Методическая статья

LINE-1 Метилирование Анализ в мезенхимальных стволовых клеток, обработанных остеосаркомы производные внеклеточные vesicles

DOI:

10.3791/60705

⸱

1 февраля 2020 г.

 ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Diseases, University of Helsinki, 2Helsinki University Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описано здесь использование метилирования конкретных зонд амплификации метод для анализа уровней метилирования элементов LINE-1 в мезенхимальных стволовых клеток, обработанных остеосаркомы полученных внеклеточных пузырьков. Ультрацентррифугация, популярная процедура отделения внеклеточных пузырьков от сыворотки крупного рогатого скота плода, также продемонстрирована.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метилирование-специфическое усиление зонда (MSPA) является простой и надежной техникой, которая может быть использована для обнаружения относительных различий в уровнях метилирования образцов ДНК. Это находчивый, требует небольшого количества ДНК, и занимает около 4-5 ч практической работы. В представленной технике образцы ДНК сначала денатурируются, а затем гибридизируются с зондами, нацеленными на ДНК либо на метилированные, либо на эталонные участки в качестве контроля. Гибридизированная ДНК разделена на параллельные реакции, одна из них проходит только перевязку, а другая проходит перевязку, а затем HhaI-опосредованного пищеварения в неметилированных последовательностях GCGC. Полученные фрагменты ДНК усиливаются ПЦР и разделены капиллярным электрофорезом. Метилированные участки GCGC не усваиваются HhaI и производят пиковые сигналы, в то время как неметилированные участки GCGC усваиваются и пиковые сигналы не генерируются. Сравнение контрольно-нормализованных пиков переваренных и непереваренных версий каждого образца обеспечивает соотношение дозировки метилирования образца ДНК. Здесь MSPA используется для обнаружения влияния внеклеточных пузырьков, полученных от остеосаркомы (ЭВ) на метилирование долго перемежаемого ядерного элемента-1 (LINE-1) в мезенхимальных стволовых клетках. LINE-1s являются повторяющимися элементами ДНК, которые обычно подвергаются гипометилиации при раке и, в этом качестве, может служить в качестве биомаркера. Ультрацентррифегоция также используется в качестве экономически эффективного метода для отделения внеклеточных пузырьков от биологических жидкостей (т.е. при подготовке сыворотки крупного рогатого скота, истощенной евреем, и изоляции ЭВ от остеосаркомы кондиционированных средств массовой информации (дифференцированной центрифугации). Для анализа метилирования, пользовательские зонды LINE-1 предназначены для целевых трех метиловых сайтов в последовательности промоторов LINE-1 и семи контрольных участков. Этот протокол демонстрирует использование MSPA для анализа метилирования LINE-1 и описывает подготовку EV-исчерпаны FBS ультрацентррифегации.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метилирование ДНК является одной из основных эпигенетических изменений, происходящих в клетках человека. Метилирование ДНК относится к связи метиловых групп с остатками цитозина в динуклеотидах CpG. Такие динуклеотиды обычно встречаются в кластерах (острова CpG) в 5' области генов1. В нормальных клетках большинство этих динуклеотидов существуют в неметилируемом состоянии, что позволяет транскрипцию ДНК. Кстати, многие виды рака связаны с гиперметилированными островами CpG и транскриптомическим глушителем2, особенно в генах супрессоров опухолей, которые, в свою очередь, способствуют различным признакам рака3.

С другой стороны, длинные перемежаются ядерные элементы-1 (LINE-1s или L1s) являются повторяющимися, транспозируемыми элементами ДНК, которые обычно имеют высокий уровень метилирования на островах CpG. Метилирование LINE-1 предотвращает транслокацию и помогает поддерживать целостность генома. В нескольких типах рака, LINE-1 гипометилируется, что приводит к активации и последующей ретротранспозиции опосредованной хромосомной нестабильности4. На ЛИНИю-1 приходится почти 17% генома человека5,а его метилирование может служить индикатором глобального уровня геномной метилирования6. Глобальная гипметилирование LINE-1 считается предшествуя переходу клеток к фенотипу опухоли7; поэтому, он имеет перспективу в качестве потенциального маркера для раннего начала рака.

В настоящее время существует несколько методов анализа метилирования, в том числе пиросекенекирование, метилирование конкретных ПЦР, microarrays, и хроматин иммунопрециптом1. Использование секвенирования следующего поколения также позволило включить подходы к выявлению метилирования ДНК в масштабах всего генома. Многие из этих методов опираются на бисульфит-обработанную ДНК, в которой неметилированные цитозины преобразуются в урацил, а метилированные цитозины остаются неизменными. Тем не менее, работа с бисульфит-обработанной ДНК имеет несколько подводных камней, таких как неполные преобразования неметилированных цитозинов в uracil, предвзятое усиление последовательностей, и секвенирование ошибок8.

В метилациляции конкретных усилитель зондов (MSPA), зонды, состоящие из двух олигонуклеотидов целевой ДНК последовательностей, содержащих место ограничения (GCGC) для метилирования чувствительных ограничения фермента HhaI9. После того, как зонды гибридизируются с ДНК, каждый образец делится на два набора. Зонды в первом комплекте проходят перевязку, в то время как зонды во втором наборе проходят перевязку, а затем HhaI-опосредованного пищеварения на неметилированных участках CGCG. Оба набора образцов затем усиливаются ПЦР, и продукты разделены капиллярным электрофорасом. Зонды на неметилированных участках перевариваются HhaI и не усиливаются во время ПЦР, в результате чего нет пиковых сигналов. В отличие от этого, зонды на метилированных участках защищены от пищеварения и поэтому усиливаются во время ПЦР, впоследствии генерируя пиковые сигналы10.

MSPA имеет ряд преимуществ перед альтернативными методами. Во-первых, он требует низкого количества ДНК (50-100 нг) и хорошо подходит для анализа ДНК из формированного фиксированного парафина встроенных образцов10. Он не требует бисульфит-обработанной ДНК; на самом деле, это не подходит для ДНК, которая модифицируется таким образом. Многие образцы могут быть проанализированы в то же время, и MSPA зонды могут быть разработаны таким образом, что они нацелены на несколько генов или последовательностей одновременно. Кроме того, зонды являются специфическими и чувствительными для метилированных ДНК, как HhaI ограничение сайт соответствует последовательности, которая характерна для островов CpG10.

Это исследование исследовало влияние остеосаркомы (ОС) полученных внеклеточных пузырьков (EVs) на LINE-1 метилирования в жировой ткани полученных мезенхимальных стволовых клеток (AT-MSCs; Рисунок 1). EVs являются наноразмерными, мембранными пузырьками, выделяемыми большинством типов клеток. Они несут белки, липиды, мРНК, микроРНК, и дополнительные молекулы из родительских клеток11,12. EVs посредничает межклеточной связи и играют важную роль в нескольких патофизиологических условиях13,14. Недавнее исследование показало, что полученные раком EVs могут передавать активную ЛИНИЮ-1 клеткам-реципиентам15. Ранее сообщалось, что ЭВ из клеточной линии HOS-143B могут изменить метилирование статусLINE-1 в МСК, в дополнение к другим генетическим эффектам16.

При выращивании клеток для изоляции EV, важно использовать EV-обеденной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) в среде роста, так как FBS полученных EVs может мешать EVs из других источников и препятствовать результатам17,18. Ультрацентрифугация является одним из наиболее распространенных методов для истощения EVs от FBS. Это относительно простая и экономичная процедура по сравнению с альтернативами, такими как ультрафильтрация и коммерческий EV-обеденный FBS19. Здесь протокол также демонстрирует, как подготовить EV-исчерпаны FBS ультрацентрифугации.

В этой статье представлен подробный протокол для вышеупомянутых методов, от изоляции ЭВ от линии ячейки ОС до анализа метилирования LINE-1 в ОС-EV обработанных MSCs (Рисунок 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данное исследование было одобрено Комитетом по этике Хельсинки и больницы Уусимаа (этическое утверждение Д. No 217/13/03/02/2015).

1. Подготовка EV-исчерпаны FBS путем ультрацентрифугации

  1. Возьмите FBS в (ультра)центрифуговых труби и поместите их в ультрацентрифуге ведра. Чтобы ультрацентрифугация прошла гладко и безопасно, сбалансировать ведра в пределах 10 мг друг от друга.
  2. Загрузите ведра на размахивающий ротор (тип SW28, k-фактор 246). Поместите ротор в ультрацентрифуге и запустить на 100000 х г для 19 ч при 4 c.
  3. Тщательно соберите светлый верхний слой супернатанта (примерно девять десятых) и перенесите на трубку 50 мл. Не беспокоить или pipette темно-коричневый гранулы, так как он содержит EVs от FBS.
  4. Передайте супернатант через фильтр 0,22 мкм в новую трубку 50 мл.
  5. Добавьте фильтр-стерилизованный, EV-исчерпанный FBS к средствам культуры клетки когда расти клетки для изоляции EV.

2. Изоляция эвакуисов, полученных от остеосаркомы

  1. Клетки плиты OS (линия клетки HOS-143B) в колбе T-175 с rpMI 1640 средним, дополненными с 10% нормальными FBS и 1% антибиотиками (100 U/mL пенициллин, 0.1 мг/мЛ стрептомицин). Поместите колбу в инкубатор при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2.
  2. Когда колба 70%-80% confluent, мыть клетки с фосфат-буфером солей (PBS) затем расти их в средствах, содержащих 10% EV-обеденных FBS (далее называют EV-обед).
    ПРИМЕЧАНИЕ: 1 х 106 HOS-143B клеток, покрытых в колбе T175 достигает 70% выпуклости примерно после 60 ч.
  3. В течение следующих 48 ч, собирать условные средства массовой информации из клеток остеосаркомы после каждого 24 ч и добавить свежие EV истощенных средств массовой информации.
  4. Центрифуги кондиционированных носителей на 2500 х г в течение 20 минут при 4 кв КК, чтобы удалить клетки и мусор ауда. Перенесите супернатант на новую трубку, оставив около 2 мл носителей внизу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если непосредственно не приступить к изоляции EV на данном этапе, супернатант может храниться при -80 oC.
  5. Налейте супернатант в ультрацентрифуговых труб и сбалансировать их, как раньше. Центрифуга труб на 100000 х г на 2 ч при 4 градусах Цельсия.
  6. Тщательно отбросьте супернатант, оставляя около 1 мл на дне. Добавить около 20 мл PBS (0,1 мкм фильтруется) в трубку и пипетку осторожно мыть и resuspend эВ гранулы.
  7. Баланс труб и выполнить еще один раунд ультрацентрифугации с теми же настройками.
  8. Тщательно удалите супернатант и resuspend эВ гранулы в 200 Зл Л PBS путем нежного пипетки. Храните EVs в низкой связывающей трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: EVs можно использовать сразу или же хранить в -80 градусов по Цельсию, пока они не необходимы.

3. Характеристика ОС-EVs

ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные ЭВ могут быть охарактеризованы западной blotting (WB), анализ наночастиц отслеживания (NTA), и передачи электронной микроскопии (TEM)16.

  1. Выполните WB в соответствии со стандартным протоколом16 с EV маркерами CD63, TSG101 и Hsp70, а также с calnexin в качестве отрицательного контроля, чтобы указать на чистоту образца EV20.
  2. Для NTA сначала разбавить образец EV в 0,1 мкм фильтруется PBS Dulbecco для получения (в идеале) 30-100 частиц на кадр.
    1. Возьмите около 500 л образца в шприц объемом 1 мл и загрузите его в вхдыхательный порт прибора NTA. Убедитесь, что на кадр достаточно частиц для точных измерений.
    2. Откройте программное обеспечение NTA и запишите пять видео продолжительностью 60 с, используя камеру уровня 13 при температуре окружающей среды. Во время анализа используйте порог обнаружения No 5 и получите 10.
  3. Проанализируйте образцы EV tEM, как описано ранее21.

4. Культура AT-MSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Человеческая жировая ткань для мезенхимальной изоляции стволовых клеток была предоставлена в качестве аспирата липосакции (Департамент пластической хирургии, Laser Tilkka Ltd., Финляндия). Письменное информированное согласие было взято у доноров липоаспиратера, которые проходили процедуры выборной липосакции.

  1. Изолировать AT-MSCs от липосакции аспиров с использованием стандартных методов механической и ферментативной изоляции22.
    ПРИМЕЧАНИЕ: MSCs из других источников (в том числе коммерческих линий ячейки) также могут быть использованы.
  2. Культурные клетки в средствах массовой информации DMEM/F-12 дополнены 10% FBS и 1% антибиотиками.

5. Лечение МСК с ПОМОЩЬю ОС-ЭВ

  1. Плита 15000 AT-MSCs в скважине в 24 хорошо пластины.
  2. После 24 ч, удалить старые средства массовой информации, мыть клетки с PBS, и перейти на EV-исчерпаны средств массовой информации.
  3. Лечить клетки с OS-EVs (при концентрации частиц 1 х 106 EVs на ячейку) на день 1 (24 ч после сливк клетки), День 3 (48 ч после дня 1), и день 5 (96 ч после дня 1).
    1. Остановить OS-EV лечения для timepoint (TP) 0 образцов на день 1, TP 3 образцов на 3 день и TP 7 образцов на 7 день (48 ч после дня 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие графики тайм-пойнтов в рамках экспериментальных планов также могут быть соблюдены.
  4. Извлеките ДНК из МСК с помощью соответствующего метода. Включите положительные и отрицательные контрольные образцы для анализа данных.

6. Line-1 метилирование

  1. Дизайн индивидуальных LINE-1 зонд грунтовки, как это было сделано ранее Pavicic и др.23. Для метилационных зондов выберите три последовательности, содержащие место ограничения HhaI в области промотора LINE-1. Для контрольных зондов выберите семь последовательностей, не хватает места ограничения HhaI от остальной части последовательности LINE-1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность LINE-1 доступна в базе данных GenBank24 (L1.2, присоединение нет. AH005269.2). Используйте инструкции производителя MSPA для проектирования зондов25.
  2. Разбавить 70 нг образца ДНК в буфере TE до объема 5 л.
  3. Провести последующие шаги термоциклии и ПЦР, как уже упоминалось в таблице 1. Нагрейте образцы в течение 10 мин при температуре 98 градусов по Цельсию, затем охладите до 25 градусов по Цельсию.
  4. Добавьте 3 зЛ смеси гибридизации зонда к каждому образцу и запустите термоциклер, чтобы позволить зондам гибридизироваться с ДНК.
  5. При комнатной температуре (RT) добавьте в каждый образец 13 юл постгибридизации смеси. Перенесите 10 зл., на вторую трубку.
  6. Поместите оба комплекта труб в термоцикле и инкубировать при 48 градусах По Цельсию в течение по крайней мере 1 мин.
    1. В то время как образцы находятся на уровне 48 градусов по Цельсию, добавьте 10 qL перевязочной смеси к первому набору трубок (непереваренный ряд) и 10 зл. переваривания перевязки к второму набору трубок (переваренной серии). Запустите следующую программу термоциклора.
  7. Спин вниз трубки и одновременно установить термоциклдора до 72 градусов по Цельсию.
  8. Добавьте 5 кл. из смеси полимеразы к каждой трубке и поместите трубки в термоциклер. Выполнить программу PCR.
  9. Во время выполнения программы ПЦР подготовьте решение формамида размером 1 мл, содержащее 2,5 л стандарта размера. Пипетка 10 л этого раствора для каждой скважины из оптической пластины 96 скважины (со штрих-кодом).
  10. После ПЦР разбавить непереваренные и переваренные образцы до 1:100 и 1:200 соответственно в ультрачистой воде. Добавьте 2 злиц разбавленного пЦР-продукта в 96 хорошо пластины. Центрифуге пластины на 200 х г для 15-20 с, чтобы удалить пузырьки воздуха.
  11. Провести фрагментный анализ образцов с помощью капиллярного электрофорасиса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина должна храниться при 4 градусах Цельсия в темноте до анализа.

7. Анализ фрагментных данных

  1. Открытие капиллярного электрофореза приводит к разработке программного обеспечения для анализа электроферограммы.
    1. В колонке Panel для одного из примеров выберите MLPA из меню. Нажмите на заголовок панели и нажмите Ctrl'D, чтобы применить MLPA ко всем образцам.
    2. Таким же образом, установить метод анализа на Microsatellite по умолчанию для всех образцов.
    3. Выберите все образцы и нажмите на кнопку воспроизведения Green, чтобы проанализировать образцы в выбранных настройках.
    4. Выберите все образцы и нажмите на кнопку График, чтобы визуализировать пики зонда.
    5. Увеличьте пиковую область для более высокого разрешения отдельных пиков зонда. Убедитесь, что все 10 пиков, соответствующих зондам из зонд-микса LINE-1, помечены. Откажитесь от дополнительных пиков (злт;95 б/с и йgt;160 bp).
    6. Во вкладке Genotypes экспортировать результаты в формате запятой разделенных значений (CSV).
  2. Откройте файл CSV в программном обеспечении для анализа данных и сортируйте данные в столбцы.
    1. Этикетка три метилирования сайт пики на основе их приблизительные размеры (L1-1m на 153 bp, L1-2m на 119 bp, L1-3m на 133 bp). Остальные семь пиков соответствуют контрольные зонды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используются значения пиков зонда L1-2m, которые имеют размер 117 bp, так как этот регион был использован в большинстве анализов метилирования LINE-123.
    2. Для каждого образца (непереваренного и переваренного) вычислите пиковую площадь суммы всех семи контрольных пиков. Разделите пиковую область каждого зонда LINE-1 на эту сумму.
    3. Для каждого образца ДНК, разделить значение переваренных образцов на непереваренный образец, чтобы получить коэффициент дозировки метилирования (DM) с помощью следующего уравнения:
      figure-protocol-1
      Где: DM является коэффициентом дозировки метилирования, Ax — это область под пиком x (например, пик L1-2m), аctrl — это пиковая область суммы всех семи контрольных зондов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основной целью данного исследования была оценка эпигенетического воздействия ОС-ЭВ на MSCs. OS-EVs были выделены из клеток HOS-143B с использованием стандартного метода центрифугации дифференциального дифференциала. Выражение типичных маркеров EV CD63, Hsp70 и TSG101 западным и западным блоттингом подтвердило наличие ОС-EVs. (Рисунок 2А). Отсутствие сигнала калнексина указывает на чистоту изолировать OS-EV. Дополнительные признаки чистоты наблюдался с TEM, с нетронутыми пузы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование иллюстрирует, как MSPA может быть использован для обнаружения и количественного состояния метилирования конкретного генетического элемента. LINE-1 был в центре внимания здесь, но зонды могут быть разработаны для целевой диапазон генов и последовательностей. Кроме того, существует растущий список смесей зонда, доступных для различных приложений. MSPA является простой и надежный метод для анализа метилирования ДНК,который не требует преобразования бисульфит10 . Полная процедура от п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была профинансирована финансированием проекта Хельсинкского университета (WBS490302, WBS73714112) Хельсинкский университет больницы государственного финансирования университетских исследований в области здравоохранения (Y1014SUL05, TYH2016130), Финско-норвежского медицинского фонда, и Сельма и Фонд Майя-Лиза Селандер (Фонд Минерва). Мы благодарим Вальтера Павича за предоставление измененного протокола MSPA и за соответствующую техническую поддержку. Мы благодарны Теему Масалину (Хельсинкский университет) за помощь в видеопроизводстве.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприц 1 млTerumoSS+01T1для NTA
24-луночный планшетCorning3524MSC Клеточная культура
3730XL Анализатор ДНКApplied Biosystems, ThermoFisher Scientific3730XL
50 мл центрифугаCorning430829
Beckman Optima LE-80K УльтрацентрифугаBeckman
BlueStar Prestained Protein MarkerNippon GeneticsMWP03WB: белковый маркер
Calnexin (клон C5C9)Технология клеточной сигнализации2679WB, разведение 1:800
CD63 (клон H5C6)BD Biosciences556019WB, разведение 1:1000
Centrifuge 5702 REppendorf5703000010Для кондиционированных сред и клеток
Centrifuge 5810Eppendorf581000001096 лунок
Центрифуга пробирка (полиалломер, 14x95 мм)Beckman331374Ультрацентрифугирование
DMEM/F-12 + GlutaMAX mediumGibco, Life Technologies31331-028Для культуры AT-MSC
Фетальная бычья сывороткаGibco, Life Technologies10270-106
GeneScan 500 LIZ размер стандартныйПрименяется Biosystems, Life Technologies4322682для капиллярного электрофореза
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA)Kit SigmaWGA2-10RXNдля MSPA негативный контроль
Hi-Di formamideApplied Biosystems, Life Technologies4311320для капиллярного электрофореза
HOS-143B клеточная линияATCCCRL-8303
Hsp70 (клон 5G10)BD Biosciences554243WB, разведение 1:1000
IRDye 800CW Goat Anti-mouseLi-Cor926-32210WB: вторичный
IRDye 800CW Goat antirabbitLi-Cor926-32211WB: вторичный
LINE-1 зонд-микс праймерыIDTПоследовательности в таблице 1
MicroAmp Optical 96-well реакционная пластина со штрих-кодомApplied Biosystems, Life Technologies4306737также требуется герметизирующая пленка
Micro BCA Protein Assay kitThermoFisher Scientific23235измерять концентрацию белка
MiniProtean TGX 10% гелиBio-Rad456-1034WB: гель электрофорез
NanoSight LM14CMalvern Instrumentsдля NTA
Нитроцеллюлозная мембрана 0,2 &; mBio-Rad1620112WB: перенос белка
NucleoSpin Tissue XSMacherey-Nagel740901.50для экстракции ДНК
Odyssey Blocking BufferLi-Cor927-40000WB: блокирование, антитела
PBS, 1XCorning21-040-CVR
Пенициллин-стрептомицинGibco, Life TechnologiesDE17-602EАнтибиотики для питательная среда
Protein LoBind tube, 0,5 млEppendorf22431064Для хранения Evs
REVERT Total Protein Stain and Wash Solution KitLi-Cor926-11015WB: общее окрашивание белка
RKO клеточной линииATCCCRL-2577для MSPA положительный контроль
среда RPMI 1640 + GlutaMAXGibco, Life Technologies61870-010Для культуры клеток HOS-143B
Фермент SALSA MLPA HhaIMRC-HollandSMR50
Набор реагентов SALSA MLPAMRC-HollandEK1-FAM
SALSA MLPA P300 зонд-миксMRC-HollandP300-100R
Качающийся ротор SW-28Beckman Coulter342207Ультрацентрифугирование
Шприц фильтр, 0,22 &; mJet BiofilFPE-204-030стерильная фильтрация FBS
Tecnai 12компании FEIоснащена Gatan Orius SC
1000B CCD-камерой
(Gatan Inc., США); для TEM
TBS, 1X таблеткиMedicago09-7500-100WB: буфер
Trans-Blot TurboBio-RadWB: трансфер
ТермоциклерThermoFisher Scientific
TrypLE ExpressGibco12604-021для трипсинизации клеток
TSG101 (клон 4A10)SigmaSAB2702167WB, разведение 1:500
Для центрифуги на TCA0096

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
  2. Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).
  3. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  4. Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. Oncogene. 27, 404-408 (2008).
  5. Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001).
  6. Rodriguez, J., et al. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Cancer Research. 66, 8462(2006).
  7. Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).
  8. Bock, C., et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).
  9. Schouten, J. P., et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 30, 57(2013).
  10. Nygren, A. O. H., et al. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research. 33 (14), 128(2005).
  11. El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).
  12. Vallabhaneni, K. C., et al. Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites. Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).
  13. Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).
  14. Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris". Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).
  15. Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214(2019).
  16. Mannerström, B., et al. Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).
  17. Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783(2014).
  18. Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific Reports. 6, 31175(2016).
  19. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674(2018).
  20. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).
  21. Puhka, M., et al. Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes. Theranostics. 7 (16), 3824(2017).
  22. Peltoniemi, H. H., et al. Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).
  23. Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).
  24. L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2). , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269 (2000).
  25. Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland. , Available from: https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes (2018).
  26. Takara Bio Inc. , Available from: https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview (2018).
  27. Pisanic, R., et al. Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions. The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MSPAFBS

Похожие статьи