализ параллельным мониторингом реакции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Оценка глобального профиля топологий убиквитиных цепочек в протеоме представляет интерес для ответа на широкий спектр биологических вопросов. Протокол, изложенный здесь, использует модификацию диглицина (-GG), оставленную после триптического пищеварения убиквитина, включенного в цепочку. Путем количественной оценки этих топологически-характерных пептидов можно определить относительное изобилие каждой топологии цепи убиквитина. Сообщается о шагах, необходимых для количественной оценки этих пептидов путем параллельного мониторинга реакции с учетом стабилизации убиквитиных цепей. Подготовка тяжелых элементов управления, клеточный лиз и пищеварение описаны вместе с соответствующей установкой масс-спектрометра и рабочим процессом анализа данных. Представлен пример набора данных с возмущениями в топологии убиквитина, сопровождаемый примерами того, как оптимизация протокола может повлиять на результаты. Следуя изложенным шагам, пользователь сможет провести глобальную оценку ландшафта топологии убиквитина в их биологическом контексте.
Введение
Тесная регуляции белковой функции и стабильности имеет первостепенное значение, поскольку они являются основными факторами фенотипического контроля биологии. Функция белка построена из двух компонентов: его внутренней полипептидной последовательности и любых посттрансляционных модификаций (ПТМ). Были выявлены различные химические ПТС, включая гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование и метилирование1. В 1975 году Гольдштейн и др.2 определили небольшой белок и назвали его убиквитином из-за его вездесущей природы. Убиквитин оказался важным в деградации белка3. Однако с тех пор было установл....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка тяжелого пептидного стандарта
- В зависимости от поставщика и качества закупаемых тяжелых пептидов, тяжелые пептиды необходимо будет разбавить. Этот протокол использовал пептидные последовательности, о которые сообщалось в таблице 1,с аминокислотой C-терминала, модифицированной в лизин (13C615N2-lysine) или аргинином (13C615N4-аргинин).
- Смешайте тяжелые пептиды, разбавляя смесь 50% ацетонитрилом (ACN), чтобы создать пептидную смесь с каждым пептидом при 10 МКМ.
- Создайте алициты пептидной смеси и храните при -80 градусов по Ц....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы продемонстрировать использование анализа цепи убиквитина PRM, были отобраны три клеточные линии: линия клеток мыши меланомы B16 и две общие линии клеток человека A549 (аденокарциномические альвеолярные базальные эпителиальные клетки) и HeLa (раковые клетки шейки матки). Эти культуры выросли до средней фазы в соответствующих средствах массовой информации, прежде чем лечить 0, 10, или 100 мМ МГ-132 за 4 ч до сбора урожая. MG-132 является ингибитором протеасомы, предотвращая деградацию убиквитин-спряженных белков прот.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Анализ состояния убиквитина в протеоме имеет все большее значение для широкого спектра биологических вопросов. Описание состояния убиквитина образца должно быть сосредоточено не только на профиле убиквитинированных белков, но и на топологии такого убиквитина. Оценка этой топологии целевым MS, как описано здесь, играет определенную роль в широком спектре биологических исследований.
Следует понимать, что изложенный здесь протокол содержит глобальный профиль топологии. Использование подхода проте.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствие конкурирующих интересов.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Селин Джинти за помощь в создании клеточных гранул с лечением MG-132, как описано в репрезентативных результатах, и Элизе Моммертс за ее предоставление гранул кишечной палочки, используемых в протоколе.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ацетонитрил (ACN) | Merck | 100029 | |
| бикарбонат аммония (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Хлорацетамид (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| муравьиной кислотой (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Тяжелые пептиды | JPT Peptide Technologies | ||
| ВЭЖХ | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Колонка | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Масс-спектрометр | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-этилмалеимид (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Цепь положительного контроля K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Цепь положительного контроля K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Цепь положительного контроля M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Гидроксид натрия (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Соникатор | Branson | SFX 150 | |
| Термомиксер | Eppendorf | Термомиксер Comfort | |
| кислота (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Трипсин | Promega | V1511A | |
| Мочевина | Сигма | 51456 | |
| Воды μ Элюция C18 пластины | Waters | 186002318 |
Ссылки
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90(2011).
- Goldstein, G., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
